临床投资杂志。2021年4月1日；131（7）：e94229。
巨噬细胞SR-BI通过VPS34复合物和PPAR调节自噬α转录特菲布动脉粥样硬化
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,1和
1,三 帕特里夏·扬西
1心血管医学部动脉粥样硬化研究室医学部，
约翰·布莱克摩尔
1心血管医学部动脉粥样硬化研究室医学部，
乔纳森·布朗
1心血管医学部动脉粥样硬化研究室医学部，
凯西·C·维克斯
1心血管医学部动脉粥样硬化研究室医学部，
麦克雷·F·林顿
1心血管医学部动脉粥样硬化研究室医学部，
三美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院药理学系。
1心血管医学部动脉粥样硬化研究室医学部，
2病理学、微生物学和免疫学系
三美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院药理学系。
通讯作者。 2017年3月27日收到；2021年2月17日验收。
- 补充资料
补充数据
GUID:CB5277C9-E012-4C03-9EDC-EF6C17A4BBFC
摘要
自噬调节脂质周转、细胞存活、炎症和动脉粥样硬化。清道夫受体B类I型（SR-BI）在溶酶体功能中起着关键作用。在这里，我们证明SR-BI调节动脉粥样硬化中的自噬。SR-BI缺失减弱了巨噬细胞和动脉粥样硬化主动脉中脂质诱导的自噬介质的表达。因此，SR-BI缺失导致泡沫细胞形成和凋亡分别增加1.8倍和2.5倍，并增加氧化低密度脂蛋白诱导的炎症细胞因子表达。自噬的药理学激活未能降低脂质含量或细胞凋亡锶-b1–/–巨噬细胞。SR-BI缺失降低了转录因子EB（TFEB）的基础和诱导水平，TFEB是自噬的主要调节因子，导致编码VPS34和Beclin-1的自噬基因表达降低。值得注意的是，SR-BI规定特菲布通过增强PPARα的激活来表达。此外，细胞内巨噬细胞SR-BI定位于自噬体，在自噬体内形成胆固醇结构域，导致Barkor的结合增强和VPS34–Beclin-1复合物的募集。因此，SR-BI缺乏导致巨噬细胞和动脉粥样硬化主动脉组织中VPS34活性降低。的过度表达特菲布或电压34拯救了年有缺陷的自噬锶-b1–/–巨噬细胞。综上所述，我们的结果表明巨噬细胞SR-BI通过以下途径调节自噬特菲布VPS34–Beclin-1复合物的表达和招募，从而确定了SR-BI以前未被认识的作用以及动脉粥样硬化治疗的潜在新靶点。
关键词：心脏病学、血管生物学
关键词：动脉粥样硬化，自噬，巨噬细胞
介绍
自噬是一种细胞内自我调节过程，通过运输到溶酶体促进受损细胞器的降解(1). 已经鉴定出三种不同形式的自噬：大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。本研究关注巨噬细胞清道夫受体B类I型（SR-BI）在大细胞自噬（以下简称自噬）中的作用。越来越多的证据表明，自噬在人类和小鼠动脉粥样硬化病变中受到刺激，一些环境和细胞内因素已被确定为巨噬细胞中的自噬诱导物，包括氧化脂质、游离胆固醇（FC）和炎症因子(2–4). 自噬受损导致巨噬细胞内质网应激、炎症和死亡加剧(三,4). 最近，研究表明，胆固醇酯（CE）负载和细胞质脂质内含物的形成可诱导巨噬细胞自噬(5,6). 此外，可用于外排的FC的主要部分是由CE通过自噬体运输到溶酶体以供酸性脂肪酶水解，而不是由中性胆固醇酯酶水解(6). 因此，损伤细胞自噬的诱导可能通过减少泡沫细胞形成、细胞死亡和炎症来减少动脉粥样硬化的发展(2,7). 然而，对巨噬细胞泡沫细胞中自噬调节从而影响动脉粥样硬化形成的确切机制知之甚少。
自噬过程包括起始（吞噬细胞的形成）、伸长、自噬体闭合和自溶体成熟，这些都是由自噬相关基因（Atgs）及其蛋白质执行的(8). 在细胞应激过程中，mTOR抑制释放unc-51样激酶复合体（ATG1/ULK1-ATG13-ATG17），与受损细胞器的结构域相关联，从而导致III类PI3激酶复合体的募集，该复合体由VPS15（p150）、Barkor（Beclin-1相关的自噬相关关键调控因子，也称为ATG14L）和Beclin-2组成(9,10). VPS34与其调节因子Beclin-1形成复合物，VPS34–Beclin-1复合物通过与Barkor结合，与形成自噬体膜相关，Barkor优先与高度弯曲的膜相互作用(11,12). Bif-1与VPS34复合物的相互作用诱导磷脂酰肌醇-3-磷酸[PtdIns(三)P] 生产，招募对自噬体伸长和闭合至关重要的其他效应器(13). 许多因素加速了自噬体的形成和与溶酶体的融合，包括免疫相关的GTPase M1（IRGM1）和小GTPase蛋白Rab5和Rab7(14–17). 此外，mTOR抑制增加转录因子EB（TFEB）的核转位，TFEB是控制溶酶体生物发生和自噬的基因的主要转录调节器(10,18,19). 虽然已经建立了这些一般机制，但关于特定材料如何靶向溶酶体降解的自噬途径的细节，目前只对少数配体进行了鉴定。
SR-BI的改变影响动脉粥样硬化病变的发展(20,21)和SR-BI在胆固醇逆向转运途径中作为胆固醇和脂质的双向转运蛋白发挥作用。然而，SR-BI的新生物功能正在出现，包括其作为适应性免疫和先天免疫的关键因素的作用(22). 临床研究已确定人类SR-BI细胞外区域保守区域的单核苷酸多态性（SNP）与巨噬细胞胆固醇流出减少、血小板功能受损和冠心病风险相关(23–26). 巨噬细胞中SR-BI的缺失加速了低密度脂蛋白受体-空的动脉粥样硬化(Ldlr公司–/–)和载脂蛋白E–无效(阿波–/–)小鼠，不依赖于其在肝脏中作为HDL受体的作用(20,27).锶-b1–/–与动脉粥样硬化病变中的WT巨噬细胞相比，凋亡敏感性增加，并且锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比，细胞具有促炎性(28).
一些证据表明SR-BI可能增强自噬。此前，我们报道巨噬细胞SR-BI的缺失导致FC充盈的溶酶体和细胞质脂质滴的极端堆积，97%的细胞质被脂质占据(29). 此外，由于胆固醇积聚和溶酶体功能缺陷，SR-BI缺乏导致小鼠红细胞成熟失败(30). 最近的研究表明，SR-BI通过形成胆固醇结构域在感染环境中诱导自噬(31). 因此，我们研究了巨噬细胞SR-BI在内质网应激和泡沫细胞形成过程中自噬的作用。我们证明，巨噬细胞SR-BI缺乏会导致自噬受损，以应对饥饿、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和FC富集诱导的内质网应激，从而导致炎症和细胞死亡增加。此外，oxLDL处理导致更多的细胞质脂质滴锶-b1–/–与WT细胞相比。我们的结果表明，SR-BI缺失通过减少内质网应激反应中PPARα的激活来减少编码VPS34复合体蛋白和主自噬基因转录因子TFEB的关键自噬蛋白基因的表达。此外，SR-BI通过增加Barkor与SR-BI相关胆固醇结构域的结合，通过VPS34复合物增强自噬。因此，我们的研究确定了SR-BI在巨噬细胞自噬中的新功能。
结果
SR-BI缺乏对应激反应中巨噬细胞自噬的影响。
我们首先通过量化VPS34、Beclin-1和LC3II的蛋白质水平（Western blotting）来检测SR-BI功能丧失对自噬的影响，以应对不同的内质网应激源，包括血清饥饿和oxLDL(). 研究表明，巨噬细胞FC的富集会导致内质网应激，我们还通过培养WT和锶-b1–/–存在酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶（ACAT）抑制剂Sandoz 58035的乙酰化低密度脂蛋白的巨噬细胞(). 在含有10%FBS的DMEM培养的对照巨噬细胞中测定自噬蛋白的基本水平()和oxLDL或FC治疗()WT小鼠巨噬细胞中VPS34和Beclin-1蛋白水平分别增加2.1至2.2倍和1.8至2.5倍。相反，VPS34和Beclin-1蛋白水平在锶-b1–/–巨噬细胞对3种应激条件的反应。检查VPS34和Beclin-1的基础水平，一式三份(补充图1; 本文的在线补充材料；https://doi.org/10.1172/JCI94229DS1)说明了这一点锶-b1–/–巨噬细胞两种蛋白的水平略低。此外，我们检测了mTOR通路抑制剂雷帕霉素对诱导自噬的作用。与对照组相比，雷帕霉素治疗显著增加了WT中VPS34和Beclin-1蛋白水平锶-b1–/–巨噬细胞(). 雷帕霉素有效地抑制了两种细胞类型中的mTOR，磷酸化mTOR的减少证明了这一点(). 最重要的是，LC3II蛋白水平可用于测量自噬体的形成，与对照组相比，WT组显著增加（2.1至3.1倍）锶-b1–/–饥饿、oxLDL、FC和雷帕霉素治疗后（1.1至1.3倍）巨噬细胞(). 年LC3II的基础水平平均降低了30%锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比(补充图1). 自噬受损锶-b1–/–巨噬细胞并不是内质网应激反应降低的结果，因为CHOP和calnexin水平在锶-b1–/–与饥饿、oxLDL和FC治疗期间的WT巨噬细胞相比，在相同条件下，WT巨噬细胞含有更高的LC3II水平(补充图2). 为了研究SR-BI缺失对自噬基因表达的影响，采用实时荧光定量PCR检测了关键自噬因子的mRNA水平。针对FC浓缩()WT巨噬细胞中许多自噬/溶酶体基因的表达水平增加，包括编码ATG5、VPS34、Beclin-1、ATG7、LC3、IRGM1、Rab5、Rab7和Rab7的mRNA。重要的是，溶酶体/自噬基因表达的主要转录调节因子TFEB在WT巨噬细胞中的表达也增加。相反，相同基因的表达在锶-b1–/–巨噬细胞对FC负荷的反应。此外，与雷帕霉素孵育以抑制控制TFEB磷酸化的mTOR，导致WT巨噬细胞中VPS34、Rab7、LC3和TFEB的mRNA水平显著增加，但相同基因的表达在锶-b1–/–巨噬细胞(补充图3). 这些结果表明，SR-BI可能在转录水平上调节自噬。与此概念一致，WT和锶-b1–/–巨噬细胞锶-b1随后在FC中富集，导致编码ATG5、VPS34、ATG7、Beclin-1、LC3、Rab7和TFEB的mRNA水平增加(). 转染锶-b1导致类似情况锶-b1WT和锶-b1–/–巨噬细胞，在两种细胞类型中促进这些自噬基因的表达水平相似(). 自噬体的形成是自噬的重要标志。免疫荧光和电镜分析证实，与对照组相比，WT中的自噬体形成增强锶-b1–/–巨噬细胞。对荧光LC3II阳性空泡数量的分析表明，与WT巨噬细胞相比，锶-b1–/–巨噬细胞对FC富集的反应中自噬体减少了66.7%(). 此外，电子显微镜分析表明，FC处理减少了80%(P（P）<0.05）自噬体锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比(). 综上所述，这些数据表明SR-BI缺失导致巨噬细胞自噬受损。
巨噬细胞SR-BI缺乏对自噬的影响。(一–D类)WT和锶-b1–/–巨噬细胞受到不同程度的饥饿(一)，氧化低密度脂蛋白(B类)，游离胆固醇（FC）富集(C类)或雷帕霉素(D类). (一)为了饥饿，细胞在无血清的DMEM中培养12或24小时。(B类)细胞在含有50或100μg/mL氧化低密度脂蛋白的DMEM中培养24小时。(C类)将细胞在含有50或100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035（ACAT抑制剂）的DMEM中孵育24小时。(D类)用150或300 nM雷帕霉素培养细胞24小时。在一–D类也显示了用含有10%FBS的DMEM培养24小时的细胞的基本水平。通过Western blotting和点定量分析VPS34、Beclin-1和LC3II的水平。印迹具有代表性，数字是三个实验的平均值，其中数值标准化为基本WT（绿色，规则字体）或基本WT锶-b1–/–级别（红色，斜体）。
游离胆固醇（FC）富集对WT和WT自噬因子mRNA水平的影响锶-b1–/–巨噬细胞。巨噬细胞在含有100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035的DMEM中培养24小时，从而在FC中富集。然后通过实时PCR测定WT和WT中关键自噬蛋白的mRNA水平锶-b1–/–有或没有FC富集的巨噬细胞，包括ATG1、ATG5、VPS34、Beclin-1、ATG7、LC3、IRGM-1、Rab5、Rab7、Rab9和TFEB。数据表示为来自3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<0.05, **P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.01。
影响锶-b1WT和WT自噬因子mRNA水平的转染锶-b1–/–巨噬细胞。锶-b1–将表达质粒或对照质粒转染到WT或锶-b1–/–巨噬细胞使用jetPEI-巨噬细胞DNA转染试剂。用100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035培养24小时，使细胞在FC中富集。然后通过实时PCR测定FC富集或不富集细胞中关键自噬蛋白的mRNA水平。数据表示为3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***对采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出<0.001。
巨噬细胞SR-BI缺乏导致自噬体数量减少。(一–D类)WT或锶-b1–/–在含有100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035的DMEM中培养24小时，使巨噬细胞富含FC。细胞自噬体（APG）通过免疫荧光检测和定量(一和B类)和电子显微镜(C类和D类). (一)典型的免疫荧光图像显示LC3II阳性空泡。比例尺：20μm。(B类)用ImageJ软件分析LC3II点。n个=每组20个，来自3个独立实验。数据表示为平均值±SEM***P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.001。(C类)图中显示了APG的典型电子显微镜图像（箭头）。比例尺：1μm。(D类)APG数量的量化。数据是3个实验的平均值±SEM(n个=每组8个）*P（P）<经Mann-Whitney检验为0.05。
造血细胞SR-BI缺失对Ldlr动脉粥样硬化病变自噬的影响–/–老鼠。
先前的研究表明，自噬对人类和实验小鼠模型中动脉粥样硬化病变的形成至关重要(三,32). 因此，我们研究了造血细胞SR-BI缺失对动脉粥样硬化病变自噬的影响。为了研究SR-BI缺失对主动脉弓关键自噬因子表达的影响，Ldlr公司–/–用WT或锶-b1–/–用老鼠喂食食物或西式饮食16周。在Ldlr公司–/–喂食无明显动脉粥样硬化形成的食物的小鼠，SR-BI缺失不会引起主动脉弓组织自噬基因表达水平的变化(). 在Ldlr公司–/–移植WT BM并喂食西方饮食16周的小鼠，编码参与自噬体形成和运输的蛋白质的关键基因的表达水平，包括ATG5、VPS34、Beclin-1、ATG7、LC3、Rab5、Rab9和Rab7，与无动脉粥样硬化的组织相比，含有动脉粥样硬化病变的主动脉弓组织中增加(). 相反，动脉粥样硬化的发展并没有影响主动脉弓关键自噬基因的表达Ldlr公司–/–小鼠接收锶-b1–/–BM。最有趣的是特菲布作为自噬和溶酶体基因的主转录因子，在含有WT和锶-b1–/–巨噬细胞(). 此外，编码ATG1的mRNA的表达不是由动脉粥样硬化的发展诱导的，ATG1是mTOR抑制后释放的unc-51样激酶复合物的一部分Ldlr公司–/–接下来，我们通过免疫染色近端主动脉切片，检测SR-BI缺乏对晚期动脉粥样硬化病变Beclin-1蛋白水平的影响Ldlr公司–/–用WT重组的小鼠，锶-b1–/–,阿波–/–、和阿波–/–
锶-b1–/–双基因敲除（DKO）BM并喂食西方饮食16周(). 与含有WT或阿波–/–细胞，Beclin-1的表达在含有锶-b1–/–和DKO细胞。我们之前发表的研究表明，这些患者的近端主动脉粥样硬化程度Ldlr公司–/–移植WT的小鼠，Sr-b1型–/–,阿波–/–DKO分别为76.7、192、196和385×10三微米2分别表明SR-BI缺乏对自噬的影响影响中晚期动脉粥样硬化(28). 重要的是，检查主动脉根部切片中LC3II阳性斑点的数量阿波–/–喂食西方饮食8周的小鼠表明，在含有DKO的早期动脉粥样硬化病变中，自噬体的数量与对照组相比减少了77%Apoe公司–/–单元格(). 综上所述，这些数据表明造血细胞SR-BI缺陷会损害动脉粥样硬化病变中的自噬，并表明自噬缺陷会加速动脉粥样硬化。
造血SR-BI缺失导致动脉粥样硬化病变中自噬减弱。(一)从大鼠主动脉弓中分离出总RNALdlr公司–/–移植WT或锶-b1–/–骨髓，喂食食物或西方饮食16周。实时定量PCR分析相关基因表达。数据表示为平均值±SEM(n个=每组3只小鼠）*P（P）<0.05, **P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.01。(B类和C类)Ldlr公司–/–用WT重组小鼠，锶-b1–/–,Apoe公司–/–、和锶-b1–/–
阿波–/–（DKO）骨髓和西方饮食喂养16周。(B类)使用抗Beclin-1一级抗体和FITC-标记的二级抗体（绿色）对主动脉近端切片进行染色。细胞核用Hoechst（蓝色）复染。比例尺：100μm。(C类)用ImageJ软件定量Beclin-1阳性面积和总病变面积。(D类和电子)阿波–/–用阿波–/–或DKO骨手推车，并用西方饮食喂养8周。(D类)用抗LC3II一级抗体和Alexa Fluor 568标记的二级抗体（红色）对主动脉近端切片进行免疫荧光染色。细胞核用Hoechst（蓝色）复染。比例尺：100μm。(电子)用ImageJ软件定量LC3II阳性面积和总病变面积。(B类–电子)数据表示为平均值±SEM(n个=每组6只小鼠）***P（P）<采用Bonferroni事后检验，通过单因素方差分析得出0.001(C类)和*P（P）<0.05，通过Mann-Whitney试验(电子).
SR-BI对细胞质脂滴周转、凋亡和炎症的调节。
最近的研究表明，在巨噬细胞中，细胞质CE通过自噬被动员到溶酶体，水解为FC并从细胞中释放(6). 因此，我们检测了紫苏素2阳性脂滴在WT和锶-b1–/–单用对照DMEM、oxLDL或oxLDL加300 nM雷帕霉素处理巨噬细胞以增强自噬(补充图4，A和B). 与WT巨噬细胞相比，锶-b1–/–巨噬细胞的紫苏素2阳性脂滴增加了1.8倍(补充图4B). 与自噬受损一致Sr-b1型–/–细胞，雷帕霉素治疗使WT巨噬细胞中的脂滴数量减少51%，但在锶-b1–/–巨噬细胞。此外，中性脂质的油红O染色显示锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比，oxLDL存在时巨噬细胞的中性脂质增加了1.6倍(补充图4、C和D)雷帕霉素治疗显著减少WT巨噬细胞中性脂质的积累，但对锶-b1–/–巨噬细胞。细胞胆固醇的测量证实，与对照组相比，WT巨噬细胞积累的胆固醇更少锶-b1–/–巨噬细胞(补充图4E)自噬的诱导显著降低了WT巨噬细胞的胆固醇含量，但没有改变锶-b1–/–巨噬细胞。OxLDL促进内质网应激导致细胞凋亡，诱导自噬减轻内质网胁迫促进细胞存活(33). 通过annexin V染色检测oxLDL诱导的细胞凋亡，结果显示，在锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比(补充图5，A和B). 最重要的是，雷帕霉素诱导自噬可使WT细胞凋亡减少68%，但对细胞凋亡无影响锶-b1–/–巨噬细胞。接下来，我们测试了SR-BI介导的自噬在调节oxLDL炎症反应中的作用(补充图5、C和E). 与WT相比，锶-b1–/–巨噬细胞表达的IL-1β、IL-6和TNF-α分别增加5.8倍、1.7倍和1.9倍。雷帕霉素诱导WT巨噬细胞自噬后，IL-1β、IL-6和TNF-α的表达分别减少61.3%、52.3%和55.1%。与观察到的缺陷自噬一致锶-b1–/–巨噬细胞、雷帕霉素对oxLDL的炎症反应无影响。
SR-BI调节巨噬细胞和动脉粥样硬化病变中TFEB介导的自噬。
TFEB是溶酶体生物发生和自噬的主调节器(19). 由于观察到的伦敦交通局基因表达锶-b1–/–巨噬细胞对FC负荷的反应，在巨噬细胞和动脉粥样硬化病变中测量TFEB蛋白水平。首先，发现造血细胞中SR-BI缺失导致动脉粥样硬化病变中TFEB蛋白表达降低65.8%阿波–/–与对照动物相比，喂食西方饮食8周的小鼠(). 同样，TFEB蛋白水平在Sr-b1型–/–与WT巨噬细胞对FC富集的反应(补充图6A). TFEB蛋白的减少与Rab5和Rab7蛋白表达水平的降低有关，这两个已知的TFEB靶点(补充图6A). 在缺乏自噬诱导物的情况下，TFEB通过在细胞质中的隔离而保持失活，而通过抑制mTOR诱导自噬以TFEB依赖的方式促进TFEB的核移位和自噬基因的转录(34). 因此，我们研究了SR-BI缺失对巨噬细胞TFEB核定位的影响。TFEB的核水平较低锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比，TFEB的核质比降低了67%(补充图6、B和C). 因此，我们接下来检查了特菲布过度表达可恢复富含FC的TFEB核动员和自噬锶-b1–/–巨噬细胞。的瞬态表达式特菲布增加了手机(补充图7)细胞质和细胞核水平()WT和锶-b1–/–巨噬细胞。此外，TFEB的核质比在特菲布-转染的锶-b1–/–巨噬细胞(). 与此结果一致，VPS34、Rab7和TFEB的mRNA水平在特菲布-转染的锶-b1–/–FC富集和不富集的巨噬细胞(). 重要的是伦敦交通局挽救自噬活性锶-b1–/–巨噬细胞，如VPS34和LC3II水平增加和p62降低所示，p62是自噬降解的标志(和补充图7). 这些数据表明，SR-BI将脂质积聚引起的应激反应与自噬体/溶酶体功能、巨噬细胞中TFEB的表达和核定位以及动脉粥样硬化病变联系起来。
TFEB对WT和WT自噬活性的影响锶-b1–/–巨噬细胞和动脉粥样硬化病变。(一和B类)造血SR-BI缺失降低动脉粥样硬化病变中TFEB的表达。阿波–/–小鼠由阿波–/–或锶-b1–/–
阿波–/–（DKO）骨髓并喂养致动脉粥样硬化饮食8周。(一)使用抗TFEB一级抗体和FITC标记的二级抗体（绿色）对近端主动脉切片进行染色。细胞核用Hoechst（蓝色）复染。比例尺：100μm。(B类)通过ImageJ软件对TFEB阳性细胞进行定量。数据表示为平均值±SEM(n个=每组6只小鼠）***P（P）<0.001由未配对学生t吨测试。(C类–F类)特菲布-将表达质粒或对照质粒转染到WT或锶-b1–/–巨噬细胞使用jetPEI-巨噬细胞DNA转染试剂。通过用100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035培养24小时，用FC富集细胞。(C类和D类)通过Western blotting和斑点定量分析TFEB对FC富集的细胞质和核水平。(C类)斑点具有代表性，并且(D类)数据以3个独立实验的平均值±扫描电镜表示(n个=每组3个）**P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.01。(电子)通过实时PCR测定TFEB、VPS34、LC3和Rab7的mRNA水平特菲布-或对照质粒转染细胞，有或没有FC富集。数据表示为来自3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.001。(F类)特菲布过度表达可挽救细胞自噬缺陷锶-b1–/–通过LC3II和TFEB水平的Western blotting检测巨噬细胞。印迹具有代表性，数字是三个实验的平均值，其中数值被归一化为WT基本水平（绿色，规则字体）。
巨噬细胞SR-BI通过与VPS34复合物相互作用增强自噬。
据报道，在肝细胞和HeLa细胞中，SR-BI被输送到内体/溶酶体(35). 这一观察结果表明SR-BI可能在自噬信号中发挥直接作用，为了验证这一假设，我们接下来研究了SR-BI的亚细胞定位以及SR-BI是否定位于自噬体(). 共聚焦荧光显微镜显示巨噬细胞SR-BI定位于LC3II阳性空泡(). 此外，通过密度梯度超速离心进行细胞分离()显示SR-BI大量存在于质膜和ER中；然而，巨噬细胞SR-BI也定位于含有LAMP-1的溶酶体部分(). Rab7通过与VPS34复合体的相互作用，在自噬体与溶酶体的融合中发挥作用，研究表明SR-BI向HeLa细胞溶酶体转运是Rab7依赖性的(36,37). 因此，进行免疫沉淀研究以确定巨噬细胞SR-BI是否与VPS34复合体相互作用以响应FC负荷应激(). 我们发现SR-BI与复合物中的多种蛋白质相互作用，包括Rab7、Barkor、VPS34、Beclin-1和Bif-1(). SR-BI与VPS34复合物特异性相互作用，因为它不与ATG5或LC3共免疫沉淀。Barkor首先与形成的自噬体膜相互作用以招募VPS34–Beclin-1复合物(11)最近的研究表明，SR-BI胆固醇结构域在感染过程中高尔基体裂解和自噬体形成中发挥作用(31). 因此，我们接下来研究了胆固醇结构域是否与SR-BI和Barkor相关(). 将富含FC的WT巨噬细胞与霍乱毒素B（CT-B）孵育，后者与脂筏相互作用。用抗-CT-B抗体免疫沉淀胆固醇结构域表明SR-BI和Barkor都与胆固醇结构域相互作用(). 与SR-BI增强VPS34–Beclin-1复合物与形成自噬体膜的关联一致，SR-BI缺乏对VPS34活性的影响检测表明，oxLDL或oxLDL加雷帕霉素处理增加了PtdIns的生成(三)WT巨噬细胞中的P分别为41%和156%，但在锶-b1–/–巨噬细胞(). 此外，在动脉粥样硬化的主动脉弓组织中，VPS34活性高出2倍Ldlr公司–/–含有WT的小鼠与锶-b1–/–单元格(). 接下来，我们检测了富含FC的小鼠体内Barkor和胆固醇结构域的水平锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比(). 与WT相比，锶-b1–/–巨噬细胞分别含有50%和40%的Barkor和胆固醇结构域。此外，转染锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比锶-b1导致Barkor、胆固醇结构域和VPS34水平相似(). 重要的是，转染锶-b1–/–和WT巨噬细胞锶-b1导致类似水平的自噬体，如富含FC的细胞中类似的LC3II水平所证明的(). 此外，转染Sr-b1型–/–细胞水平增加锶-b1随后，FC富集以剂量依赖的方式刺激自噬，如VPS34和LC3II水平的增加所证明的(补充图8A). 此外，WT与锶-b1+/–根据VPS34和LC3II水平，巨噬细胞对FC富集表现出相似的自噬反应，这与SR-BI水平相似的两种细胞类型一致(补充图8A). 与SR-BI形成胆固醇域一致，转染锶-b1–/–巨噬细胞锶-b1FC富集后，TFEB和VPS34增加，p62降低，表明其刺激自噬的程度与WT巨噬细胞相似(补充图8B). 接下来，我们通过共焦荧光显微镜分析检测了WT和锶-b1–/–巨噬细胞(). WT组细胞内胆固醇结构域的基本水平比WT组高48%锶-b1–/–巨噬细胞和FC的富集导致WT巨噬细胞中胆固醇结构域阳性点增加64%，但未改变细胞内胆固醇结构域的数量锶-b1–/–巨噬细胞(). 当从WT和锶-b1–/–巨噬细胞(补充图9A). 此外，与锶-b1–/–巨噬细胞含有2.6倍(P（P）<0.01）更多胆固醇结构域和Barkor阳性的细胞内斑点(). 在分离的细胞膜中Barkor和胆固醇结构域的共定位中也观察到类似的结果(补充图9A). 在富含FC的WT巨噬细胞中，68%胆固醇结构域阳性的点状细胞和Barkor也对SR-BI阳性。与SR-BI一致的是，SR-BI通过增强VPS34复合物与形成自噬体膜的结合来增加VPS34活性，富含FC锶-b1–/–与WT巨噬细胞相比，巨噬细胞含有1.6倍于WT巨噬细胞的泛素化VPS34(补充图9B)蛋白酶体降解的抑制导致两种细胞类型中泛素化VPS34的增加。
巨噬细胞SR-BI通过VPS34复合物调节自噬。(一)用乙酰化LDL和Sandoz 58035处理WT巨噬细胞24小时，并用免疫荧光共聚焦显微镜检查SR-BI和LC3II亚细胞定位。比例尺：1μm。(B类)通过密度梯度超速离心法从WT巨噬细胞分离质膜、溶酶体、ER和核组分，并通过Western blotting检测SR-BI分布。LAMP-1被用作溶酶体标记物。(C类)将富含FC的WT巨噬细胞裂解物与抗SR-BI抗体或IgG和蛋白A/G磁珠交联并免疫沉淀。然后通过Western blotting检测免疫沉淀蛋白中的VPS34、Beclin-1、Barkor、Rab7、Bif-1、LC3、ATG5和SR-BI。(D类)SR-BI和Barkor与胆固醇结构域相关。将富含FC的WT巨噬细胞与霍乱毒素B（CT-B）孵育，后者与脂筏相互作用。细胞裂解物与抗-CT-B抗体或IgG和蛋白A/G磁珠交联并免疫沉淀。然后通过Western blotting在免疫沉淀蛋白中检测Barkor和SR-BI。在一–D类，数据代表了3个实验。(电子)使用III类PI3K ELISA试剂盒在使用或不使用100μg/mL oxLDL或300 nM雷帕霉素处理24小时的巨噬细胞中测量VPS34活性。数据表示为平均值±SEM(n个=每组6个，来自3个独立实验）*P（P）<0.05, **P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.01。(F类)在主动脉弓组织裂解物中测量VPS34活性Ldlr公司–/–用WT或锶-b1–/–骨髓，喂食食物或西方饮食16周。数据表示为平均值±SEM(n个=每组6只小鼠）*P（P）<使用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析进行0.05。
SR-BI通过增强Barkor-胆固醇结构域的相互作用来影响自噬。(一和B类)锶-b1–将表达质粒或对照质粒转染到WT或锶-b1–/–巨噬细胞使用jetPEI-巨噬细胞DNA转染试剂。然后用100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035培养细胞24小时。Western blotting检测SR-BI、Barkor、胆固醇结构域（CT-B）、VPS34和LC3II。印迹具有代表性，数字是3个独立实验的平均值，其中数值标准化为WT基本水平（绿色，规则字体）。(C类–电子)用含有10%FBS的DMEM培养细胞，或用100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035培养24小时，在FC中富集细胞。通过共聚焦荧光显微镜检查胆固醇结构域、Barkor和SR-BI在胆固醇正常（–）和FC富集（+）WT和锶-b1–/–巨噬细胞。(C类)显示了SR-BI（紫色）、Barkor（绿色）、胆固醇域（红色）和合并图像的代表性图像。比例尺：1μm。(D类和电子)仅胆固醇结构域阳性细胞内斑点平均数的定量(D类)Barkor和胆固醇域均为阳性(电子)50个细胞**对< 0.01, ***P（P）<0.001通过Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验。数据表示为平均值±SEM(n个=每组50人，来自3个独立实验）。
我们的数据表明，SR-BI可以增强PtdIn(三)作为VPS34综合体一部分的P生产；因此，我们接下来研究了是否存在电压34可以挽救在锶-b1–/–巨噬细胞(). 作为对FC负荷的反应，WT细胞中Beclin-1、ATG5、LC3和TFEB的mRNA水平增加，但在锶-b1–/–单元格(). 相反，转染锶-b1–/–和WT巨噬细胞电压34在有或无FC富集的两种细胞类型中，关键自噬蛋白（包括Beclin-1、ATG5和LC3）的mRNA水平显著增加(). 最有趣的是，编码TFEB的mRNA的表达被上调电压ps34WT和锶-b1–/–巨噬细胞(). 与此观察结果一致，WT和锶-b1–/–巨噬细胞(补充图10). 此外，电压34过度表达导致WT和WT中VPS34和Beclin-1的蛋白水平增加Sr-b1型–/–有或没有FC处理的细胞(和补充图10). 此外电压34导致FC-loaded WT中LC3II水平同样增加锶-b1–/–巨噬细胞，表明两种细胞类型中的自噬体数量相似(). 与这种可能性相一致的是，p62的水平是通过自噬降解的标志，在WT和Sr-b1型–/–具有的单元格电压34过表达和FC负载(和补充图10). 有趣的是电压34显著促进TFEB核定位，对TFEB活性表现出正反馈(). 此外，电压34在WT和锶-b1–/–巨噬细胞(). 因此电压34在WT和锶-b1–/–巨噬细胞().
的过度表达电压34挽救自噬缺陷并降低细胞凋亡敏感性锶-b1–/–巨噬细胞。(一–电子)WT和Sr-b1型–/–巨噬细胞转染pcDNA4-电压34或空质粒48小时。然后用或不用乙酰化LDL和Sandoz 58035处理细胞24小时。(一)实时定量PCR检测Beclin-1、ATG5、LC3和TFEB的mRNA水平。数据表示为来自3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）**P（P）<0.01, ***P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.001。(B类)通过Western blotting检测VPS34、Beclin-1、p62、LC3和GAPDH，并使用LI-COR Odyssey软件进行定量。这些值被标准化为WT基本级别（绿色，常规字体）。(C类和D类)通过Western blotting和(D类)定量了核质比。数据表示为来自3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<使用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析进行0.05。(电子和F类)用Cy3标记的膜联蛋白V（红色）检测巨噬细胞凋亡。细胞核用Hoechst（蓝色）复染。(电子)所示为代表性图像。比例尺：20μm。(F类)对凋亡细胞的百分比进行量化，数据表示为平均值±SEM(n个=每组9个，来自3个独立实验）*P（P）<使用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析进行0.05。
SR-BI通过TFEB介导的VPS34转录影响自噬。
SR-BI表达增加了两种基因的mRNA水平伦敦交通局和电压34在自噬诱导过程中。在锶-b1–/–巨噬细胞-自噬受损-或电压34或特菲布增加自噬基因的表达，拯救自噬功能。因此，我们接下来研究了TFEB是否调节电压ps34首先，我们使用siRNA在富含FC的J774细胞中测定TFEB敲除的效果。与TFEB在转录电压34，TFEB的敲除显著减少电压34mRNA水平(). 同样，已知受TFEB转录调控的基因（包括编码Rab7和LC3的mRNA）的mRNA水平也降低。此外特菲布通过瞬时转染细胞，增加了富含FC的WT和锶-b1–/–巨噬细胞(和补充图7). TFEB通过结合目标基因启动子中的一致DNA序列来调节自噬基因的表达。接下来我们分析了电压34基因启动子和5′非翻译区（5′UTR）用于潜在TFEB结合位点的存在，并在5′UTRs中鉴定了2个位点（位点I和位点II(). 含有这些预测的TFEB共有位点的寡核苷酸被IRDy700荧光染料标记，凝胶位移分析显示TFEB蛋白与位点I内的DNA强烈结合()站点II较弱（数据未显示）。重要的是，位点I的突变和与未标记DNA的竞争破坏了位点I的这种相互作用，表明这种效应具有选择性。此外，与抗TFEB抗体孵育产生了清晰的超移带()，强烈表明TFEB直接调节电压34转录。
的影响特菲布VPS34的转录。(一)siRNA对TFEB的敲除作用减弱电压34基因表达。J774A.1巨噬细胞转染25 nM特菲布siRNA 24小时，然后用FC处理24小时。实时PCR检测编码TFEB、VPS34、Rab7和LC3的mRNA的表达水平。实时PCR数据表示为3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<0.05（未成对学生）t吨测试。(B类)潜在的TFEB结合位点电压34用电子方法对基因启动子和5′UTR进行分析，发现5′UTR2个潜在位点（位点I和位点II）。(C类)TFEB蛋白与电压34基因DNA。用IRDy700标记特异性DNA寡核苷酸（位点I）。TFEB蛋白（5μg）和1μL 25 nM dsDNA在EMSA缓冲液中培养20分钟，然后通过5%TBE聚丙烯酰胺凝胶电泳进行解析，图像由LI-COR Odyssey捕获。
SR-BI通过PPARα激活影响自噬。
我们的研究表明，SR-BI促进TFEB的表达(,,、和). 研究表明，PPARα的激活促进了PPARα结合位点的募集特菲布启动子，导致TFEB表达增强和自噬(38–40). 此外，研究表明SR-BI调节作为PPARα配体的细胞和血浆脂肪酸(41). 因此，我们接下来通过使用ELISA测定核PPARα水平来研究SR-BI表达对PPARα激活的影响。与富含FC的WT巨噬细胞相比，核PPARα活性在锶-b1–/–单元格(). 相反，WT组与WT组的PPARγ和PPARδ活性相似Sr-b1型–/–巨噬细胞(补充图11，A和B). Western blotting检测PPARα的核水平也显示，与对照组相比，WT组PPARα增加锶-b1–/–巨噬细胞(). 与PPARα激动剂CP-775146共同孵育可增加WT和WT中PPARα的核水平锶-b1–/–ELlSA测定的巨噬细胞(补充图11C)和蛋白质印迹(). 此外，PPARα拮抗剂GW6471降低了两种细胞类型的核PPARα水平(和补充图11C). 与PPARα促进伦敦交通局，的特菲布WT和锶-b1–/–CP-775146处理的巨噬细胞，而特菲布在与拮抗剂GW6471孵育的两种细胞中均减少(). 此外，PPARα激动剂增加了两种细胞类型中TFEB的核水平，而拮抗剂减少了核TFEB(). 与PPARα激活对TFEB的影响一致，自噬蛋白Beclin-1、Rab7、LC3、VPS34和ATG5的mRNA水平在WT和锶-b1–/–PPARα激动剂CP-775146处理的巨噬细胞，而GW6471处理的巨噬细胞减少了自噬基因的表达(). 类似于研究表明PPARα调节锶-b1(42)，我们发现CP-775146增加，而GW6471减少锶-b1WT细胞中的mRNA水平(). 这些结果表明特菲布和锶-b1由PPARα协同调节。有趣的是，与对照组相比，WT组PPARαmRNA水平增加锶-b1–/–巨噬细胞，以及类似于FC富集对伦敦交通局mRNA表达(和)与对照组相比，FC富集显著增加WT中PPARα的表达锶-b1–/–巨噬细胞()，但对两种细胞类型中PPARγ和PPARδmRNA的表达没有显著影响(补充图11D). 此外，PPARα激动剂治疗WT和锶-b1–/–巨噬细胞显著增加了编码PPARα的mRNA水平，GW6471降低了这两种细胞类型中PPARαmRNA的表达(). 这些结果与研究一致，研究表明TFEB也调节PPARα的表达(43,44). 与PPARα对特菲布和自噬基因，PPARα激动剂CP-775146增加了富含FC的WT和WT中TFEB、Beclin-1、VPS34和Rab7的蛋白水平锶-b1–/–巨噬细胞(). 此外，CP-775146增加了这两种细胞类型的自噬流量，p62降低和LC3II水平升高证明了这一点(). 相反，PPARα拮抗剂GW6471降低了两种细胞类型的自噬蛋白水平，并增加了p62水平(). 此外，用PPARγ和PPARδ激动剂吡格列酮和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“GW501516”，“term_id”：“289075981”，“term_text”：“GW501516“}}GW501516型分别不会影响自噬蛋白的水平(补充图11E). 重要的是，PPARα蛋白水平在阿波–/–SR-BI表达小鼠与锶-b1–/–造血细胞(补充图11、G和H). 综上所述，我们的结果表明SR-BI调节特菲布通过控制PPARα的表达和激活来增强自噬，并且TFEB、SR-BI和PPARα在促进自噬中受到协调调节。
SR-BI缺乏降低巨噬细胞PPARα活性。(一)使用WT和WT核提取物（NEs）的连续剂量测量PPARα活性锶-b1–/–用100μg/mL乙酰化LDL和5μg/mL Sandoz 58035（富含FC）处理巨噬细胞24小时。数据表示为3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001由未配对学生t吨测试。(B类)WT和锶-b1–/–对细胞进行FC富集，并用或不用CP-775146或GW6471处理。然后通过Western blotting检测核提取物中PPARα、TFEB和c-Jun的水平。印迹具有代表性，数字是两个实验的平均值，其中数值标准化为基本WT（绿色，规则字体）或基本WT锶-b1–/–级别（红色，斜体）。(C类)WT和锶-b1–/–用10%FBS处理的巨噬细胞或用乙酰化LDL和Sandoz 58035培养24小时后用FC富集的巨噬细胞。然后通过实时PCR检测编码PPARα的mRNA的表达。(D类)通过实时PCR测定富含FC的WT和WT中TFEB、Beclin-1、Rab7、LC3、VPS34和ATG5 mRNA的表达水平锶-b1–/–单用载体或CP-775146或GW6471处理的巨噬细胞。(电子)通过实时PCR测定富含FC的WT和WT中PPARαmRNA的相对水平Sr-b1型–/–单用载体或CP-775146或GW6471处理的巨噬细胞。在C类–电子，数据表示为3个独立实验的平均值±SEM(n个=每组3个）*P（P）<0.05, **对< 0.01, ***P（P）<采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出0.001。NS，不显著。(F类)通过Western blotting分析富含FC的WT和WT中Beclin-1、TFEB、VPS34、LC3I、LC3II、p62、Rab7和GAPDH的表达锶-b1–/–巨噬细胞经载体CP-775146或GW6471处理。这些斑点具有代表性，数字是两个独立实验的平均值。在B类和F类，这些值标准化为基本WT（绿色，常规字体）或基本WT锶-b1–/–级别（红色，斜体）。
讨论
许多内质网应激因子（包括氧化脂质、FC和炎性细胞因子）刺激人类和实验小鼠动脉粥样硬化病变中的自噬(2,三). 此外，巨噬细胞的CE负载刺激自噬，FC的大部分可通过胞质CE向溶酶体的自噬通量和酸性脂肪酶的水解流出(6). 缺陷自噬通过促进泡沫细胞形成、细胞死亡和炎症加速动脉粥样硬化的发展(2,4,6). 此外，SR-BI缺失加速了阿波–/–和Ldlr公司–/–老鼠(21,45). 我们目前的研究表明，巨噬细胞SR-BI增强动脉粥样硬化病变泡沫细胞的自噬，从而可能影响细胞总脂质负荷、炎症和死亡。重要的是，我们证明SR-BI通过控制关键自噬基因的表达来调节自噬，包括特菲布是自噬基因转录的主要调节器，通过PPARα激活。此外，SR-BI似乎通过与作为VPS34复合体一部分的Barkor相互作用对自噬产生直接影响，从而增强VPS34活性。因此，锶-b1–/–巨噬细胞表现出胞质脂质积累增加，导致细胞死亡和促炎激活状态增加。这些发现扩展了我们之前的工作，表明含有SR-BI阴性细胞的动脉粥样硬化病变具有广泛的细胞死亡和细胞胞质脂质体积的大量膨胀(29). 尽管研究表明，在动脉粥样硬化发展的后期，自噬功能受损(三)，在含有SR-BI阴性细胞的病变中发生的缺陷自噬可能不是动脉粥样硬化加剧的结果，而动脉粥样硬化是由早期和晚期动脉粥样硬化病变中出现的缺陷自吞噬加速的().
组织和细胞通过刺激自噬相关基因的耦合调节来诱导自噬，以应对环境压力。为了正确组装自噬体并维持自噬功能，需要对该基因程序进行精确控制。这项研究揭示了SR-BI在致动脉粥样硬化刺激诱导的关键自噬效应基因表达中先前未被认识的作用()和ER应力(,、和). 为了寻找候选机制，我们将重点放在主转录因子TFEB上。TFEB协调自噬和溶酶体基因对多种应激源的诱导(19). 在这里，我们发现TFEB本身的表达（mRNA和蛋白）在锶-b1–/–与WT巨噬细胞和锶-b1–/–胆固醇应激条件下动脉粥样硬化病变中的造血细胞(和). 此外，TFEB核转位和靶基因表达在Sr-b1型–/–巨噬细胞与WT巨噬细胞的比较(补充图6和和). 在WT细胞中观察到的表达和核定位的增加与确定涉及TFEB的自身调节环的研究一致，在该环中，应激信号促进TFEB胞质到核的易位及其自身转录的激活，以及自噬效应基因(43). 我们的研究表明，TFEB正反馈回路在锶-b1–/–如TFEB水平降低和TFEB核定位缺陷所示。与这种可能性一致特菲布增加TFEB水平并部分恢复核定位，从而挽救靶基因表达和观察到的缺陷自噬锶-b1–/–巨噬细胞(). 重要的是，我们的研究表明TFEB表达、核定位和自噬基因表达的中断锶-b1–/–巨噬细胞可能是通过SR-BI减少PPARα激活的结果，核PPARα减少就是证明(). 我们的观察进一步证实了这一概念，PPARα激动剂增加了两种细胞的TFEB核水平和自噬基因表达锶-b1–/–和WT巨噬细胞(、和补充图11C)而PPARα拮抗作用则相反。事实上，PPARα激动剂挽救了锶-b1–/–巨噬细胞(). 这与证明SR-BI调节潜在PPARα配体的研究一致(46–48)以及PPARα在其结合位点的招募特菲布促进剂增强特菲布和自噬基因表达(38–40). 有趣的是，我们的研究表明PPARα、SR-BI、TFEB和自噬基因的表达是协调调节的。在这方面，我们发现除了加强伦敦交通局PPARα激动剂上调编码PPARα的mRNA水平(). 该观察结果表明TFEB也调节PPARα的表达，这与其他研究一致(43,44). 此外，PPARα激动剂增加SR-BI表达，SR-BI缺乏降低PPARαmRNA水平(). 与SR-BI功能丧失的影响相似，并且与自噬基因的表达被协调调节一致电压34也上调了自噬基因的表达(). TFEB表达增加和TFEB核定位()由于VPS34过度表达，可能有助于WT和WT中自噬基因的增强表达锶-b1–/–巨噬细胞。此外，最近的研究表明，VPS34与VPS34复合蛋白GRP78在正反馈回路中协调，以调节自噬基因的表达(49). VPS34信号传导阻止泛素介导的GRP78降解并通过ATF6促进其转录，通过激活未折叠蛋白反应p-eIF2α/ATF4通路导致自噬基因表达增加(50). 我们的发现进一步证明了TFEB和VPS34表达的协同调节，即TFEB的敲除减少了电压34mRNA水平，并且在电压34促进剂(). 综上所述，这些数据表明SR-BI是激活TFEB转录反应的应激诱导信号转导途径的重要介体(,,,、和).
除了TFEB及其靶基因的表达减少外，我们还检测到oxLDL治疗后促炎基因的表达增加锶-b1–/–巨噬细胞。促炎信号的程度和大小也可能在自噬控制中发挥作用。事实上，先前的研究表明，巨噬细胞中的分枝杆菌感染会损害自噬，抑制NF-κB会恢复其功能(51–54). 这些数据表明，NF-κB转录活性可能会抑制自噬基因在其他生物环境中的表达。因此锶-b1–/–在我们的工作中观察到巨噬细胞(补充图5)和其他人(55)可通过NF-κB依赖机制间接干扰自噬基因的诱导。
与SR-BI在自噬信号中的直接作用一致，我们证明细胞内SR-BI定位于巨噬细胞中的溶酶体和LC3II阳性空泡(). 这一发现与其他研究一致，表明SR-BI定位于肝细胞和HeLa细胞的晚期内体/溶酶体区室(35). 我们观察到巨噬细胞SR-BI与VPS34复合体的成员相互作用，包括VPS34、Beclin-1、Rab7和Bif-1(). VPS34复合物对自噬体的启动和形成至关重要。PtdIns的形成(三)P by VPS34招募对自噬体伸长和闭合至关重要的其他蛋白质(37). Beclin-1与VPS34形成复合物，并被脂质结合蛋白（如Barkor和UVRAG）募集到形成自噬体膜(23). 我们的研究表明，SR-BI增加了与Barkor相互作用的细胞内胆固醇结构域的形成(和补充图9A). 我们的研究表明，胆固醇结构域的SR-BI形成增强了与Barkor的相互作用，导致VPS34–Beclin-1复合物的更多关联，并增加了VPS34活性，因为SR-BI无效的巨噬细胞和动脉粥样硬化病变显著降低了VPS35活性。与Beclin-1和VPS34增强募集以形成自噬体膜的概念一致，锶-b1–/–与WT相比，巨噬细胞具有明显更多的泛素化VPS34，其靶向蛋白酶体降解(补充图9B). 此外电压34挽救了在锶-b1–/–细胞凋亡减少到与WT细胞相似的水平(). 然而，在没有SR-BI的情况下，自噬可以被挽救，这一发现与VPS34在自噬中存在多种效应器相一致，包括UVRAG、Bif-1和Beclin-1，并且SR-BI通过形成增加Barkor关联的胆固醇结构域来增强自噬(和补充图9)随着自噬体膜的形成(13,56). 尽管观察结果显示电压34或特菲布拯救自噬Sr-b1型–/–巨噬细胞表明SR-BI不是VPS34复合物的必要组成部分，我们的研究表明，在内质网应激条件下，巨噬细胞SR-BI是VPS34复合体的关键组成部分(和和补充图9). 还应该认识到电压34或特菲布很可能不发生在动脉粥样硬化病变中，而巨噬细胞内质网应激在动脉粥样硬化的发病机制中起着至关重要的作用。因此，SR-BI可能对增强斑块中VPS34的活性至关重要，这与含有SR-BI表达的斑块中自噬流量大于Sr-b1型–/–造血细胞(). 有趣的是，研究还表明，自噬体与溶酶体的融合依赖于VPS34的Rab7激活。Ahras和同事(35)证明活性Rab7是将SR-BI贩运到HeLa细胞溶酶体所必需的。目前发现SR-BI与Rab7和VPS34在应激反应中相关，这表明Rab7也可能通过与SR-BI相互作用调节VPS34的活性。我们最近报道巨噬细胞SR-BI和Src相互作用，激活PI3K，形成吞噬杯，介导凋亡细胞的胞饮效应(28). 此外，研究表明Rab7与VPS34复合物相互作用促进PtdIn的形成(三)P对吞噬体与溶酶体的融合至关重要(57). 我们的数据表明，SR-BI很可能通过与Rab7和VPS34相互作用，在胞饮作用期间参与吞噬体成熟。
总之，我们的研究揭示了SR-BI通过增强自噬作用在巨噬细胞泡沫细胞代谢和动脉粥样硬化病变发展中的作用，从而导致脂质清除和抗炎、促生存状态。脂质充盈细胞中的SR-BI通过PPARα介导的转录调控自噬基因的表达特菲布并形成胆固醇结构域，以增强与Barkor和VPS34复合物的相互作用，促进自噬体的形成。因此，巨噬细胞SR-BI的缺失导致细胞质脂质积累、凋亡和炎症增加，这与SR-BI阴性动脉粥样硬化病变中广泛的细胞质脂质体积和细胞死亡相一致。这些研究不仅确定了SR-BI在巨噬细胞自噬中潜在的新功能，还为动脉粥样硬化的预防和治疗提供了治疗靶点。
方法
老鼠。
锶-b1+/−小鼠（1:1混合C57BL/6×S129遗传背景）从Jackson实验室获得，并回交10代以上至C57BL/6背景。小鼠被喂食含有21%乳脂和0.15%胆固醇的食物或西式饮食（Teklad）。
细胞培养、自噬诱导、siRNA和转染。
从用WT重组的小鼠中分离出腹腔巨噬细胞，锶-b1−/−,阿波−/−、和Sr-b1型−/−
阿波−/−（DKO）BM，如前所述(28). 为了刺激自噬，通过饥饿、FC富集或oxLDL处理在巨噬细胞中诱导内质网应激反应，如补充方法.击倒特菲布小鼠25 nM siRNA的基因表达特菲布（Ambion）用DharmaFECT试剂（Dharmacon）转染J774A1细胞（ATCC）24小时。对于瞬时转染，使用PLUS试剂（Invitrogen）的Lipofectamine LTX或使用pcCMV6-SR-BI（Origene）、pcDNA4-VPS34（Addgene 24398；参考文献。11)或pEGFP-N1-TFEB（Addgene 38119；参考。34)或干扰控制质粒应用于巨噬细胞48小时。
骨髓移植和动脉粥样硬化分析。
女性阿波−/−或Ldlr公司−/−对小鼠进行致死性照射并移植5×106BM细胞来自锶-b1+/+
阿波−/−和来自WT的DKO小鼠或BM，锶-b1−/−,阿波−/−和DKO小鼠。4周后，将小鼠置于西式饮食中8周或16周。通过近端主动脉的油红O染色横截面和使用KS300成像系统的面部分析检查动脉粥样硬化程度（Kontron Elektronik GmbH，参考。28). 免疫荧光染色用于检测动脉粥样硬化病变中的自噬体水平，如补充方法(28).
质膜和溶酶体制备。
使用质膜提取试剂盒（BioVision）提取质膜。如溶酶体分离试剂盒（Sigma-Aldrich）所述，通过密度梯度超速离心从巨噬细胞裂解物中制备溶酶体(58).
免疫沉淀和蛋白质印迹。
对于免疫沉淀实验，如前所述制备交联全细胞裂解物(59)用10μg抗SR-BI抗体（Novus）和25μL磁珠（Invitrogen）免疫沉淀。诱导上清液用于检测小鼠VPS34、Beclin-1、Rab7、LC3、Barkor或SR-BI。对于Western blotting，细胞裂解物通过SDS-PAGE溶解，转移到硝化纤维素膜上（Amersham Bioscience），并用指示的一级和二级抗体进行检测，如补充方法.
泡沫细胞油红O染色、脂滴免疫荧光染色和细胞胆固醇测定。
油红O染色用于测量巨噬细胞泡沫细胞形成(60)，如中所述补充方法通过紫苏素2免疫荧光染色定量胞质脂滴的数量。简单地说，按照指示处理细胞，用新鲜的4%多聚甲醛（Sigma-Aldrich）固定在PBS中，用0.2%Triton X-100渗透，用2%BSA封闭PBS中的细胞，然后用抗紫苏素2抗体（Novus）和Alexa Fluor 658标记的二级抗体孵育，用Hoechst（Sigma Aldrich。这些图像使用荧光显微镜（Olympus IX81）和SlideBook 6（Intelligent-Image）软件进行处理。如前所述，通过酶促胆固醇测定法测量细胞胆固醇(61).
电子、荧光和共焦显微镜分析。
固定单层细胞，然后用一系列浓度的乙醇擦洗固定后脱水，并逐渐用Epon树脂渗透。薄片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用在100千电子伏下操作的FEI Tecnai T-12进行透射电子显微镜检查，以超微结构分析细胞自噬体含量。使用抗LC3II一级和荧光标记的二级抗体，通过免疫荧光染色检测巨噬细胞自噬体水平。通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测SR-BI、Barkor/ATG14L和胆固醇域标记CT-B的细胞内位置和表达水平，如补充方法.
VPS34激酶活性测定。
按照制造商的说明，使用III类PI3K ELISA试剂盒（Echelon）测量巨噬细胞或主动脉根部组织中内源性或外源性表达的VPS34激酶活性，如补充方法.
主动脉根部RNA分离和实时RT-PCR。
使用Aurum Total RNA试剂盒（Bio-Rad）分离和纯化总RNA。用iScript逆转录酶（Bio-Rad）合成互补DNA。使用Bio-Read实时PCR试剂盒对靶mRNA进行相对定量，如补充方法.
凝胶位移分析。
采用电子方法检测VPS34基因启动子和5′UTR中TFEB结合位点的潜在存在(62). 预测和突变的DNA和TFEB共识（5′-GTAGGCCACGTGACCGGGG-3′）寡核苷酸用荧光IRDy700染料（Invitrogen）标记并用dsDNA退火。使用奥德赛EMSA试剂盒（LI-COR）进行凝胶位移分析，如补充方法.
PPAR活性测定。
使用核提取试剂盒（Abcam）从巨噬细胞制备核提取物。使用PPARα/γ/δ转录因子检测试剂盒（Abcam）测量PPARα/γ/δ活性。简单地说，将100μL（5μg蛋白质）的核提取物添加到指定的孔中，在4°C下孵育过夜，然后将一级抗PPARα/γ/δ抗体和HRP-结合二级抗体施加到每个孔中，并在室温下孵养1小时。清洗后，用提供的转录因子展开液在室温下培养孔45分钟，并在添加停止液后5分钟内在450 nm处读取吸光度。
统计。
数据以平均值±SEM表示。平均值之间的差异通过单向方差分析（Bonferroni的事后检验）、Kruskal-Wallis检验（Bunn的多重比较检验）、Mann-Whitney检验和Student的t吨使用GraphPad Prism进行Kolmogorov-Smirnov检验，检验样本种群的正态性。对小于0.05的值被认为是显著的。
研究批准。
动物研究符合脊椎动物研究的所有相关道德规范。动物实验方案由范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准并按照其规定执行。
作者贡献
HT设计并执行实验，获取并分析数据，撰写手稿。PGY设计研究、分析数据并撰写手稿。JLB、YZ和LD进行了实验。WGJ进行了实验，分析了数据，并修改了手稿。JDB和KCV分析了数据并修改了手稿。MFL设计研究，分析数据，获得资金，并撰写手稿。
致谢
这项工作得到了NIH拨款HL127173、HL148137、HL146134、HL116263和DK59637的支持。共焦显微镜和透射电子显微镜通过使用范德比尔特大学细胞成像共享资源（由NIH拨款CA68485、DK20593、DK58404、DK59637和EY08126支持）进行。
脚注
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
版权：©2021，美国临床研究学会。
参考信息：临床研究杂志. 2021;131（7）：e94229。https://doi.org/10.1172/JCI94229。
工具书类
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