能够促进黑色素瘤起始的NRAS突变体增强BRAF参与

GTPase活性受损的NRAS蛋白促进NRAS^61卢比-依赖性黑色素瘤发生

在RAS驱动的恶性肿瘤中，互补的野生型等位基因被认为可以抑制由突变活性癌蛋白驱动的肿瘤发生^19–22然而，野生型RAS的功能可能是突变特异性的，因为野生型KRAS的存在导致KRAS的选择^61卢比超过KRAS^61升在氨基甲酸乙酯诱导的小鼠肺部肿瘤中²³在黑色素瘤中，野生型NRAS对突变型NRAS致瘤潜能的影响尚不清楚。进一步研究不同致癌潜能的等位基因之间的相互作用可以揭示RAS分子之间的功能相互作用。探索美国国家科学院黑素细胞中的等位基因，我们比较了纯合子的肿瘤发病率、负担和总生存率(TN公司^61转/小时,TN公司^61倍/倍)和杂合子(TN公司^61倍/转)我们每个实验组的老鼠。杂合子小鼠的黑色素瘤表型通常介于纯合子小鼠TN公司^61卢比和TN公司^61倍/倍来自同一队列的动物（图2a–d天; 补充表^第1页). 尽管在NRAS驱动的人类恶性肿瘤中，异卵性缺失并不常见（补充图^4a–c类)，美国国家科学院^61卢比在野生型NRAS存在的情况下无法驱动黑色素瘤形成^第61季度（图第二版). 这些数据表明Nras公司黑色素瘤中的等位基因依赖于固有GTPase活性的丧失。

在单独的窗口中打开

图2

结合GTPase活性缺陷的第61密码子突变导致中间型黑色素瘤表型。

以下治疗队列的无黑色素瘤生存率、总生存率、肿瘤负担和肿瘤生长率：一 TN公司^{61公里/小时},b条 TN公司^61升/升,c TN公司^{61小时/小时},d日 TN公司^61页/页，以及e（电子） TN公司^第61季度肿瘤负担和生长速率点图以平均值+/−SD表示。对每个基因型的以下生物独立动物数量进行评估（61K队列：R/R=12，K/R=19，K/K=19；61L队列：R/R=13，L/R=17，L/L=17；61H队列：R/R=16，H/R=16、H/H=17；61P队列：R/R=13，P/R=20，P/P=16；61Q队列：R/R=18，Q/R=21，Q/Q=22）。在一–e（电子），表型TN公司^61转/小时将小鼠与TN公司^61倍/倍和TN公司^61倍/转动物。使用Log-rank（Mantel–Cox）试验比较存活率。使用Dunnet T3多重比较检验的单向方差分析来比较每个基因型和TN公司^61转/小时对于这个群体。已调整第页-所有比较值可在补充表中找到^第1页.* 第页 < 0.05,** 第页 < 0.01, ‡第页 < 0.0001. 源数据作为源数据文件提供。

黑色素瘤性NRAS突变体驱动与增殖相关的转录谱

我们对来源于我们的黑色素瘤形成（61R/R和61H/H）和非黑色素瘤产生（61P/P和61Q/Q）的MEF进行了RNA测序TN公司识别每个NRAS突变体下游转录谱的模型。黑色素瘤性NRAS诱导的转录体^61卢比和NRAS^61小时突变体与非黑色素瘤性NRAS诱导的突变体分开聚集^61便士和NRAS^第61季度主成分分析中的突变（补充图^5a级). 为了确定这些簇的主要决定因素，我们首先比较了TN公司^61卢比,TN公司^{61小时/小时}，或TN公司^{61便士/便士}MEF为野生型，TN公司^第61季度MEF（补充图^5b–e段; 补充数据^1a–c). 正如预期的那样，与E2F和MYC相关的转录物在表达突变NRAS的MEF中富集（补充图^{5英尺-小时})；然而，这种富集在TN公司^61卢比MEF公司。总之，这些数据表明了黑色素瘤成因之间的潜在联系美国国家科学院等位基因和增强的增殖信号。

接下来，我们通过比较表达不同NRAS突变体的MEF的转录组来确定突变体特异性转录程序。表达黑色素瘤性NRAS突变体的MEF之间只有23个转录物存在差异（61R/R和61H/H；≥1.5倍，第页-adj<0.05）（补充数据^2a个). 然而，在表达黑色素瘤形成和非黑色素瘤产生NRAS突变体的MEF中，至少有922个转录本存在差异（补充数据^2b、c). 基因本体论（GO）分析确定与GTP酶激活和鸟苷核苷酸结合相关的基因集是富含TN公司^61转/小时和TN公司^{61小时/小时}，结束TN公司^{61便士/便士}MEF（图3a年). 基因集富集分析（GSEA）进一步揭示，由黑色素瘤性NRAS突变体富集的转录物是与MYC和KRAS信号相关的转录物，包括MAPK通路的反馈抑制剂（例如。，DUSP6型,喷雾器2)（图3b、c). 相关的是，增强的MAPK>ERK信号驱动这些反馈抑制剂的表达²⁴和DUSP6型和喷雾器2在人类皮肤癌中水平升高（补充图^第6页). 随后的qRT-PCR实验证实，这些转录物在永生化细胞中也升高TN公司^61卢比和TN公司^{61小时/小时}黑素细胞，表明突变特异性转录谱在细胞类型之间是保守的（补充图^6b条). 尽管这些抑制剂上调，但通过EdU掺入测定，MEF和皮肤黑素细胞中表达黑素瘤NRAS突变体的增殖高于表达非黑素瘤NFRS突变体的细胞（图3d–f; 补充图⁷; 补充表²).

在单独的窗口中打开

图3

黑色素瘤和非黑色素瘤NRAS突变体对RAS-Myc轴的差异调节。

一点图表示基因本体（GO）分析中上调（左）或下调（右）基因的分子功能子集TN公司^61卢比和TN公司^{61小时/小时}MEF与TN公司^{61便士/便士}MEF公司。每个基因型使用三个生物重复进行分析。显示Hallmark基因集差异富集的条形图(第页-调整后<0.05），在表达NRAS的MEF中^61卢比相对于NRAS^{61便士/便士}(b条)或NRAS^{61小时/小时}与NRAS相比^{61便士/便士}(c).d日NRAS突变MEF中EdU标记流式细胞术分析的点图。n个 = 在4个独立的实验中，每个基因型检测了4个生物学上独立的MEF系。e（电子）一只10岁小鼠皮肤中EdU（增殖，绿色）和gp100（黑素细胞，红色）共同染色的代表性图像。n个 = 每个基因型检测4只生物独立的小鼠。（f）10日龄黑色素细胞EdU阳性百分比的点图TN公司^61倍/倍小鼠皮肤。按基因型（K/K=5，L/L=4，H/H=4，P/P=3）评估以下数量的生物学独立动物。点图数据以平均值+/−SD表示，其中每个点代表一个生物复制。采用单向方差分析和Tukey的后验来比较每个基因型之间的数据。NRAS突变样本与NRAS有统计学差异^61卢比样品如图所示。已调整第页-所有比较值可在补充表中找到².* 第页 < 0.05, †第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。

为了确定我们观察到的转录效应在肿瘤发病后是否持续存在，我们对从我们的TN公司GEMMs公司。携带NRAS突变体的肿瘤被认为是强烈的黑色素瘤驱动因素（补充图^8a、b; 补充数据^3a、b). 相反，761个基因在表达强烈（61R）和弱（61H）黑色素瘤启动驱动因子的肿瘤之间差异表达（补充图^第8页c; 补充数据^{3立方厘米}). 与相比时TN公司^{61小时/小时}黑色素瘤，TN公司^61卢比黑色素瘤富含与免疫途径调节相关的转录物（补充图^8天). 然而，终末期免疫浸润的减少并不一致TN公司^{61小时/小时}IHC检测CD45时的黑色素瘤⁺（补充图^1个). 此外，GO分析与体外MEF数据平行，将与鸟苷酸结合相关的过程确定为富含TN公司^61转/小时肿瘤超过TN公司^{61小时/小时}肿瘤（补充图^第8页). 这些数据表明，较高的RAS活性和增殖信号是黑色素瘤NRAS突变体在整个肿瘤发生过程中的常见功能。

黑色素瘤NRAS突变体促进MAPK>ERK信号传导

为了验证MAPK信号在黑色素瘤性NRAS突变体存在时升高的观点，我们分析了MEF和来自我们的永生化黑色素细胞的ERK和AKT激活TN公司^61倍/倍模型。我们使用腺病毒Cre在每种细胞类型中诱导NRAS表达，使细胞从感染中恢复，然后在分离蛋白之前将细胞置于无血清培养基中4小时。在MEFs和黑素细胞中，磷酸ERK水平与NRAS突变体的黑色素成像潜能平行（图第4页; 补充图。⁹a、 b中，^10年; 补充表^3a、b). 然而，PI3K/AKT信号通路的激活与MEF或黑素细胞中的黑素瘤性并不平行TN公司模型（图第4页; 补充图^第九章、c、，^10年). NRAS信号的这些差异似乎在整个肿瘤发生过程中持续存在，作为突变特异性MAPK>ERK的类似模式，而不是PI3K/AKTTN公司模型（图4b个和补充表^3a年). 总之，这些结果将NRAS突变体的黑色素瘤潜能与增强的MAPK>ERK信号联系起来。

在单独的窗口中打开

图4

MAPK通路激活与致癌NRAS突变体的致瘤潜能平行。

MEF蛋白裂解物的免疫印迹(一)或小鼠黑色素瘤(b条)表达指示的NRAS突变体。点图显示ERK激活、AKT激活或NRAS表达的量化。点图数据以平均值+/−SD表示，其中每个点代表一个生物复制。对于一在9个独立实验中，对每个基因型的以下生物独立重复数进行了检测（Q/Q=9，R/R=9，K/K=7，L/L=7，H/H=9，P/P=9）。对于b条每个基因型评估9个生物学上独立的重复。采用单向方差分析和Tukey的后验来比较每个基因型之间的数据。NRAS突变样本与NRAS有统计学差异^61卢比样品如图所示。已调整第页-所有比较值可在补充表中找到^3a年.* 第页 < 0.05,** 第页 < 0.01, †第页 < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。

黑色素瘤性NRAS突变体促进RAF二聚化

突变活性RAS蛋白通过RAF>MEK1/2>ERK1/2途径通过直接和间接机制刺激信号传导。突变RAS可以通过SOS1的变构调节间接激活MAPK，从而促进野生型RAS异构体上的GTP负载²⁵为了确定黑色素瘤性NRAS突变体是否通过这种间接机制促进较高水平的MAPK信号，我们使用慢病毒shRNAs敲除Sos1系列或赫拉（Hras）和喀斯特在里面TN公司^61卢比,TN公司^{61便士/便士}和TN公司^第61季度MEF公司。击倒Nras公司作为阳性对照，减少表达NRAS的MEFs中MAPK通路的激活^61转/小时（图5a级). 然而，击倒Sos1系列或赫拉（Hras）和喀斯特对MAPK激活没有影响，无论Nras公司存在等位基因，排除了黑色素瘤性NRAS突变体通过野生型RAS的间接激活驱动MAPK信号增强的可能性（图5a级; 补充表^第4页).

在单独的窗口中打开

图5

癌基因NRAS突变体通过RAF依赖机制介导差异MAPK激活。

靶向shRNAs的纯合MEF细胞系AKT和ERK活化的代表性免疫印迹Nras公司,赫拉（Hras）和喀斯特，或Sos1系列(一)或阿拉夫,布拉夫或螃蟹(b条). 点图数据以平均值+/−SD表示，其中每个点代表一个生物复制。对于一在五个独立实验中，对每个基因型的以下生物独立重复进行了检测（eGFP组：Q=5，P=5，R=5；NRAS臂：Q=3，P=3，R=3；H/KRAS臂：Q=3，P=4，R=3；SOS1臂：Q=5，P=5，R=5）。对于b条在8个独立实验中，对每个基因型的以下生物独立重复进行了检测（eGFP组：Q=8，P=8，R=8；ARAF臂：Q=6，P=6，R=6；BRAF臂：Q=7，P=7，R=6；CRAF臂：Q=7，P=7，R=6）。已调整第页-使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析生成值。图中所示的统计数据表明，shRNA处理的NRAS突变MEF与其各自的eGFP对照之间存在显著差异**第页 < 0.01, †第页 < 0.001. 调整后的完整列表第页-值可以在补充表中找到^4a、b。源数据作为源数据文件提供。

RAS亚型和KRAS突变体与外源表达系统中的每个RAF同源物具有不同的亲和力²⁶因此，我们推测黑色素瘤性NRAS突变体可能比内源性表达系统中的非黑色素瘤突变体更好地激活RAF。击倒布拉夫或螃蟹使用慢病毒shRNA部分减少MAPK在TN公司^61转/小时,TN公司^{61便士/便士}，以及TN公司^第61季度MEF（图第5页; 补充表^4b个).阿拉夫相反，击倒增强了ERK激活TN公司^61卢比MEF（图第5页). 为了证实这些结果，我们开发了一种腺病毒NanoBiT系统来测量活细胞中RAF的同质异构化（图第6页). 我们在MEF和每个MEF的原代黑素细胞中诱导NRAS表达TN公司然后用编码BRAF-LgBiT和BRAF-SmBiT、BRAF-Lg BiT和CRAF-SmBiT、CRAF-LgBiT和CRAF-SmBiT、ARAF-LgBiT和BRAF-SmBiT、ARAF-LgBiT与ARAF-SmBt或ARAF-Lg BIT与CRAF-Sm BiT的腺病毒感染细胞。在MEF和表达NRAS突变体的原代黑素细胞中持续观察到BRAF-BRAF和BRAF-CRAF二聚体升高，这些突变体具有较强的黑色素瘤驱动潜能（图6b–克; 补充图^10亿–d，^11a–f; 补充表^4c–e段). 这些结果表明，NRAS突变体在体内驱动黑色素瘤的能力与在体外诱导BRAF二聚体的能力相似。

在单独的窗口中打开

图6

黑色素瘤性NRAS突变体增强RAF二聚体。

一RAF NanoBiT分析的示意图，其中每个RAF亚型都标记有LgBiT或SmBiTTN公司^61倍/倍MEF感染表达BRAF-LgBiT和BRAF-SmBiT的腺病毒(b条)、BRAF-LgBiT和Craf-SmBiT(c)、CRAF-LgBiT和CRAF-SmBiT(d日)、ARAF-LgBiT和BRAF-SmBiT(e（电子）)、ARAF-LgBiT和ARAF-SmBiT(（f）)，或ARAF-LgBiT和CRAF-SmBiT(克). 将每个孔的发光强度标准化为结晶紫染色。点图数据以平均值+/−SD表示，其中每个点代表一个生物复制。在五个独立实验中对每个基因型的以下生物独立重复进行了检测（BRAF-BRAF:Q/Q=5，R/R=5，H/H=4；P/P=4；BRAF-CRAF:Q/Q=5，R/R=5，H/H=4；P/P=5；CRAF-CRAF:Q/Q=5，R/R=5，H/H=4；P/P=4；BRAF-ARAF：Q/Q=4，R/R=4，H/H=4；P/P=4；ARAF-ARAF:Q/Q=4，R/R=4，H/H=4；P/P=4；ARAF-CRAF:Q/Q=4，R/R=4，H/H=4；P/P=4）。采用单向方差分析和Tukey的后验来比较每个基因型之间的数据。NRAS突变样本与NRAS有统计学差异^61卢比样品如图所示。已调整第页-所有比较值可在补充表中找到^第4天. *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, †第页 < 0.001, ‡第页 < 0.0001. 源数据作为源数据文件提供。

体内Cre诱导和紫外线照射

在出生后第一天和第二天，将20 mM 4-羟基三苯氧胺（4-OHT）涂抹在新生幼崽的背部，以启动NRAS的表达⁶在出生后第三天，对动物进行单一的4.5 kJ/m²使用固定位置16 W，312 nm UVB光源（光谱学#EB-280C）的紫外线B（UVB）剂量。[参见参考文献。¹⁸更多信息]。实验组包括雄性和雌性小鼠。

结果监测和组织病理学

每个队列中的小鼠被随机编号，并每周进行三次肿瘤形成的盲目监测。检测后，每周测量三次黑色素瘤，并用卡尺记录肿瘤大小（宽×长（mm））。在达到任何预先确定的排除标准后，对小鼠实施安乐死，这些标准包括：任何尺寸的单个肿瘤≥1.6 cm，任何一个肿瘤直径≥1.3 cm，肿瘤溃疡大于2 mm，或身体状况小于2/5⁴¹对每只实验小鼠进行仔细跟踪，以确保不超过最大肿瘤大小。用一氧化碳对小鼠实施安乐死₂根据美国退伍军人医学协会的指南，吸入后发生颈椎脱位。每个原发性肿瘤的一部分固定在10%中性缓冲福尔马林中，其余部分进行闪速冷冻以提取蛋白质。将福尔马林固定样品石蜡包埋，切片（4µm），并用苏木精和伊红（H&E）染色。由美国兽医病理学家学会（K.M.D.L.）认证的兽医病理学家使用奥林巴斯BX45显微镜和附带的DP25数码相机（宾夕法尼亚州匹兹堡B&B显微镜有限公司）对染色的肿瘤切片进行评估。

免疫组织化学

肿瘤在10%中性缓冲福尔马林中固定过夜，并包埋在石蜡中。肿瘤切片（5µm）在二甲苯中脱蜡，并在乙醇中再水化。在装有Dako抗原回收液（#1699）的蒸锅中进行抗原回收30分钟。然后用3%过氧化氢、亲和素和生物素封闭肿瘤切片，并在针对Cre重组酶（1:125，细胞信号#15036S）的一级抗体中培养过夜。用IHC-Select生物素化二级抗体（山羊抗兔IgG，Millipore#21537）和VectaStain R.T.U Elite ABC试剂（Vector Labs#PK-7100）处理载玻片。接下来，将DAB染色原添加到每个部分中30秒。在2.5%的正常马血清（Vector Laboratories#s-2012-50）中第二次阻断组织，并与针对Ki67（1:1000，Abcam，#264429）、CD45（1:200，Cell Signaling#70257S）或Cleaved-Caspase-3（1:250，Cell Signaling#9579S）的第二个一级抗体孵育。用马抗兔IgG二级抗体（ImPRESS AP马抗狂犬病IgG聚合物试剂盒，Vector Laboratories MP-5401）处理载玻片，并用Fast-Red底物试剂盒（Abcam，#ab64254）染色12分钟。最后，用PBS中1:10稀释的苏木精对载玻片进行复染23分钟s.在带有SC30相机附件的奥林巴斯BX53M亮场显微镜上拍摄每张幻灯片的三个代表性图像。使用ImageJ（版本1.53 m）Colocalization Object Counter插件（版本1.0.0）量化DAB和FastRed阳性细胞的百分比⁴².

小鼠胚胎原代成纤维细胞和永生化黑素细胞的分离培养

利用人工均质和胰蛋白酶化从E13.5胚胎中生成MEF。将分离的细胞在成纤维细胞生长培养基（补充有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM））中培养。当融合度达到70-80%时，在10厘米的组织培养皿中传代MEF系。

为了产生原代黑素细胞系，对新生小鼠实施安乐死，并用含有10%FBS、1%青霉素/链霉素溶液、1%L-谷氨酰胺、10 mg/mL I型胶原酶、0.25%猪胰蛋白酶和0.02 mg/mL脱氧核糖核酸酶I的消化缓冲液对其皮肤进行机械和酶均质处理⁴³然后将均质细胞接种在胶原涂层的6 cm板上，置于黑素细胞基础培养基（含10%FBS的Ham’s F12，7%马血清（Thermo Fisher 26050088））和生长补充剂（0.5 mM二丁酰环AMP（dbcAMP；Sigma D0627），20nM佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（TPA；Sigma P8139），200pM霍乱毒素（Sigma，C8052），1%青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺）。一旦建立了纯黑素细胞群体，通过CRISPR/Cas9-介导的靶向trp53基因在这里，含有表达Cas9和trp53基因将引导RNA（种子序列：5′-GTGTATAGCTCCTGCATGG）添加到无血清Ham’s F12培养基中培养的原代黑素细胞中。感染后8小时，用PBS清洗原代黑素细胞，并将其置于黑素细胞基础培养基中进行恢复。永生黑素细胞系在6厘米的组织培养皿中达到60-70%的融合后进行传代。

NRAS表达的体外诱导

MEF和原代黑素细胞以相同密度接种在6或10 cm的组织培养板中。第二天，用PBS清洗这些培养物，并将其置于成纤维细胞或黑素细胞基培养基中。将表达Cre重组酶并结合eGFP的腺病毒（Ad5-CMV-Cre-eGFP；德克萨斯州休斯顿贝勒医学院载体开发实验室）以4000:1的MOI（病毒颗粒：细胞）添加到培养物中16小时（MEF）或8小时（黑素细胞）。感染后，在分析之前，让细胞在成纤维细胞或黑素细胞生长培养基中恢复至少72小时。通过基因组PCR证实了等位基因重组，其中三种可能的PCR产物之一是可能的：野生型（487 bp），LSL-Nras公司（371 bp），或CRE重组LSL-Nras公司（562个基点）。用以下PCR引物对这些等位基因进行基因分型重组：引物1-5′-AGACGGAGACTTGGCGAGC-3′（0.15μmol/L）；引物2-5′-GCTGGATCGTCAAGGCTCTTTCC-3′（0.15μmol/L）；Q61R GENO2-5′-GCAAGAGCCCGGCAGTACCTA-3′（0.15μmol/L）。样品在以下循环条件下运行：95℃15 min、35×[94℃30 s、62℃30 s和72℃45 s]、72℃5 min⁶.

免疫印迹法

使用液氮冷却的研钵和杵将冷冻肿瘤（10-15 mg）均质化。在RIPA（25 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，1%IGEPAL，0.1%SLS）中溶解均质肿瘤组织和颗粒细胞系，RIPA中添加蛋白酶抑制剂混合物（Sigma P8340）、花萼蛋白A（CST 9002S）和哈尔特磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Fisher 78420）。在SDS-PAGE凝胶上运行由Bradford Assay（Bio-Rad#5000006）测定的等蛋白浓度，并转移至PVDF（Sigma IPFL00010）。将PVDF膜封闭在5%的乳PBS中，然后用以下一级抗体之一探测：ERK1/2（1:1000，CST 4696S）、磷酸-ERK1/2（1:1000，CST 9101S）、AKT（1:1000，CST 2920）、磷酸-AKT（1:1000，CST 9271）、NRAS（1:250，Abcam ab77392）、HRAS（1:1000，Abcam ab32417）、KRAS（1:1000，Sigma WH0003845M1）、SOS1（1:1000，CST 5890），ARAF（1:1000，CST 4432P）、BRAF（1:500，Santa Cruz sc-5284）或CRAF（1:2500，CST 12552）。次级抗体在5%BSA 1x PBST中稀释如下：抗羊（1:15000）。LI-COR 926-32214）、抗鼠（1:15000，LI-COR 936-68070，LI-COR926-32210）或抗兔（1:15000、LI-COR 916-68071，LI-COR 926-32211）。膜在LI-COR Odyssey CLx系统上成像，并使用Image Studio软件（LI-COR Biosciences）进行量化。

RNA-排序

如我们的体外研究所述，使用Ad5-CMV-Cre-eGFP在第3代MEF中诱导NRAS表达。然后，在使用ZR-Duet DNA/RNA MiniPrep Plus Kit（Zymo D7003）分离RNA之前，将细胞培养6天。ZR-Duet DNA/RNA MiniPrep Plus试剂盒（Zymo D7003）也用于从TN公司^61倍/倍肿瘤组织。简言之，在将冷冻组织与液氮一起添加到研钵中之前，研钵和杵用液氮预冷。液氮蒸发后，将冷冻组织磨成细粉，与Zymo DNA/RNA裂解缓冲液混合，然后按照ZR-Duet DNA/RNA MiniPrep Plus试剂盒中的说明进行处理。在安捷伦TapeStation和Life Technologies Qubit上确认了RNA的质量和浓度。使用Illumina Ribo-Zero化学通过核糖体去除制备RNA，然后使用Illum TruSeq Total RNA Stranded library Prep Kit进行文库制备。RNA在Illumina HiSeq4000或NovaSeq6000上测序，150个碱基对，配对读。原始数据文件保存在NCBI基因表达总表（GEO）中#{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE162124”，“term_id”：“162124”}}GSE162124标准（MEF）或#｛“type”：“entrez geo”，“attrs”：｛“text”：“GSE197841”，“term_id”：“197841”｝GSE197841标准（肿瘤样本）。

使用STAR对RNA读取进行比对，以构建38个小鼠基因组（mm10）⁴⁴，使用PICARD标记的副本（版本2.17.11）(http://broadinstitute.github.io/picard网站/)和由featureCounts生成的基因计数矩阵（版本1.22.2）⁴⁵使用DESeq2进行差异基因表达分析(第页-调整后<0.05）⁴⁶GSEA在clusterProfiler包的GSEA函数中使用了DOSE算法^47,48从分子特征数据库Hallmark集合中探测基因集⁴⁹使用R中clusterProfiler包中的“enrichGO”算法进行基因本体（GO）分析^47,48.

全外显子组测序

使用与RNA-seq和快-DNA MiniPrep Plus试剂盒（Zymo D4068）。将冷冻组织研磨成细粉，并与400uL酵母固体组织缓冲液混合。然后将样品在55°C下培养2小时，然后继续使用快-DNA MiniPrep Plus试剂盒。DNA浓度在Life Technologies Qubit上得到确认。外显子富集由Novogene使用Agilent SureSelectXT小鼠外显子试剂盒进行，并在NovaSeq 6000上用150个碱基对读进行测序。原始数据文件保存在生物项目#PRJNA812398下的序列读取档案（SRA）中。

使用地穴轮式校准器（版本0.7.15）对测序读数进行比对，构建38个小鼠基因组（mm10）⁵⁰，使用PICARD（版本2.17.11）删除重复项(http://broadinstitute.github.io/picard网站/)，并使用GATK版本3.6围绕索引重新对齐读数⁵¹。使用Mutect2调用变量⁵²，VarScan2（版本2.4）⁵³和Strelka2⁵⁴。从每个数据集中筛选出所有三种算法未检测到的变量或Ensembl鼠标变量数据库中存在的变量⁵⁵。过滤的数据集用变量效应预测器进行注释⁵⁶使用变异模式⁵⁷.

EdU标记的流式细胞术分析

通道三TN公司^61倍/倍MEF感染Ad5-CMV-Cre-eGFP以诱导NRAS表达，如我们的体外研究所述，然后培养五天。然后将MEF在含有1%青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM中培养5小时，然后向培养基中添加0.01 mM 5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）。MEF用EdU标记5小时，然后收获并用4%多聚甲醛固定。固定细胞用皂苷在1%BSA 1×PBS中渗透。用Click-iT化学标记合并的EdU和Chromeo 642。在这里，细胞在含有2 mM CuSO的Click-iT反应鸡尾酒中培养30分钟₄50 mM抗坏血酸和50 nM Chromeo 642叠氮化物染料（活性Motif 15288）稀释在1×PBS中。每个样品10000个细胞在BD-LSR-Fortessa流式细胞仪上进行分析，并使用FlowJo软件测定EdU阳性细胞的百分比。具体而言，通过SSC-A基于FSC-A的门控选择MEF的初始种群（补充图⁷，顶部）。接下来，通过FSC-a图（补充图⁷，中间）。最后，使用APC-a强度的计数直方图来确定每个MEF群体中EdU阳性细胞的百分比（补充图⁷，底部）。

体内黑素细胞的EdU标记

如上所述，诱导新生幼鼠表达NRAS并用UVB照射处理。出生后第10天，通过腹腔注射给小鼠服用EdU（0.041 mg/kg）。两小时后，对小鼠实施安乐死，并收集其背部皮肤。将样品固定在10%中性缓冲福尔马林中24小时，嵌入石蜡中，并切割成5µm的切片。将每个部分的载玻片脱蜡并重新水化，然后使用Click-iT化学方法将合并的EdU标记为Chromeo 642，如上所述。使用Dako抗原回收液（安捷伦S169984-2）进行抗原回收，然后用Dako蛋白块（安捷伦特X090930-2）封闭。用抗gp100一级抗体（1:100；Abcam ab137078）和Alexa Fluor 555二级抗体（4µg/mL，Thermo Fisher A21428）标记皮肤黑素细胞。用DAPI（1:10000）对细胞核进行复染。在Perkin Elmer Vectra自动定量病理成像系统上为每个生物复制品拍摄五张图像，每张图像由五名盲检者计数。

MEF中shRNA敲除

使用聚乙烯亚胺（PEI）以每1µg质粒10µg/µL PEI的3µL比率将从Sigma购买的任务shRNA载体与pCMV-VSVG和ps-PAX2瞬时转染到HEK 293T（ATCC#CRL-3216）细胞中（shRNA信息见补充表^第5页). HEK 293T细胞通过短串联重复序列（STR）分析进行验证和鉴定，并每年进行支原体检测。在转染后48小时和72小时收集病毒上清液，并通过0.45µm注射器过滤器过滤。将病毒上清液与10µg/mL聚布伦烯一起加入NRAS无效的MEFs中。第二天将新鲜培养基放置在细胞上，感染后48小时开始选择1.5µg/mL的嘌呤霉素。

原发性黑素细胞的qPCR分析

美国国家科学院如我们的体外研究所述，使用Ad5-CMV-Cre-eGFP在原代黑素细胞中诱导表达。然后，在使用ZR-Duet DNA/RNA MiniPrep Plus Kit（Zymo D7003）分离RNA之前，将细胞培养6天。在安捷伦TapeStation and Life Technologies Qubit上确认了RNA浓度。使用iScript Select cDNA合成试剂盒（Biorad 1708897）从200 ng RNA制备cDNA。qPCR反应使用2µL 1:4稀释的cDNA与350 nM靶向特异性引物混合制备（补充表^5厘米)和SensiFAST混合物SYBR Hi-ROX（生物线92020）。qPCR反应在正常循环条件下进行，40个循环（95℃10 s，61℃15 s，72℃10 s）。使用熔融曲线来确认每个引物对的单个扩增产物。通过计算2来评估基因表达水平^-ΔΔCt归一化为野生型NRAS的值^第61季度控件。

腺病毒扩增

RAF NanoBiT和trp53基因gRNA序列被克隆到pAdTrack中⁵⁸.第1页-然后将线性化的pAdTrack质粒电穿孔到BJ5183-AD-1细胞中。重组AdEasy载体⁵⁸从转化细胞中分离出来的太平洋1并使用聚乙烯亚胺（PEI）以30µg PEI与1µg质粒的比例转染HEK 293AD细胞（Agilent#240085）。HEK 293AD细胞通过短串联重复序列（STR）分析进行验证和鉴定，并每年进行支原体检测。在病毒通过HEK 293AD细胞连续传播后，使用CsCl梯度纯化腺病毒，并在透析缓冲液（10 mM Tris（pH 8）、2 mM MgCl、4%蔗糖）中透析。将纯化的病毒与甘油混合并保存在−80°C。

NanoBiT分析

通道四TN公司^61倍/倍用Ad5-CMV-Cre处理MEF或永生化黑素细胞以诱导NRAS表达，然后均匀接种到96孔板中。第二天，将细胞置于低血清的成纤维细胞或黑素细胞培养基中，并感染表达所示RAF NanoBiT结构的腺病毒。第二天，在PBS中清洗细胞，并将其置于适当的生长培养基中进行恢复。感染后48小时，用PBS清洗细胞，并在分析前在含有1%青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺的无血清DMEM或RPMI中培养4小时。使用Nano-Glo活细胞分析（Promega N2012）评估发光强度。然后将细胞固定在含有结晶紫（0.01%w/v）的10%中性缓冲福尔马林中30分钟。结晶紫染色板在LI-COR CLx上成像，并用Image Studio软件定量。每个孔的发光强度归一化为结晶紫染色强度。

副本交换分子动力学（REMD）模拟

我们使用REMD模拟来对各种NRAS突变体的蛋白质构象进行采样²⁷由于RCSB数据库中缺少NRAS-Q61K/H/L/P突变体的结构信息，我们进行了分子建模，以生成MD模拟的起始结构。我们突变了GppNHp结合的野生型NRAS（PDB:5UHV⁵⁹，）使用Pymol生成NRAS-Q61H/L/P突变结构诱变工具。我们选择了碰撞分数最小的H61、L61和P61侧链旋转异构体，并通过对三磷酸盐尾部进行适当修改，将GppNHp改性为GTP。由于精氨酸和赖氨酸残基具有相似的生物物理性质，我们使用GTP结合的NRAS-Q61R（PDB:6ZIZ⁶⁰，）作为建模NRAS-Q61K结构的模板。使用Modeler-9v18工具重新定位所有缺失的残基和原子⁶¹MD模拟之前。

CHARMM36力场^62,63用于生成NRAS和结合的GTP核苷酸的拓扑结构。将NRAS Q61K/H/L/P突变体结构和NRAS Q61 R X结构分别在含有适量Na+和Cl-反离子的周期性水箱中溶解（去除结合的CRAF RBD-CRD后），以保持150 mM的盐浓度。通过使用10000步最陡下降，然后再使用10000步共轭梯度算法，将每个系统的能量降至最低。随后，在等温-等压系综（恒温和恒压）中对每个NRAS Q61突变系统进行了10纳秒的位置约束平衡模拟。V型重标恒温器⁶⁴和Parrinello-Rahman barostat⁶⁵用于将温度和压力保持在指定值。静电相互作用采用截止距离为1.2 nm的粒子网格Ewald方法进行评估。van der Waals相互作用终止于1.2nm的截止值，并使用LINCS算法约束所有与H原子的键。使用GROMACS-2020.3在290–350 K温度范围内对32个副本进行REMD模拟⁶⁶。使用温度生成器web服务器生成单个副本的温度(http://folding.bmc.uu.se/remd/)⁶⁷。以0.25的交换率，每2 ps对32个副本进行交换试验。总之，对每个NRAS-Q61突变体进行9.6µs的REMD模拟。对每个REMD系统进行聚类分析，以确定具有代表性的结构群。所有结构图形均使用Pymol可视化软件（Pymol Molecular Graphics System，Version 2.0 Schrödinger，LLC）绘制。

分子对接

CRAF最近的X结构：KRAS-Q61R复合体（PDB 6XGU⁶⁸，）显示了RAS与CRAF的RAS结合域-富含半胱氨酸的结构域（RBD-CRD）之间的大量联系。尽管最近解决了BRAF在自抑制和RAS结合状态下的低温电子显微镜重建⁶⁹，在RAS结合复合体中未观察到RBD-CRD结构。因此，我们使用活性CRAF RBD-CRD晶体结构通过同源建模模拟BRAF与NRAS Q61突变体的相互作用。然后使用BRAF RBD-CRD的优化结构通过蛋白质-蛋白质对接方法估计与NRAS-Q61变异体的相互作用。使用十六进制对接程序将NRAS-Q61K/R/H/L/P突变体的代表性高密度结构群对接到BRAF的RBD-CRD区域⁷⁰Hex使用实正交球面极性基函数来表示受体和配体的表面形状和电荷分布。Hex使用FFT计算来估计可能的对接复杂构象和蛋白质-蛋白质复合物的对接分数，作为刚体对接搜索中六个平移和旋转自由度的函数。基于十六进制估计，我们确定了高亲和力结合复合物，如十六进制对接分数所示，并评估了蛋白质间相互作用。

生物发光共振能量转移（BRET）分析

如前所述，使用BRET分析RAS-RAF相互作用⁷¹简而言之，静脉标记的NRAS和Rluc8标记的RAF以1:0.05–1:8（Rluc：Venus）的递增比率共同转染到293T细胞中，其中62.5 ng Rluc8-标记的RAF-持续转染。转染后48小时收集活细胞，并在向细胞中添加腔肠菌素-h后2分钟评估BRET信号。利用非线性回归从两条饱和度曲线中绘制出最佳拟合双曲线。然后使用这些曲线确定BRET₅₀值。最佳BRET₅₀显示了每个突变的值和标准误差。统计显著性由代表每条曲线测量次数的20个自由度的t检验确定。

统计和再现性

使用GraphPad Prism 8.4.3版对卡普兰-迈耶曲线和点图进行统计分析。使用log-rank（Mantel–Cox）检验评估Kaplan–Meier曲线中的生存差异。使用单向方差分析比较每个点图中的条件，并纠正每个图形图例中所述的多次比较。点图描绘了从≥3个生物重复中获得的数据的平均值±s.d.，每个点代表一个单一的重复。第页 < 0.05被认为是显著的。

作者感谢俄亥俄州立大学基因工程小鼠建模中心（GEMMC）和全国儿童医院基因组服务实验室（GSL）的成员提供的技术服务。此外，我们还要感谢Emma Crawford、Makanko Komara和Suohui Zhang博士的技术支持，感谢Krista M.D.LaPerle博士的病理支持，感谢Dafna Bar-Sagi博士（纽约大学）的试剂，感谢Martin McMahon博士（犹他大学）对手稿的批判性阅读。这项工作得到了Damon Runyon基金会（38-16；C.E.B.）、NIH F31 CA236418（B.M.M.）、Pelotonia（B.M.M.）、NIH-T32 GM068412（B.M.M）、NIHP30 CA016058（OSUCCC）、NCI ZIA BC 010329（D.K.M.），NIH R35 GM134962和P01 CA203657（S.L.C.）以及美国癌症学会PF-20-140-01-CDD（L.M.C）的支持。