树突状细胞PIK3C3/VPS34独立于LC3相关吞噬作用控制中枢神经系统自身免疫的致病性

圆珠笔3c3-DC缺乏可降低EAE的发病率和严重程度

DC特定圆珠笔3c3-缺乏CD8A的小鼠存在能力缺陷⁺树突状细胞向MHCⅠ类限制性T细胞提供死亡细胞相关抗原，因此，这些动物对B16黑色素瘤细胞的攻击表现出增加的转移[¹¹]. 然而，PIK3C3在树突状细胞自身免疫中的作用尚不清楚。为了测试DC特异性PIK3C3在自身免疫中的作用，我们采用MS的EAE模型，用MOG免疫小鼠_35-55诱导MOG特异性MHCⅡ类限制性CD4的肽⁺T细胞。我们首先在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司带有圆珠笔3c3^{飞行/飞行}小鼠作为对照。我们发现在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司老鼠(图2A). EAE的发病率在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠（11只对照小鼠中有11只对12英寸中的5英寸pik3c3型^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司来自三个独立实验的小鼠，第页=0.0024，X平方检验）(图2A). 此外，在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠的累积疾病评分和峰值疾病评分显著降低(图2A).

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图2。

圆珠笔3c3-缺乏可降低EAE的发病率和严重程度。（A） MOG主动免疫诱发EAE_35-55肽。（B） 髓磷脂特异性T细胞过继转移诱发EAE。结果显示，有一个实验是三个独立实验的代表。（C） 脑内树突状细胞的流式细胞术分析pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠在EAE诱导后14天。将三个独立实验的结果汇总在一起。（D） 从小鼠中制备CNS白细胞，用抗ITGAX、-ITGAM、-CD80、-CD86、-H-2Kb和I-A/-E抗体染色，并用流式细胞术进行分析。结果显示，有一个实验是三个独立实验的代表。（E） 中枢神经系统白细胞产生IL1B。从CNS和IL1B产生的ITGAM中分离细胞⁺流式细胞术检测细胞。将两个独立实验的结果汇总在一起。（F） ITGAX生产IL1B⁺CNS中的细胞。结果显示一个实验代表了两个独立的实验。所示数据为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

先前的研究提供了证据，证明CNS常驻的经典DC可以刺激效应性髓鞘特异性T细胞，并且选择性地耗尽这些细胞会导致髓鞘特异性T细胞数量减少，EAE发病率降低[¹⁹]. 因此，我们用MOG肽免疫野生型（WT）小鼠，并转移启动的髓磷脂特异性CD4⁺T细胞诱导受体EAE圆珠笔3c3^{飞行/飞行}或pik3c3^{飞行/飞行};Itgax Cre公司小鼠来模拟高度依赖于CNS内抗原呈递细胞存在的EAE效应期。与我们对主动EAE的结果类似，pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司过继转移致脑炎性T细胞后，与同窝对照组相比，小鼠的疾病严重程度减轻(图2B)表明EAE严重程度降低pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠是由于受体动物DC中缺乏PIK3C3。

我们之前报告过来自pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠在稳态条件下表现出活化表型[¹¹]，这也反映在图1因此，我们分析了DCs在中枢神经系统中的患病率和激活状态pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司EAE期间的小鼠。我们发现ITGAX更少⁺细胞在中枢神经系统中积聚pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司比圆珠笔3c3^{飞行/飞行}EAE期间的小鼠(图2C). 此外，EAE诱导的突变动物的这些细胞处于较低的激活状态，CD80、CD86和MHC I类和II类分子的较低表面表达揭示了这一点(图2D).

由于细胞因子IL1B在EAE中起着重要作用，我们接下来通过总PTPRC分析了IL1B的产生⁺白细胞和ITGAX⁺中枢神经系统中的髓细胞pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司EAE期间的小鼠。我们发现IL1B更少⁺总PTPRC中的单元格⁺单元格(图2E)但IL1B的频率相似⁺ITGAX中的单元格⁺单元格(图2F)来自pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司比派克3c3^{飞行/飞行}老鼠。考虑到我们之前的发现圆珠笔3c3-缺陷DC在热处理活化后产生较高水平的IL1B单核细胞增生李斯特菌与相比圆珠笔3c3-足够的DC[¹¹]，我们建议降低IL1B水平pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司EAE期间的小鼠可能是这些动物EAE发育改善的结果，而不是原因。

外周抗原特异性T细胞召回反应在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司老鼠

这个发现pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠表现出CD4的特异性缺陷⁺T细胞介导的EAE提示可能圆珠笔3c3-DC缺乏导致CD4减少⁺T细胞启动。为了测试这种可能性，我们从圆珠笔3c3^{飞行/飞行}和pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司EAE诱导后的小鼠（第10天），用MOG肽（20μg/ml）孵育以测量抗原特异性细胞因子的产生。IL17A的频率无显著差异⁺CD4细胞⁺和IFNG⁺CD4细胞⁺T细胞，尽管存在较高的组间变异(图3A、B). 自CD8A以来⁺T细胞对小鼠EAE的发病机制也有积极或消极的作用[^20–22]，我们进一步分析了CD8A抗原特异性细胞因子的产生⁺T细胞。然而，CD8A产生的细胞因子没有差异⁺来自MOG免疫的T细胞圆珠笔3c3^{飞行/飞行}和pik3c3型^{飞行/飞行};Itgax Cre公司之后观察小鼠在体外我们系统中的MOG再模拟(图3B). 为了确定CNS炎症的程度，我们检测了CNS浸润T细胞在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠与圆珠笔3c3^{飞行/飞行}室友。为此，在活性EAE诱导后第14天处死小鼠，并用流式细胞仪分析T细胞。pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠的总CD44显著降低⁺CNS浸润CD4⁺T细胞(图3C)以及IFNG⁺CD4细胞⁺T细胞，但IL17A患病率无显著差异⁺CD4细胞⁺T细胞(图3D).

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图3。

EAE患者外周抗原特异性T细胞召回反应在pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司老鼠。（A） 脾细胞来自圆珠笔3c3^{飞行/飞行}和pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司用MOG培养诱发EAE（第10天）的小鼠_35-55肽（20μg/ml）。培养18小时后，收集细胞并进行细胞内染色（IL17A和IFNG），以及产生细胞因子的CD4⁺T和CD8⁺通过流式细胞术分析T细胞。（B） 脾脏T细胞产生抗原特异性细胞因子的定量。（C） CD4的流式细胞术分析⁺和CD4⁺CD44细胞⁺大脑中的T细胞pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠在EAE诱导后14天。（D） 中枢神经系统侵入CD4产生抗原特异性细胞因子的定量⁺T细胞。（E） 服用MOG后WT小鼠的发病情况_35-55-特异性T细胞来自pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司或圆珠笔3c3^{飞行/飞行}老鼠。（F，G）IFNG百分比的相关分析⁺细胞或IL17A⁺CD4内的细胞⁺过继转移EAE诱导后出现EAE峰值疾病评分（F）和疾病发作（G）的细胞。对24个独立实验的结果进行汇总和绘制。所示数据为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。

确定是否圆珠笔3c3-树突状细胞缺乏损害CD4⁺T细胞致病性，我们免疫pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司MOG肽和转移引物髓磷脂特异性CD4的小鼠⁺T细胞诱导WT受体小鼠EAE。我们发现所有接受T细胞的小鼠pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司或圆珠笔3c3^{飞行/飞行}供体动物出现类似的EAE临床表现(图3E). 此外，EAE诱导后第10天分析的T细胞产生的抗原特异性细胞因子与疾病峰值评分无关(图3F)但与发病动力学相关(图3G).

综合起来，这些数据表明外周CD4⁺T细胞启动基本上没有改变，但CD4的积累⁺在DC中缺乏PIK3C3的情况下，CNS中的T细胞减少，这表明圆珠笔3c3-EAE缺乏可能是由于中枢神经系统中的DC而非外周。

DC特异性EAE表型圆珠笔3c3-缺陷小鼠与缺乏典型的自噬而非LAP有关

虽然典型自噬和LAP共享许多分子成分，包括PIK3C3，但LAP独立于自噬前起始复合体进行，自噬预起始复合体由ATG13、RB1CC1/FIP200、ATG101和ULK1组成[²³]. 此外，RUBCN与含有BECN1/Beclin1-PIK3C3-UVRAG的PtdIns3K复合物联合介导LAP，但不介导自噬[⁷]. 而在橡胶^-/-老鼠[²⁴]，我们之前的研究表明橡胶^-/-小鼠出现EAE症状，与WT对照小鼠相似[¹⁵]这表明这些小鼠自噬的轻微增加对EAE疾病的进展没有重大影响。在本研究中，我们进一步转移了启动的MOG-特异性CD4⁺T细胞诱导EAE橡胶^-/-受体小鼠。再次，所有检查的橡胶^-/-小鼠出现了类似于WT对照小鼠的临床疾病表现(图4A). 为了更直接地测试RUBCN在DC中的作用，我们在橡胶^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司老鼠。我们发现了橡胶^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司在主动和被动EAE模型中，小鼠表现出与WT小鼠相似的疾病症状(图4B、C). 确认DC特异性电阻圆珠笔3c3-EAE缺陷小鼠确实是由于自噬缺陷所致，我们在红1cc1^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司老鼠。类似pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司老鼠，红1cc1^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠对EAE诱导产生抵抗(图4D，E). 总之，这些结果表明DC特异性EAE表型派克3c3-缺陷小鼠与缺乏典型的自噬而非LAP有关。

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图4。

EAE需要DC自噬，但不需要LAP。（A–C）EAE在橡胶^-/-,卢布^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司和各自的同窝对照小鼠。（D，E）EAE在红1cc1^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司和室友控制小鼠。结果显示，一个实验是两个独立实验的代表。所示数据为平均值±SEM。***p<0.001。

脾细胞的制备

通过70μm细胞过滤器（Fisher Scientific International，Inc，22–363-548）将器官捣碎至添加5%胎牛血清（Sigma-Aldrich Corporation，F2442）然后用ACK裂解缓冲液进行红细胞裂解（Lonza bioscience，10-548E）。

免疫印迹分析

通过磁性分选（Miltenyi Biotec，130-100-875）纯化脾脏DC，并用PBS（Corning Cellgro，21-031-CV）洗涤三次，然后制备细胞蛋白用于蛋白质印迹。蛋白质浓度使用Bio-Read蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories Ltd，500-0116）进行测定。蛋白质通过10-15%SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜。随后用5%的牛奶封闭印迹膜，用一级和二级抗体孵育，然后使用ECLTM western印迹检测试剂（Amersham Bioscience）观察并暴露于膜中。抗PIK3C3（D9A5）、LC3B（2775）、SQSTM1（5114）、RUBCN（D9F7）和ACTB（13E5）的抗体购自Cell Signaling Technology。抗LAMP1（1D4B）抗体来自BioLegend。

基因表达谱分析

使用Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics的BD FACSAria III细胞分选机从脾脏样本中分选新鲜DC。用Quick-RNA的RNA裂解缓冲液造粒并裂解分选的细胞^TM（TM）MiniPrep（ZYMO Research，R1054）提取RNA。使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托）测量RNA的数量和纯度。从生物复制品中分离出总RNA，并按照标准方案提供给北京基因组研究所进行文库构建和测序。使用BGISEQ-500对库产品进行测序。简而言之，使用顺磁性寡核苷酸珠（Thermo Fisher Scientific，61002）从1μg总RNA中纯化多A尾RNA。将纯化的mRNA进行化学片段化，并使用随机引物将其反转录为双链cDNA。对适配器连接的DNA文库进行扩增和测序。标准生物信息分析由北京基因组研究所进行。简言之，在读取清洁和基因组作图后，使用RSEM对基因表达水平进行量化。利用基于负二项分布的DEseq2检测差异表达基因。利用KEGG注释结果，根据官方分类对DEG进行分类。使用phyper（R的函数）进行通路富集分析。原始序列数据已提交至SRA登录的序列读取档案：PRJNA557158。

活性EAE的诱导与评价

使用6-8周龄的动物进行EAE诱导。在异氟醚麻醉下，将200μl的1 mg/ml MOG从两个部位皮下注射到动物的侧面_35-55在弗氏完全佐剂（2 mg/ml）中乳化的（MEVGWyrPSFSRVHLYRNGK）肽（Biomatik，51716）结核分枝杆菌不完全弗氏佐剂中提取的H37Ra[BD bioscience，263910]）。免疫后即刻和48小时后，所有小鼠通过腹腔注射接受400 ng百日咳毒素（Calbiochem，516560）。根据以下评分标准，每天对小鼠进行盲法评分：0，无临床症状；0.5，部分软尾；1、尾巴麻痹；1.5，尾巴和后腿麻痹；2、运动协调性丧失，后肢麻痹；2.5，一条后肢瘫痪；三；双后肢瘫痪；3.5，后肢瘫痪，前肢无力；前肢瘫痪；5，奄奄一息。

被动EAE的诱导

对于过继转让EAE的诱导，pik3c3^{飞行/飞行};rubcn伊加克斯克^-/-,红1cc1^{飞行/飞行};rubcn伊加克斯克^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司小鼠及其各自的同胞对照组被用作T细胞过继移植的供体或受体。如上所述，在小鼠中诱导了活性EAE。第10天，采集脾脏，制备单细胞悬浮液。用50μg/ml MOG刺激细胞_35-551×10⁷培养皿中10 ml RPMI 1640完整培养基中的细胞/ml。72小时后，收集细胞并将其重新悬浮在PBS（1×10⁸细胞/ml）用于过继转移。在注射MOG前6小时，接受小鼠（8周龄）在400拉德下进行亚致死照射，以产生淋巴减少环境_35-55-特异性T细胞。腹腔注射细胞（300μl/小鼠）。临床评分与活动性EAE评分相似。

T细胞增殖试验

脾脏DC来自pik3c3型^{飞行/飞行};Itgax Cre公司，rb1cc1^{飞行/飞行};rubcn伊加克斯克^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司根据制造商的协议，使用DC隔离试剂盒对其各自的同窝对照小鼠进行隔离。MOG公司_35-55-特异性CD4⁺使用CD4从2D2 TCR转基因小鼠脾细胞中分离T细胞⁺T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，130-104-453）符合制造商的协议。根据制造商的说明（赛默飞世尔科学公司，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C34554”，“term_id”：“2370695”，“term_text”：“C4554”}}C34554号). 用20μg/ml MOG对DC进行脉冲处理_35-55或MOG_1-125（AnaSpec Inc，AS-55158-100）培养4小时，并与T细胞以1:5的比例与培养基培养96小时。培养结束时评估T细胞增殖。

流式细胞术

在所有实验中，通过电子门控将死细胞排除在分析之外。抗CD3E、CD4、CD8A、CD44、PTPRC、IFNG、IL17A、ITGAM、ITGAX、IL1B的荧光标记单克隆抗体和适当的同型对照物均来自BD Biosciences或eBioscienes。用于测量EAE期间MOG-特异性IFNG和IL17A的产生圆珠笔3c3^{飞行/飞行}和pik3c3^{飞行/飞行};Itgax-Cre公司在GolgiStop（BD Biosciences，554724）存在下，用MOG肽（20μg/ml）培养EAE诱导小鼠18小时。使用Canto II流式细胞仪（BD Biosciences）进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件（10.0.7版，Treestar，Palo Alto，CA）对采集的数据进行分析。