适配器蛋白ZIP结合Grb14并通过招募蛋白激酶Cζ调节其对胰岛素信号的抑制作用

酵母双杂交筛。

在酿酒酵母L40菌株一方面使用pFBL23-Grb14，编码Grb14的C末端结构域（氨基酸346至538），与LexA结合结构域N末端融合，另一方面使用来自大鼠肝脏的寡核苷酸引物cDNA文库，与pGAD3S2X质粒中的Gal4激活结构域融合克隆，如前所述(28). 产生His酵母菌落库的质粒⁺LacZ公司⁺分离表型，并使用pLex-lamin作为阴性对照，测试其产物与Grb14的相关性的特异性。对这些阳性质粒的cDNA插入进行测序。

5′RACE和cDNA克隆。

通过双杂交筛选获得pGAD-3′ZIP片段，包含大鼠ZIP的104～440个氨基酸。为了克隆ZIP cDNA的5′端，利用Advantage cDNA PCR试剂盒（Clontech），在大鼠肝脏Marathon Ready预制cDNA文库（Clonteh）上使用5′快速扩增cDNA末端（5′RACE）技术。我们根据大鼠ZIP的已发表序列（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“Y08355”，“term_id”：“1938243”，“term_text”：“Y08355“}}Y08355型)以及在克隆插入物中设计的反义引物。我们获得了一个940-bp的片段，对应于cDNA的5′端。通过TA克隆将该片段亚克隆到pTAdv载体（Clontech）中。安生态RI公司/巴姆然后从pTAdv-5′ZIP质粒中切下HI片段（750bp长），并连接到pGAD-3′ZIP上生态RI和巴姆HI，生成pGAD-ZIP（全长）。

质粒结构。

利用引物从pGAD-ZIP质粒中扩增出ZIPα、ZIPβ、ZIPΔAID+ZZ（Δ1-163）、ZIP△AID（Δ1-103）、ZIPZZ（104-163）、ZIPAID+Z（1-163）生态RI站点位于5′端Xho公司I定位于3′端，然后在pGEX4T2载体（Amersham Pharmacia Biotech）的框架中克隆以产生GST-ZIP融合蛋白。在pcDNA6/V5-HisC（Invitrogen）中也克隆了ZIPα和ZIPβ，用于表达V5表位标记版本。所有结构均通过DNA序列分析进行验证。pECE-myc-Grb14、pGEX-Grb7、pGEX-Grb10和所有pGEX-Grb14构建体已在前面进行了描述(2,28).

细胞培养和裂解物的制备。

在添加1 mM谷氨酰胺、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100μg/ml）和10%胎牛血清的火腿F-12培养基中，在G418（75μg/ml，CHO-IR）存在下，添加潮霉素（100μg/ml）（CHO-IR-Grb14），培养中国仓鼠卵巢细胞，稳定地过度表达IR（CHO-IR(28). COS细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中生长，补充有1 mM谷氨酰胺、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100μg/ml）和10%胎牛血清。按照制造商的建议，使用Lipofectamine（Invitrogen）瞬时转染融合细胞。细胞被血清饥饿24小时，并用胰岛素刺激或不刺激（10⁻⁷M） 在37°C下保持10分钟。然后在4°C下将其溶解在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH7.5]、150 mM NaCl、5 mM EDTA、30 mM焦磷酸钠、50 mM NaF、1%Triton X-100、胃蛋白酶抑制素[1μg/ml]、亮氨酸肽[2μg/ml]、抑肽酶[5μg/ml]1 mM苯甲基磺酰基氟化物、1 mM原钒酸钠）中，并在4°C下轻轻旋转30分钟。然后用15000×克在4°C下离心15分钟。

GST融合蛋白的产生。

纯化的GST融合蛋白如前所述产生(29). 在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析后，通过考马斯蓝染色定量融合蛋白。用于体外磷酸化实验和非洲爪蟾卵母细胞微注射后，用50 mM Tris-HCl（pH 8）从谷胱甘肽-脑葡萄糖珠中洗脱融合蛋白，其中含有10 mM还原型谷胱甘苷，并如上所述进行定量。

体外相互作用分析。

细胞裂解物（250μg）与3μg固定化GST融合蛋白在4°C下培养过夜。对于与PKCζ的体外相互作用，在4°C下，在500μl裂解缓冲液中培养2.5 ng人重组PKCξ1小时，其中含有1.5μg固定化GST融合蛋白。在大量洗涤后，结合蛋白在SDS样品缓冲液中加热洗脱，用SDS-PAGE分离，并转移到硝化纤维素中。我们通过硝化纤维素膜的Ponceau红染色验证了使用了等量的GST融合物。然后用所示抗体对膜进行免疫检测。使用ECL检测试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）显示免疫反应带。

免疫沉淀和蛋白质印迹分析。

在共免疫沉淀实验中，用所示表达质粒瞬时转染细胞。从转染后48小时开始，细胞被血清饥饿24小时，并用胰岛素刺激或不刺激（10⁻⁷M） 在37°C下保持10分钟。如上所述制备细胞裂解物。在预筛选步骤后，将500μg细胞裂解物与所示抗体在100μl蛋白a-琼脂糖存在下在4°C下孵育过夜。将免疫沉淀物在裂解缓冲液中洗涤三次，进行SDS-PAGE，并用所示抗体进行免疫检测。免疫反应带如上文所述。

对于大鼠体内研究，在裂解缓冲液中提取肝蛋白，然后在4°C下轻轻旋转溶解裂解产物90分钟，并用15000×克在4°C下离心15分钟。蛋白质浓度使用双钦酸蛋白质测定法（Pierce）测定。如上所述进行免疫沉淀。

PKCζ体外磷酸化Grb14。

PKCζ激酶分析基本上按照制造商（Upstate Biotechnology Inc.）的建议进行。在室温下，将人重组PKCζ（50 ng）与所示量的洗脱GST融合蛋白在分析稀释缓冲液II（20 mM MOPS[PH7.2]、25 mMβ-甘油磷酸、1 mM原钒酸钠、1 mM-二硫苏糖醇、1 mM/氯化钙）中预孵育10分钟。激酶反应（最终反应混合物体积，60μl）通过加入5μg磷脂酰丝氨酸，7.5mM MgCl引发₂、50μM ATP和5μCi的[γ-³²P] ATP。在30°C下培养30分钟后，通过添加Laemmli样品缓冲液停止反应，并将样品煮沸5分钟。然后对样品进行SDS-10%PAGE，并通过放射自显影术检测磷酸化蛋白对应的条带。用于GST-PIR-SH2的体外IR酪氨酸激酶测定，以及用于磷酸化GST-PIR的微量注射非洲爪蟾如上文所述，将2μg GST融合蛋白卵母细胞与50 ng PKCζ孵育。通过测定稀释缓冲液II稀释获得不同数量的GST融合蛋白。

代谢标记。

如图所示，用myc-Grb14、HA-PKCζ和pcDNA6（空载体）瞬时转染融合CHO-IR细胞。从转染后24 h开始，细胞被血清饥饿16 h。细胞在含有100μCi/ml[³²P] 正磷酸盐（Amersham Pharmacia Biotech），然后用胰岛素刺激或不刺激（10⁻⁷M） 在37°C下保持10分钟。如有必要，在胰岛素刺激前30分钟添加20μM PKCζ假底物抑制剂。细胞在pH 7.4的KRBH缓冲液中清洗两次（107 mM NaCl，5 mM KCl，3 mM CaCl₂，1 mM硫酸镁₄、20 mM HEPES、10 mM葡萄糖、1%牛血清白蛋白、7 mM NaHCO_三)刮到裂解缓冲液中。用15000×克在4°C下离心15分钟。上清液部分用抗Grb14多克隆抗体进行免疫沉淀。免疫复合物用裂解缓冲液洗涤三次，在Laemmli样品缓冲液中煮沸，用SDS-10%PAGE分离，并转移到硝化纤维素中。用荧光成像仪（分子动力学）检测磷酸化Grb14并进行定量（ImageQuant）。然后使用抗myc抗体对硝化纤维素膜进行免疫检测。

体外IR酪氨酸激酶活性测定。

通过小麦胚芽凝集素（WGA）亲和层析部分纯化IR，基本上如前所述(2). 在室温下，在有或无100 nM胰岛素的情况下，在30 mM HEPES缓冲液（pH 7.6）中，将WGA纯化受体培养1 h，并补充30 mM NaCl、0.1%Triton X-100和0.03%牛血清白蛋白。通过添加磷酸化缓冲液（8 mM MgCl）启动受体的自磷酸化₂，4 mM氯化锰₂、20μM ATP和5μCi的[γ-³²P] 每个样品ATP）在室温下，在存在不同量的Grb14的GST-PIR-SH2的情况下，持续30分钟，先前是否被PKCζ磷酸化。使用15μg合成底物聚谷氨酸-酪氨酸（4:1）进行酪氨酸激酶分析。30分钟后，通过在Whatman ET31滤纸正方形（2×2 cm）上点取混合物，停止反应，如前所述进行处理(2). 结果表示为在没有添加融合蛋白的情况下测得的最大胰岛素刺激激酶活性的百分比。

ZIP与Grb14和PKCζ形成异多聚体复合物。

酵母中观察到的Grb14-ZIP相互作用首次通过GST下拉试验在体外得到证实。固定化GST-ZIPα和GST-ZIPβ与CHO-IR-Grb14细胞裂解物孵育，并在抗Grb14免疫印迹上分析残留蛋白。如图所示。​图2A，2安培，Grb14同样被GST-ZIPα和GST-ZIPβ保留。仅GST不与Grb14绑定。根据观察，PIR和SH2结构域在Grb7家族成员之间是保守的(8,28)，我们比较了它们各自与ZIPα的结合能力。将融合到GST的每个Grb7家族蛋白的一系列构建物固定在谷胱甘肽-Sepharose上，并用于从瞬时转染COS细胞的裂解液中去除ZIPα。如图所示。​图2B，2B型，Grb10和Grb14绑定到ZIPα，而未检测到与Grb7的交互作用。

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图2。

Grb14与ZIP的体外相互作用。（A） 将表达为GST融合蛋白或GST对照的ZIP亚型固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，并与CHO-IR-Grb14细胞的裂解物孵育。结合蛋白用抗Grb14多克隆抗体进行免疫检测。（B） 表达为固定化GST融合蛋白的Grb7家族成员与瞬时转染V5标记的ZIPα的COS细胞裂解物孵育。结合蛋白用抗V5单克隆抗体免疫检测。这些斑点代表了3个不同的实验。

为了验证Grb14和ZIP之间的相互作用也发生在完整的哺乳动物细胞中，CHO-IR细胞瞬时转染myc-Grb14与V5-ZIPα。转染后48小时，用胰岛素或不用胰岛素刺激细胞，用抗Grb14多克隆抗体免疫沉淀细胞裂解物。用抗V5抗体分析抗Grb14免疫沉淀物。如图所示。​图3A3A级（上斑点，第4和第5道），V5-ZIPα在基础条件下以及胰岛素刺激后与myc-Grb14共沉淀。使用V5-ZIPβ表达质粒时获得了类似的结果（数据未显示）。

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图3。

ZIP与Grb14和PKCζ在体内形成三元络合物。（A） 如1μg pECE myc-Grb14、pcDNA6 V5-ZIPα或pcDNA3 HA-PKCζ所示，瞬时转染CHO-IR细胞。使用pcDNA6空质粒将总DNA量归一化为3μg。转染后48小时，用10⁻⁷M胰岛素。用多克隆抗Grb14抗体免疫沉淀细胞提取物。同时使用兔免疫前血清进行对照免疫沉淀（PI）。用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，并用单克隆抗HA、抗V5或抗myc抗体进行免疫印迹。用SDS-PAGE分离同一细胞的裂解液，并用相同的抗体进行免疫印迹，以确认蛋白质的同等表达水平。（B） Grb14在体外不与PKCζ相互作用。以GST融合蛋白形式表达的ZIPα和Grb14与人重组PKCζ一起孵育。使用抗PKCζ抗体通过Western blotting检测结合的PKCξ。（C） 用多克隆抗Grb14抗体免疫沉淀瞬时转染myc-Grb14的COS细胞的裂解液。同时使用兔免疫前血清进行对照免疫沉淀。用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，并用单克隆抗ZIP抗体、抗myc抗体或多克隆抗PKCζ抗体进行免疫印迹。平行分析相同细胞的裂解液。（D） 用与蛋白A琼脂糖交联的多克隆抗Grb14抗体免疫沉淀大鼠肝脏提取物。同时使用兔免疫前血清进行对照免疫沉淀。使用多克隆抗ZIP和抗PKCζ抗体通过顺序免疫检测分析免疫沉淀物。在该图中，印迹代表了两个或三个独立实验，并且在与实验样品相同的凝胶上分析了裂解物和免疫前对照物。

先前的研究表明，ZIP与PKCζ相互作用，并作为PKCζ）和其他蛋白质（如RIP）之间的链接(62)或Kvβ2(18)，在三元配合物中。因此，我们接下来研究了ZIP是否能同时与Grb14和PKCζ相互作用。用myc-Grb14、V5-ZIPα和HA-PKCζ转染CHO-IR细胞，用抗Grb14抗体免疫沉淀细胞提取物。然后用抗V5或抗HA抗体分析免疫沉淀物。图的结果。​图3A3A级（通道6和7）表明V5-ZIPα和HA-PKCζ在基础状态以及胰岛素刺激后与myc-Grb14共沉淀。为了进一步证明ZIP是连接PKCζ和Grb14的纽带，仅用myc-Grb14和HA-PKCζ转染CHO-IR细胞。有趣的是，HA-PKCζ与myc-Grb14抗体免疫沉淀。然而，PKCζ免疫沉淀的数量低于共表达V5-ZIPα的情况（中间斑点[将通道8和9与通道6和7进行比较]）。由于ZIP在CHO细胞中表达（数据未显示），内源性ZIP可能介导Grb14和PKCζ之间的相互作用。为了验证这一假设，我们测试了PKCζ和Grb14之间的直接体外相互作用。将固定化GST-ZIPα和GST-Grb14与重组PKCζ孵育，并在抗PKCζ免疫印迹上分析保留的蛋白质。如图所示。​图3B，3B公司如预期的那样，PKCζ被GST-ZIPα保留，但它不与GST-Grb14或GST单独相互作用。总之，这些结果表明ZIP在Grb14和PKCζ之间形成了一座桥梁。

接下来，我们试图证实这些相互作用也发生在更多生理条件下。由于Grb14没有在各种细胞系中表达，如CHO或COS细胞（数据未显示），我们研究了内源性ZIP和PKCζ能否与外源性表达的Grb14形成复合物。用myc-Grb14瞬时转染COS细胞。在这些条件下，Grb14蛋白的表达水平约为大鼠肝脏的四倍（数据未显示）。用抗Grb14抗体免疫沉淀细胞提取物，用单克隆抗ZIP或多克隆抗PKCζ抗体分析免疫沉淀。如图所示。​图3C，3C公司内源性ZIP和PKCζ与myc-Grb14共沉淀，而未检测到与非特异性兔免疫球蛋白G的相互作用。

Grb14在胰岛素敏感组织中特异表达(28). 然后，我们使用大鼠肝脏提取物进一步证明了在胰岛素的生理靶标中，异源三聚体复合物在体内的形成。与转染细胞系获得的数据一致，我们能够在使用抗Grb14抗体的共免疫沉淀实验中检测到内源性Grb14、ZIP和PKCζ之间的三元复合物（图。​（图3D）。三维). 这一结果表明，异三聚体复合物的构成可能与生理相关。

Grb14-ZIP关联所涉及区域的映射。

为了确定与Grb14交互所需的ZIP区域，一系列与GST融合的ZIP结构（图。​（图1B）1B年)用于从CHO-IR-Grb14细胞的裂解液中提取Grb14。如图所示。​图4A，4A级，删除包含AID和ZZ域的ZIP的N末端，抑制Grb14相互作用（通道1、2和6）。ZIP的互补结构氨基酸1至163保留Grb14，但低于野生型（WT）ZIP（比较通道2和3）。这表明ZZ结构域的C末端存在以下结构域是蛋白质正确折叠所必需的，因此也是完全结合活性所必需的。ΔAID构建物包含蛋白质的ZZ结构域和C末端，结合Grb14，但亲和力低于WT-ZIP（比较通道2和5）。这种结合减少可以用AID结构域ZIP氨基酸1至103在Grb14结合中的作用来解释。然而，这是不可能的，因为（i）AID-ZZ和ZZ域（车道3和车道4）保留了类似数量的Grb14；（ii）在双杂交筛选中分离的克隆不包含AID结构域（图。​（图1B），1B年)表明ZIP-Grb14在酵母中的相互作用是可有可无的；和（iii）在哺乳动物细胞中进行的抗Grb14免疫沉淀实验中保留了类似数量的WT-ZIP和ZIPΔAID（数据未显示）。因此，更可能的是，在ZIPΔAID结构的N末端存在GST改变了蛋白质折叠并部分掩盖了ZZ相互作用域。虽然我们不能从这些实验中排除ZIP的其他结构域参与与Grb14相互作用的可能性，但这些结果支持ZZ结构域（氨基酸104到163）在Grb14结合中的作用。

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图4。

Grb14-ZIP交互中涉及的域映射。（A） 将表达为GST融合蛋白的ZIPα和各种ZIP构建物与CHO-IR-Grb14细胞的裂解物孵育。结合蛋白用抗Grb14抗体进行免疫检测。（B） 将表达为GST融合蛋白的各种Grb14构建物与瞬时转染V5-ZIPα的COS细胞裂解物孵育。使用抗V5抗体对结合蛋白进行免疫检测。转移后蛋白质的Ponceau红染色证实装载了等量的GST融合物。这些斑点代表了三个不同的实验。

通过同样的方法，使用一系列与GST融合的Grb14缺失结构，我们研究了Grb14的不同域在其与ZIP结合中的作用。图​图4B4B类清楚地表明，仅PIR域检测到最强的结合。相比之下，SH2域无法绑定到ZIPα。PIR-SH2域和全长Grb14绑定到ZIP的程度低于PIR单独绑定的程度。这种降低的结合可能表明，其他域的存在会修改PIR的构象，并降低其与ZIP的结合亲和力。总之，这些结果表明Grb14-ZIP结合是由PIR-ZZ相互作用介导的。

PKCζ在体外和完整细胞中磷酸化Grb14。

先前的研究报告称，ZIP允许PKCζ与信号复合物中的特定效应器相关并磷酸化它们(18). 因此，为了确定PKCζ是否能够磷酸化Grb14，我们使用人重组PKCξ和GST-Grb14融合蛋白进行了体外磷酸化检测。随着GST-Grb14数量的增加，培养PKCζ导致GST-Grb 14的磷酸化增加，而对照组GST没有磷酸化（图。​（图5，5，车道3、4和7）。在反应中添加GST-ZIPα或GST-ZIPβ并没有改变Grb14磷酸化水平（数据未显示），这表明在体外条件下，ZIP对于PKCζ的Grb14磷酸化酶来说是不必要的。为了确定Grb14的特定结构域是否优先被PKCζ磷酸化，使用不同的GST-Grb14构建物进行了类似的实验。Grb14的C末端结构域，包括PIR和SH2结构域（氨基酸346到538），比N末端结构域（氨基1到346）磷酸化程度更高（图。​（图5，5，车道5和6）。有趣的是，与SH2结构域相比，PIR是更好的PKCζ基底（图。​（图5，5，8至10车道）。

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图5：。

PKCζ在体外磷酸化Grb14。使用材料和方法中描述的人重组PKCζ在体外进行磷酸化试验。如图所示，GST融合蛋白用作底物。磷酸化蛋白进行SDS-PAGE并通过放射自显影进行分析。星号表示自磷酸化PKCζ。这些斑点代表了四种不同的实验。

为了评估完整细胞中Grb14的磷酸化状态，我们进行了体内代谢标记实验。首先，用myc-Grb14瞬时转染CHO-IR细胞，标记有[³²P] 正磷酸盐，用胰岛素刺激或不刺激10分钟。与之前的结果一致(8,58)，Grb14在基础条件下磷酸化。用胰岛素处理细胞后，Grb14磷酸化水平增加了60%（图。​（图6）。6). 添加细胞渗透性肉豆蔻酰化PKCζ假底物（Myr-SIYRRGARRKL(65)，降低了胰岛素刺激的Grb14磷酸化，将磷酸化恢复到没有胰岛素时观察到的水平。CHO-IR细胞与HA-PKCζ共转染导致胰岛素刺激的Grb14磷酸化增加60%。相反，在没有胰岛素刺激的情况下，PKCζ的过度表达并没有增加Grb14磷酸化（数据未显示）。总之，这些结果支持PKCζ可能解释体内胰岛素诱导的Grb14磷酸化的假设。

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图6。

完整细胞中的Grb14磷酸化。瞬时转染myc-Grb14并标记有[³²P] 如图所示，正磷酸盐被胰岛素刺激（+）或不刺激（-）。细胞用HA-PKCζ或空载体共转染（右部分），或在胰岛素刺激前用20μM肉豆蔻酰化PKCζ（Myr SIYRRGARRRRKL）假底物处理30分钟（左部分）。用抗Grb14抗体免疫沉淀细胞裂解物，用SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素膜上，并用荧光成像仪（上印迹）定量。然后进行抗myc免疫印迹以确认等量的Grb14被免疫沉淀（下印迹）。在没有胰岛素（左侧）或没有HA-PKCζ（右侧）的情况下，结果以各自对照的百分比表示，并表示三个（右侧）或四个（左侧）独立实验的平均值（误差条）的平均值+标准误差。

PKCζ对Grb14的磷酸化增加了其对体外IR酪氨酸激酶活性的抑制作用。

Grb14的PIR介导与IR的结合以及蛋白质对受体催化活性的抑制作用(2,28). 由于PIR是PKCζ磷酸化的Grb14的主要结构域，我们假设这种磷酸化可以改变Grb14对IR催化活性的抑制作用。然后，在增加GST-PIR-SH2含量的情况下，在体外研究IR酪氨酸激酶的活性，该GST-PIR SH2之前被PKCζ磷酸化或未被PKCξ磷酸化。如图所示。​图7，7磷酸化GST-PIR-SH2抑制IR激酶的剂量-反应曲线相对于非磷酸化蛋白的抑制曲线向左偏移，反映了IR对其抑制作用的敏感性增加。40 ng磷酸化GST-PIR-SH2对IR酪氨酸激酶活性的抑制率为50%，而非磷酸化形式为160 ng。在进行IR激酶分析时，将PKCζ与磷酸化的GST-PIR-SH2一起添加。由于IR的丝氨酸-三烯磷酸化被描述为抑制IR酪氨酸激酶活性(4,68,69)在相同条件下，我们测试了PKCζ对红外催化活性的修饰能力。然而，当单独添加时，相同数量的PKCζ并没有改变IR酪氨酸激酶的活性。剂量-反应曲线的位移可归因于PIR-SH2结构域的磷酸化。因此，这些结果清楚地表明，PKCζ对Grb14的磷酸化增加了其对IR催化活性的抑制作用。

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图7。

Grb14的PIR-SH2磷酸化增加了其对IR催化活性的抑制作用。使用合成底物（poly-Glu-Tyr 4:1），在之前由PKCζ磷酸化或未磷酸化的GST-PIR-SH2的量增加的情况下，或在单独存在PKCξ的情况下测量WGA-纯化IR的酪氨酸激酶活性。结果表示为在没有GST融合蛋白的情况下测得的最大胰岛素效应的百分比，是三到五个不同实验平均值的平均值+标准误差。

ZIP增强Grb14对胰岛素诱导的小鼠减数分裂再启动的抑制作用X·莱维斯卵母细胞。

非洲爪蟾卵母细胞，在G处生理性滞留₂第一次减数分裂前期是一个合适的系统，用于研究由孕酮或胰岛素等多种细胞外诱导物启动的信号分子的功能作用(15,37,42). 这些激素与其受体的结合刺激卵母细胞进入M期，导致GVBD，这一事件可以很容易地进行监测，并用作减数分裂再启动的指标。在用胰岛素（10⁻⁶M） ●●●●。如图所示。​图8A，8安，微量注射100 ng GST-Grb14完全阻断胰岛素诱导的成熟。注射相同量的GST对胰岛素诱导的GVBD没有影响。此外，Grb14的这种抑制作用对胰岛素转导途径具有特异性，因为在用孕酮刺激卵母细胞时未观察到这种抑制作用（数据未显示）。有趣的是，PIR-SH2和PIR-GST融合足以抑制减数分裂的再启动，而GST-SH2融合则没有效果。微量注射100 ng GST-ZIPα（或GST-ZIPβ[数据未显示]）不会改变胰岛素诱导的卵母细胞减数分裂再启动。

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图8。

Grb14抑制胰岛素诱导的X·莱维斯卵母细胞成熟。在胰岛素刺激前1 h向卵母细胞微量注射100 ng所示GST融合蛋白，20 h后分析GVBD的出现。（A） 注射不同GST融合物对胰岛素诱导卵母细胞成熟的影响。结果以GVBD的百分比表示。数据表示两到三只动物的平均值（误差条）的平均值+标准误差，每只动物涉及20个卵母细胞。（B） 使用抗ERK2抗体对卵母细胞裂解物进行Western blot分析。印迹是三个不同实验的代表。

大量研究表明p21的重要性^拉斯-胰岛素诱导的GVBD中丝裂原活化蛋白（MAP）激酶级联反应(19,54)MAP激酶激活似乎是诱导卵母细胞成熟的必要条件(19). 因此，为了进一步研究Grb14在X·莱维斯我们研究了其对MAP激酶激活的影响。通过使用抗ERK2抗体的免疫印迹分析检测胰岛素诱导的ERK2磷酸化（图。​（图8B）。8亿). 在胰岛素刺激的卵母细胞中观察到42-kDa蛋白向更高电泳迁移率的转变，这表明存在ERK2磷酸化形式，但在先前微量注射GST-Grb14的卵母细胞核中没有发生这种转变。正如预期的那样，GST-ZIPα和GST没有改变ERK磷酸化。这些数据支持Grb14在胰岛素刺激期间抑制IR催化活性和MAP激酶的后续激活的观点(2).

对Grb14减少量的影响的研究表明，至少需要50 ng GST-Grb14来抑制胰岛素诱导的GVBD（图。​（图9）。9). 同时注射100 ng GST-ZIPα和少量GST-Grb14（不能抑制胰岛素的作用），恢复了对胰岛素诱导的GVBD的抑制（图。​（图9）。9). 使用ZIPβ时获得了类似的结果（数据未显示）。因此，这些结果表明ZIP增强了Grb14对卵母细胞成熟的抑制作用。

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图9：。

ZIP增强Grb14对胰岛素诱导的卵母细胞成熟的抑制作用。如图所示，向卵母细胞微量注射减少量的GST-Grb14，同时注射（填充条）或不注射（灰色条）100 ng GST-ZIPα。如图所示，监测卵母细胞对胰岛素的反应成熟度。​图8。8数据是三只动物平均值（误差条）的平均值+标准误差，每只动物涉及20个卵母细胞。

我们分别感谢J.Camonis和R.Farese对pFBL23质粒和pcDNA3-PKCζ质粒的馈赠。我们还感谢V.Le Marcis为GST融合产物的制作，以及E.Clauser、T.Issad和B.Desbuquois对手稿的批判性阅读。

这项工作得到了施维雅和癌症研究协会的支持（向A.-F.Burnol拨款5237）。不列颠哥伦比亚省由施维雅奖学金资助，而V.B.是Recherche部长奖学金的接受者。