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神经科学杂志。2006年2月8日；26(6): 1711–1720.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.2279-05.2006
预防性维修识别码：PMC6793639型
PMID：16467519

突触前终末独立调节突触聚集和GABA自噬A类受体隐杆线虫病雅致

亚伦·M·罗兰,1 珍妮特·里士满,2 杰森·奥尔森,1 大卫·H·霍尔,三和布鲁斯·班伯1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

GABA的突触聚类A类受体对抑制性突触，影响突触强度，从而影响大脑中的兴奋和抑制。已知突触前终末可诱发GABA公司A类突触发生过程中的受体聚集，但其机制集群的形成和维护尚不清楚。研究突触前神经元如何指挥GABA的形成A类受体簇，我们研究了GABAA类突触前接触失败的突触后细胞的受体定位秀丽隐杆线虫.突触后肌肉C、。挽歌接受乙酰胆碱和GABA运动神经支配，以及GABAA类受体在GABA末端对面聚集。导致GABA输入选择性丢失GABA公司A类受体弥散分布在肌肉细胞处或附近表面，证实GABA突触前终末诱导GABAA类受体相反，选择性丧失乙酰胆碱神经支配对GABA公司A类受体定位。然而，GABA和乙酰胆碱的损失共同输入导致GABAA类细胞内交通的受体自噬体。自噬体通常将大量细胞质运输到溶酶体退化。然而，我们表明GABAA类受体对自噬体的转运从细胞表面和乙酰胆碱受体内吞去除后细胞不会进入自噬体。因此，自噬可以降解细胞表面受体并且可以选择性地这样做。我们的结果表明突触前终末诱导GABA公司A类独立控制突触定位的受体聚类GABA的表面稳定性A类受体。他们还展示了一部小说GABA中的自噬功能A类受体降解贩运。

关键词：GABA公司A类受体、自噬、突触发生、UNC-49、烟碱乙酰胆碱受体、，秀丽线虫

介绍

神经元兴奋和抑制之间的平衡对于信息至关重要大脑中的处理。当这种平衡被打破时，癫痫和焦虑症可能会结果(Crestani等人，1999年；Baulac等人，2001年；华莱士等人。，2001；Cossette等人，2002年). 这个兴奋-抑制平衡依赖于抑制性神经传递，介导主要由GABA提供A类受体(刘，2004).这些受体聚集在突触后膜上，与抑制性突触前终末相对。GABA公司A类受体聚集很重要，因为它能获得高受体GABA释放位点附近的密度，这对抑制性突触电流的振幅和动力学(Semyanov等人，2004年). GABA的机制A类受体聚集突触后膜尚不清楚。

神经递质受体的聚集是发育途径的最终结果突触前终末接触突触后细胞时启动。在兴奋性突触，该途径包括受体合成的调节、神经递质的聚集受体和支架分子，以及非突触受体的消除(Broadie和Bate，1993年；2002年的负担；Chih等人，2005年). 在GABA突触，突触后GABAA类受体和支架分子也聚集在一起突触前终端接触(Levi等人。，1999；Rao等人，2000年；Brunig等人，2002年；Christie等人，2002年；Studler等人。，2002；加里和贝塞罗，2003年). 绑定突触前β-神经氨酸酶对突触后神经原-2分子的作用是重要的第一步踏上这条道路(Graf等人，2004年；Chih等人，2005年). 路径引导的后续事件GABA的形成和稳定维持A类受体簇仍有待发现。剖析GABA的一个障碍A类受体聚集途径具有无法通过实验消除突触前接触。这个实验是重要的是，它应该揭示GABA的哪些方面A类受体贩运受突触前终末的影响。

线虫秀丽隐杆线虫是一个强大的模型系统研究突触发生，因为我们可以通过基因操纵突触前和突触后并观察结果体内.体墙肌肉尤其有助于研究抑制性突触发生。体壁肌肉与GABA和非GABA神经元(White等人，1986年). 因此可以确定匹配和非匹配突触前接触的影响。GABA公司A类这些细胞中的受体简单而均匀(Bamber等人al.，2005年)与结构复杂的哺乳动物GABA相反A类受体。最后，轴突寻路可以被操纵，所以突触前接触体墙肌肉可能被选择性或完全消除。在本研究中，我们消除了突触前输入并确定GABA如何A类受体模式受到影响。我们表明GABA终端组织GABAA类受体进入突触簇，但GABA和非GABA终端都能稳定GABAA类细胞上的受体表面。在没有突触前输入的情况下，GABAA类受体被内在化通过自噬体进行降解。乙酰胆碱受体（AChRs）细胞不会进入自噬体，这表明自噬对GABA公司A类受体。这些结果很重要，因为它们有助于描述GABA中的单独步骤A类受体聚集途径自噬作为GABA降解的新途径A类受体。

材料和方法

秀丽隐杆线虫培养物

秀丽线虫在线虫生长培养基琼脂上生长20–25°C。Bristol N2为野生型菌株；用于此的突变等位基因研究是unc-49（e407）,unc-5（e53）,unc-51（e369）,rol-9（sc148）,林-15（n765ts）,rme-8（b1023ts）,unc-38（x20）,snb-1（md247）,unc-13（e1061）,unc-31（e928）,cha-1（第1152页）,cha-1型(y226吨)，acr-16（ok789）,unc-64（x37）、和unc-25（e156）.

运动轴突寻路操作

运动神经元必须表达netrin受体才能向背侧投射并支配背侧肌肉。netrin受体由unc-5号机组基因(Leung-Hagesteijn等人，1992年). 在unc-5（e53）突变体，netrin受体有缺陷，没有运动神经元背向投射，背肌无神经支配(Hedgeock等人，1990年). 无神经支配背侧的所有研究肌肉在unc-5（e53）遗传背景。我们恢复背侧轴突对GABA神经元和ACh神经元的单独寻路unc-5（e53）突变背景，通过表达netrin受体（UNC-5）受GABA神经元特异性启动子控制[unc-47号机组(McIntire等人，1997年)]和ACh神经元[acr-2型(Hallam等人，2000年)].在unc-5（e53）携带P的突变体unc-47号机组：UNC-5转基因后，GABA轴突寻径正常，而ACh轴突寻路仍然存在有缺陷的。因此，ACh神经支配在这些菌株。同样，GABA轴突寻路在unc-5（e53）携带P的突变体acr-2型：：UNC-5转基因。去除ACh神经支配或GABA神经支配的实验使用这些转基因从背部肌肉选择性地进行。我们可视化了GABA运动轴突使用Punc-47号机组：：绿色荧光蛋白（GFP）我们用Pacr-2型：：GFP构造（见下文）。我们还使用这些结构来验证ACh神经元的拯救寻径不影响GABA神经元寻径，反之亦然（数据未显示）。

转基因

UNC-5表达。

P（P）unc-47号机组：UNC-5和Pacr-2型：：UNC-5转基因通过放置启动子片段构建unc-47号机组[GABA囊泡运输车(McIntire等人，1997年)]或acr-2型在DA中表达的烟碱乙酰胆碱受体亚单位和DB运动神经元(Hallam等人，2000年)]在Xba公司我和Nco公司pYZ108的I，就在上游UNC-5拯救cDNA(Hamelin等人。，1993)，分别生成pAR27.6和pAR28.6。这些质粒是与含有罗尔-6sd，作为共转化标记(Kramer等人，1990年)（均为40 ng/μl），并建立Rol线。这些阵列已集成使用X射线照射，导致克2【P】unc-47号机组：：UNC-5; 罗尔-6sd]和4克【P】acr-2型：：UNC-5; 罗尔-6sd],分别是。

自噬体标记物。

通过交换获得单体红色荧光蛋白（mRFP）-LGG-1的表达mRFP的GFP编码序列(坎贝尔等人，2002年)在GFP-LGG-1构造中(Melendez等人，2003年)，使用千磅我和Nhe公司I位点（导致连接子短7个残基与GFP和LGG-1之间的连接子相比），生成质粒pAR40.1。pAR40.1是用……铸造罗尔-6sd（均为40纳克/μl），Rol品系已建立。该阵列使用X射线辐射集成以产生16克[mRFP-LGG-1；罗尔-6sd]. 要构建标记的beclin构建BEC-1-GFP和BEC-1-mRFP，我们将GFP或mRFP融合到CBEC-1蛋白的末端，由秀丽线虫贝克林-1同源物T19E7.3。GFP或mRFP放置在C端的框架内工程引脚A1和Nhe公司I限制网站Ce-bec-1型编码序列。整个BEC-1-GFP和BEC-1-mRFP编码序列加上额外的2500 bpCe-bec-1型5′侧翼DNA和900 bpCe-bec-1型3′侧翼DNA为置于基于pBluescript的向量中，介于速度我和Bsi公司W1位点，分别产生pAR37.10和pAR39.1。这些将质粒与pEK1（均为40纳克/μl）共注射到第15行蠕虫来生成克Ex115[例如（BEC-1-GFP；林-15（+）]和克Ex129[例如（BEC-1-mRFP；林-15（+）]数组。UNC-38-GFP转基因由将GFP插入第三和第四跨膜结构域（J.L.Bessereau，未发表的观察结果）。

其他转基因。

本研究中使用的其他转基因阵列如下：牛津12【P】unc-47号机组：：GFP](McIntire等人，1997年);2014年6月【P】acr-2型：：GFP](Hallam等人，2000年);6月1日【P】unc-25号机组：：SNB-GFP；林-15（+）] (哈勒姆和金，1998); GFP-LGG-1阵列5/3(Melendez等人。，2003); 和牛津Is22[UNC-49-GFP；林-15（+）](Bamber等人。，1999).氧化硅22包含全长unc-49号机组在框架内插入GFP的基因组拯救片段UNC-49B亚单位的细胞内环路。UNC-49B-GFP平移融合蛋白质完全拯救了不协调的表型unc-49（e407）和定位于突触(Bamber等人，1999年).

抑制内吞作用

解决内吞作用在贩运GABA中的作用A类受体自噬体，我们使用FY375菌株[unc-5（e53）；牛津Is22]和542财年[rme-8（1023ts）；unc-5（e53）；牛津Is22]. 我们在允许温度（15°C）。我们首先同步了这两个种群通过从混合种群中分离鸡蛋并将其放在盘子上进行菌株筛选在15°C时缺乏细菌，在第一个幼虫阶段就停止生长。这些然后将动物转移到15°C的细菌培养皿中，并允许生长至L4幼虫期。L4幼虫用S-碱性，用移液管至平板，在26°C下平衡。每次点，7、14、26、32、40、55和72.5小时后，动物被转移到26°C固定，并计数含有UNC-49-GFP的自噬体。已执行计数基因型盲。使用双向方差分析对各组进行分析，使用事后（post-hoc） t吨测试以比较每个时间点的显著差异(n个=每个时间点10，除了t吨=0，英寸只有六种蠕虫是野生型rme-8型已计算）。

电子显微镜

之前的研究提供了一系列薄片(Hedgeock等人，1990年)8个野生型和9个unc-5号机组成人在横向上覆盖中体区域。全部动物被浸泡固定，嵌入Epon中，并用重金属进行后染色以平行的方式(Hedgeock等人，1990年；霍尔，1995年). 在飞利浦上查看部分（德国亚琛）CM10电子显微镜，收集胶片上的显微照片。电影底片被扫描到Adobe Photoshop（Adobe Systems，San Jose，CA）以获取数据分析和演示。有效收集出席或缺席的统计信息在自噬体中，大肌肉包涵体在显微镜屏幕上被刻划中体区的间隔薄片，寻找～0.5的细胞器μm或更大。肌肉肌节的尺寸作为内部参考，不依赖显微镜放大，快速测量细胞器大小。

染色和光学显微镜

所有的表观荧光成像都是在蔡司（德国奥伯科欣）Axioskop 2上进行的配备普林斯顿仪器数字相机（Roper Scientific，新泽西州特伦顿）。使用Endow GFP过滤器组、mRFP和Alexa可视化GFP使用四甲基罗丹明异硫氰酸盐（TRITC）过滤器对氟594进行可视化套件（Chroma Technology，Rockingham，VT）。对瘫痪的蠕虫进行实时成像30μ米叠氮化钠。或者，为了减少肠道自身荧光，蠕虫在成像前被修复(Bettinger等人。，1996).角色-9有时包括在遗传背景中使身体形态扭曲，以帮助拍摄神经索。当量化UNC-49-GFP的细胞内积累，我们计数了更大的绿色荧光物体直径大于～0.5μm，并定期验证其不可见使用TRITC过滤器，将其与自荧光肠道颗粒区分开来。关心是认为双标记细胞器（即UNC-49-GFP和mRFP-LGG1）远离肠道，以确保它们不是肠道颗粒。用于免疫染色，抗UNC-49抗体(加里和贝塞罗，2003年)已使用稀释度为1:500。使用下述方案进行染色：Bettinger等人（1996年）除了孵化后使用二级抗体，用缓冲液B清洗标本1–3小时，转移到SlowFade平衡缓冲器中15分钟，并安装在SlowFade中安装介质（SlowFade套件；Invitrogen，Carlsbad，CA）。Alexa Fluor 594-共轭使用山羊抗兔IgG（重链和轻链）二级抗体（Invitrogen1:1000。如前所述进行抗-UNC-29染色(Gally等人，2004年). 共聚焦图像拍摄于奥林巴斯光学（日本东京）FV300，使用60×油浸物镜。图像使用Adobe Photoshop进行处理。

电生理学

如前所述进行电生理分析(里士满和约根森，1999年). 简言之，动物用氰基丙烯酸胶固定，并露出外侧角质层切口腹侧或背侧内侧体墙肌肉。肌肉记录是在使用EPC-10接线灯放大器，并在1 kHz下数字化。数据由Pulse获取在Dell计算机（Dell）上运行的软件（HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，德国）德克萨斯州Round Rock计算机公司）。镀液含有以下成分（in米米)：150氯化钠、5氯化钾、5氯化钙2，1氯化镁2，10葡萄糖，和15 HEPES，pH 7.35（～340 mOsm）。移液管溶液含有以下成分（in米米)：120 KCl，20 KOH，4 MgCl2，5 Tris，0.25 CaCl2, 4NaATP、36蔗糖和5 EGTA，pH 7.2（～315 mOsm）。后续分析和使用Pulsefit（HEKA Elektronik）和Igor Pro（WaveMetrics，Lake）进行绘图俄勒冈州奥斯韦戈）。GABA和左旋咪唑在500浓度下被压力喷射μ米在记录室的恒定灌注期间持续100ms。

结果

破坏突触后肌细胞神经支配的策略

蠕虫背部的体壁肌肉通常接受来自抑制性GABA运动神经元和兴奋性ACh运动神经元。运动神经元细胞体位于蠕虫的腹侧。因此，要与背部肌肉，运动轴突必须先向后生长(图。1A类). 一旦到达背侧，它们就会纵向伸展在一个叫做背神经索的束中(图。1A–C)与背部肌肉进行突触接触(怀特等人，1986年). 背侧轴突的生长需要netrin受体，由unc-5号机组基因（相关列表秀丽线虫基因及其功能和人类同源物，参见表1). 通过控制哪些运动神经元表达netrin受体（参见材料和方法），我们能够控制哪种运动神经元与背部肌肉进行突触接触。为了确定突触前接触影响GABAA类受体定位模式，我们使用GFP标记秀丽线虫GABA公司A类受体亚单位（UNC-49B-GFP，此处称为GABAA类R-GFP）。GABA公司A类R-GFP通常形成簇对侧抑制性突触前终末(图。1D类) (Bamber等人，1999年；加里和贝塞罗，2003年).

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正常神经肌肉解剖秀丽线虫.A类，正常图示C、。雅致神经肌肉系统。ACh（白色）和GABA（黑色）运动神经元在背侧体壁肌肉（灰体）上形成突触（三角形）。细胞体是腹侧，所以轴突必须背向生长（箭头）才能到达背部肌肉（神经元腹肌的神经支配（未显示）。B,C，背神经索含有GABA和ACh轴突。轴突用GFP可视化，在特异性启动子的控制下表达GABA公司(B)和ACh(C)神经元（参见材料和方法）。D类，正常GABA的突触定位A类背部肌肉中的R-GFP。比例尺，5.0微米。

表1。

的摘要秀丽线虫基因功能和同源物

秀丽线虫 基因酵母同源物哺乳动物同源物
Axon寻路
    unc-5号机组Netrin受体，背侧轴突指导一Unc5H1（取消5H1）Netrin受体，轴突寻路b条,c（c）
Unc5H2型
Unc5H3型
神经递质受体
    unc-49号机组GABA公司A类受体d日,e（电子）GABA公司A类R（右）
    unc-29号机组ACh受体亚单位e（电子）,（f）AChR、，非α亚基
    unc-38号机组乙酰胆碱酯酶受体亚单位e（电子）,（f）AChR，α-亚单位
内吞作用
    rme-8型氯菊酯脱衣蛋白，内吞作用克RME8系列体内贩运小时
自噬
    unc-51号机组丝氨酸-苏氨酸激酶，自噬所必需我 附件1 自噬的诱导j个ULK1系列函数未报告，绑定GABARAP公司k个
    贝克-1磷脂酰亚单位肌醇-3激酶复合物，自噬所必需小时 附件6 自噬和空泡蛋白质分类我贝克林1自噬，肿瘤抑制器我
    lgg-1型自噬所需小时 附件8 自噬体相关，自噬所必需的我生命周期3自噬米,n个
GABARAP公司GABA公司A类R（右）贩卖人口我,o个
大门-16高尔基体内运输我,第页

突触前神经支配影响GABAA类受体聚集和贩卖人口

我们首先研究了GABA突触前终末在建立突触后的作用GABA公司A类受体模式。我们研究了GABA神经元不能参与的蠕虫投射到背侧体壁肌肉；因此，背索只包含ACh轴突(图。2A类,D类,G公司). GABA公司A类受体在这些动物中并没有形成簇，而是出现了局限性扩散到肌肉细胞表面(图。2J型). 因此，GABA突触前终末对于GABA公司A类受体聚集秀丽线虫，与一致以前的结果(Gally和Bessereau，2003年).

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神经支配丧失影响GABAA类受体聚集和贩运。A–C，背部肌肉图解缺少电机输入。D–F型，GFP表达于GABA突触前神经元。G–I型，GFP表达于ACh突触前神经元。J–L型，突触后GABA公司A类R-GFP。A类,D类,G公司,J型GABA背侧寻路被破坏，并且肌肉细胞缺乏GABA输入。B,E类,H（H）,K（K）ACh背部寻路中断，肌肉电池缺少ACh输入。C,F类,我,L（左）ACh和GABA的背部寻路均被中断，背部肌肉缺乏所有的突触输入。箭头输入D类,H（H）、和我表示轴突背侧短伸距离，但不要到达背索。箭头在J型和L（左）表示背中线。比例尺，5.0微米。

确定GABA突触前终末是否足以聚集GABA公司A类受体，我们研究了ACh突触前终末是否必修的。当背神经索只包含GABA轴突而不包含ACh轴突时(图。2B,E类,H（H）)，突触后GABA的聚类A类受体正常(图。2K（K）). 我们证实了这些集群与GABA相反突触前终末使用GABA突触小泡标记（数据未显示）。这些数据表明ACh突触前终末不是必需的，GABA终末单独向突触后细胞提供信号以启动突触GABAA类受体聚集。

测试GABA和ACh运动轴突是否对突触后有多余影响GABA公司A类受体，我们检测了没有神经元向背面投射的蠕虫(图。2C,F类,我)并且因此，背部肌肉无神经支配。GABA公司A类非神经化细胞中的受体堆积在大的细胞内细胞器中(图。2L（左）). GABA的数量A类含有R-GFP非神经支配肌肉的细胞器远高于神经支配肌肉这两种类型都存在或存在于接受正常突触前接触的腹肌中(表2). 这些结果表明突触前接触抑制细胞内GABAA类受体积累。我们得出突触前终末在GABA突触发生中起两种作用的结论。GABA神经元特别要求组织GABAA类受体进入突触簇，任何一种运动神经元的突触前接触都会阻止GABAA类受体从细胞内积累。

表2。

GABA公司A类R-GFP在细胞内细胞器中的积累

突触前接触背部肌肉每个蠕虫的器官
正常（野生型蠕虫）1.9 ± 0.3(n个= 66)
仅ACh5.1 ± 1.1(n个= 15)
仅GABA4.4 ± 1.6(n个= 18)
不存在（netrin受体缺陷突变体；unc-5号机组)28.7 ± 1.6(n个= 65)*
88±2%背部(n个=15）
不存在，自噬缺陷(unc-5号机组；unc-51号机组双突变体）4.5 ± 0.6(n个= 50)

*第页<0.0001，与所有神经支配的肌肉和自噬缺陷的无神经肌肉；n个是分析的蠕虫数量。

这一发现表明突触前神经元提供了一个信号来调节突触后GABA的贩运A类受体。一种可能性是突触前细胞释放的神经递质起到这种信号的作用。为了测试这个假设，我们检验了GABAA类R-GFP在多种突变体中的定位神经传递缺陷（补充表S1，图S1，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 我们首先确定不需要神经递质释放装置。GABA公司A类R-GFP集群正常情况下，不会在细胞内积累缺陷突变体，以释放突触小泡(unc-13号机组和snb-1型)或致密核囊泡(unc-31号机组). 其次，我们确定ACh和GABA都不是需要发送信号。ACh神经元的接触仍然阻止细胞内GABA积累A类ACh合成缺陷或突触后R-GFPACh受体功能被消除。同样，GABA神经元的接触仍然可以防止细胞内GABAA类GABA合成缺陷时R-GFP积累。总之，这些结果提供了证据，证明突触前信号调节GABA公司A类受体运输不是一种神经递质或神经肽。它是突触前细胞更有可能表达细胞表面分子或分泌作为信号的生长因子或细胞外基质蛋白。

GABA公司A类受体在自噬体中积聚

鉴定GABA所在的细胞内细胞器A类受体积累在无神经细胞中，我们检查了缺乏netrin受体[unc-5号机组突变体(刺猬等人，1990年)]. 在这些蠕虫中，运动神经元不能向后延伸轴突，因此背部肌肉不接受突触输入。我们观察到大量直径从～0.5μm到2μm的结构，以倍数为界非神经支配肌肉的膜(图。三A类,B). 这种形态是典型的自噬体。我们发现早期自噬体的例子[～0.5μm直径，以同心膜环为界(图。三A类)]和晚期自噬体[含有均匀的电子不透明基质，典型的自噬体与溶酶体融合(图3B)]. 这些结构是与野生相比，netrin受体缺陷蠕虫背部肌肉增加了5倍类型(图3C). 因此，缺乏神经支配似乎会导致自噬增加。肌肉的超微结构是否则正常。我们没有观察到表明自噬的电子密度损失细胞死亡(伯奇，2001年)，我们没有观察到衰老过程中发生的变性变化，如细胞质或肌节收缩秀丽线虫肌肉细胞(Herndon等人al.，2002年)(图。三D类,E类).

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无神经支配的肌肉细胞自噬增加。A类,B，电子无神经支配的大鼠背部体球肌自噬体的显微照片netrin-缺陷(unc-5号机组)蠕虫。自噬体通常构成含有复杂内容物的大型膜结合细胞器，包括膜层内部。早期典型的形态学(A类)而且很晚了(B)观察到自噬体或自噬溶酶体。C,netrin受体缺乏时自噬明显增强(unc-5号机组)突变体，主要位于背部肌肉。肌角蛋白体积和细胞质体积与正常人相当(D类)和无神经支配的(E类)背部肌肉，表明缺乏神经支配不会导致肌肉细胞死亡或退化。箭头显示肌节和细胞质之间的边界。比例尺，0.1μm。*第页与野生型相比<0.05，作者：Mann–WhitneyU型测试；n个=48和56个肌肉象限野生型（wt）和unc-5号机组突变体。

突触前接触的缺乏和自噬增加之间的相关性表明GABAA类非神经化细胞中的R-GFP阳性细胞器可能是自噬体。为了验证这个想法，我们首先确定GABA公司A类R-GFP阳性细胞器依赖于自噬机制。这个秀丽线虫自噬需要UNC-51蛋白(表1) (梅伦德斯等人2003年). 我们观察到GABA的数量大大减少A类R-GFP-阳性当UNC-51蛋白有缺陷的(图4A类,表2). 因此，自噬机制是必需的细胞器形成。其次，我们测试了细胞内GABA公司A类共定位非神经化细胞的R-GFP荧光带有自噬体标记。GFP标记的LGG-1和beclin-1蛋白可以用于观察自噬体体内在里面C、。雅致和哺乳动物细胞(Yue等人。，2002；Melendez等人，2003年). 我们标记了这些蛋白与mRFP结合生成两个红色荧光自噬体标记，称为mRFP-LGG-1和beclin-1-mRFP（见材料和方法）。GABA公司A类R-GFP和mRFP-LGG-1在细胞内共定位非神经支配肌肉中的细胞器(图。4B). 然而，mRFP-LGG-1荧光的高背景水平肌细胞细胞质中的共定位难以量化。GABA公司A类R-GFP和beclin-1-mRFP也在无神经肌肉(图4C).Beclin-1-mRFP产生的背景荧光较少，我们能够确定100%GABAA类R-GFP阳性细胞器对beclin-1-mRFP。

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GABA的证据A类R-GFP通过自噬体。A类、GABAA类含有R-GFP的细胞器在自噬缺陷突变背景下非神经化肌肉中不形成(unc-5；unc-51型双突变体）。GABA公司A类含有R-GFP细胞器也含有自噬体标记mRFP-LGG-1(B)和beclin-1-mRFP(C).D类,GABA公司A类受体免疫反应与beclin-1-GFP相关非神经化肌肉细胞中不过度表达的荧光GABA公司A类R-GFP，表明内源性GABAA类受体流量到自噬体。E类，缺少控制蠕虫内源性GABAA类受体(unc-49型突变体），非神经化肌肉细胞中的自噬体不含GABAA类受体免疫反应。箭头在A类指出背中线的位置。比例尺：A类, 5.0微米；B–E类，1.0微米。

为了证明向自噬体的贩运不是由GFP标记的GABAA类受体，我们还分析了非神经激活的使用抗内源性GABA抗体的肌肉A类受体(加里和贝塞罗，2003年). 我们使用beclin-1-GFP在本实验中显示自噬体，因为它提供了最低的我们测试的任何标记的背景。我们确定33±8%的自噬体富含GABAA类受体无神经细胞的免疫反应(n个=10条蠕虫，94个细胞器总计）(图4D类). 相反，缺乏内源性GABA的控制蠕虫的自噬体A类受体（即。，unc-49号机组突变体）没有表现出任何增加GABA公司A类受体免疫反应性(图4E类). 因此，贩运GABA公司A类自噬体受体不是GFP的伪影标记或过度表达。然而，过度表达似乎会导致GABA积累A类自噬体中的受体，因为GABA公司A类R-GFP可以检测到10倍以上自噬体比内源性GABA能A类R（右）免疫反应。

上述结果为降解性贩运GABA公司A类受体通过自噬途径。是吗在正常生理条件下发生？我们寻求的是beclin-1-GFP与抗GABAA类蠕虫中的R免疫反应神经肌肉支配完整。我们偶尔在肌肉细胞中检测到细胞器GABA均为阳性A类受体免疫反应和beclin-1-GFP（10个蠕虫中的7个细胞器）(图5).这一结果表明GABAA类受体可以运输到自噬体正常肌肉也是如此，但该途径受到与突触前终末。

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GABA公司A类受体通过神经支配的肌肉中的自噬体。GABA公司A类受体免疫反应与beclin-1-GFP相关用功能性netrin受体正确地支配蠕虫的肌肉细胞。比例巴，1.0μm。

GABA公司A类从细胞表面到自噬体的受体交通

接下来我们研究了GABA的机制A类受体贩运至自噬体可以更好地理解突触前信号在突触后的模式GABA公司A类受体。一种可能性是GABAA类受体到达细胞表面正常，但通过内吞作用去除后，会进入自噬体，提示突触前接触调节受体表面稳定性。可替换地，GABA公司A类当缺乏神经支配时，受体可能无法正确组装作为非功能聚集体直接从内质向自噬体的转运网，表明突触前接触调节受体组装。要区分在这些可能性中，我们首先使用一个突变体研究了内吞作用具有温度敏感性内吞缺陷。细胞内吞需要RME-8蛋白(Zhang等人，2001年；Chang等人，2004年). RME-8的一种突变形式在15°C，但变得不稳定，并在26°C时降解(Zhang等人，2001年). 在这种突变存在的情况下，细胞内GABA公司A类26°C时，非神经支配肌肉中的R-GFP荧光消失。当RME-8正常时，相同的温度变化没有影响(图6A类). 这一结果表明GABA公司A类自噬体受体需要内吞作用，这意味着受体被正确组装并导出到细胞表面，然后再进入自噬体。直接研究GABA的表面表达A类受体，我们进行了电生理记录。GABA反应的振幅与神经细胞相比，无神经支配的背肌减少了30%(图6B). 尽管从统计角度来看这一下降幅度不大，表明GABAA类受体尽管失去了突触前神经，但合成、组装和膜插入都是正常的联系人。此外，非神经化细胞中的GABA电流恢复正常当自噬被unc-51号机组突变(图6B)表明自噬降解，而不是降低GABAA类受体合成，负责减少30%。这些结果提供了证据，证明自噬途径可以发挥作用减少GABAA类受体表面表达与突触前接触阻滞GABA公司A类受体从细胞表面转运到自噬体。

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GABA公司A类受体通过以下方式从非神经细胞表面去除贩运到自噬体。A类，累计GABA公司A类自噬体中的R-GFP需要持续的内吞作用。在蠕虫中随着温度敏感性内吞缺陷（开放符号，虚线）GABA数量A类含R-GFP的自噬体在动物从允许温度（15°C）转变为限制温度（26°C）。在正常内吞的对照蠕虫中未观察到这种减少（填充符号，实线）。内吞缺陷与对照之间的差异在14小时和随后的所有时间点，菌株都是显著的(第页< 0.05;n个=每个时间点10，除了t吨=0，其中n个=6（对于控制应变）。B，GABA电流减少自噬导致的背侧细胞。左侧痕迹和条形，野生型；中间记录道和bar，netrin缺乏(unc-5号机组突变体）；右轨迹和条，netrin缺乏和自噬缺陷(unc-5；unc-51号机组双重的突变体）*第页<0.05表示电流显著与正常神经支配的背侧细胞相比，无神经支配的背部细胞减少背侧细胞或无神经支配的自噬缺陷背侧细胞（单向方差分析）。误差条为SEM。

乙酰胆碱受体不运输到自噬体

最后，我们检测了非神经细胞中的乙酰胆碱受体，以确定自噬是降解神经递质受体的一般机制选择性用于GABAA类受体。秀丽线虫身体-墙壁肌肉表达两种烟碱ACh受体。其中一种对胆碱能敏感激动剂左旋咪唑，含有UNC-29和UNC-38亚单位(里士满和约根森，1999年). 我们表达了GFP标记的UNC-38亚单位，产生GFP标记的乙酰胆碱受体（AChR-GFP）。AChR-GFP本地化腹侧和背侧神经索(图。7A类). 在缺乏内酯的蠕虫中，只有在腹神经索。我们没有在背中线发现突触点，这与这些突变体中没有背索一致。我们也没有观察到背肌细胞内荧光(图。7B) (n个=40条蠕虫），表明AChR-GFP不会在自噬体中积累。我们还鉴定了另一个亚单位UNC-29，使用抗UNC-29抗体(Gally等人，2004年).在无神经肌肉中，GABAA类R-GFP荧光在自噬体，但UNC-29免疫反应没有(图。7C) (n个=15个蠕虫）。UNC-29免疫反应为在GABA附近观察到A类沿着腹索的R-GFP簇，表明抗体染色在本实验中是成功的。因此，这些AChR不会在无神经支配的肌肉细胞的自噬体中积累。确认他们是仍然是合成的，我们记录了左旋咪唑电流(图。7D类). 神经支配和非神经支配的电流具有可比性背部肌肉，表明缺乏神经支配不会影响这些肌肉的水平ACh受体。此外，与GABA电流不同，左旋咪唑电流没有增加当使用unc-51号机组突变。因此，在相同条件，GABAA类受体向自噬体运输，而ACh同一细胞中的受体没有，这表明自噬下调表面表达GABAA类选择性受体。

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乙酰胆碱受体不与非神经支配肌肉中的自噬体相连细胞。A类,B,GFP标记的ACh受体在体墙肌肉中表达的定位模式。A类、在具有功能性netrin受体的蠕虫体内，以及因此，腹侧可见正常的神经肌肉神经支配AChR-GFP（左）和背（右）神经索。脊髓腹侧细胞荧光（开放箭头）可能是神经元(怀特等人al.，1986年).B，在缺少功能的蠕虫中netrin受体，因此缺乏背部运动神经支配，AChR-GFP是沿腹索可见（左侧），但在任何一个背侧均未观察到突触点或细胞内细胞器（右）。C，另一ACh受体亚单位的免疫反应性，UNC-29不定位于自噬体。在netrin-defective蠕虫中，GABA公司A类R-GFP沿腹神经索可见背肌中的自噬体（左）。UNC-29免疫反应也可见沿着腹神经索，但不在自噬体（中间）。合并的图像显示GABA的定位A类R-GFP和UNC-29定位到相邻突触，但在自噬体中没有共定位（右）。D类，对ACh的电生理反应激动剂在有神经细胞和无神经细胞中是相同的，并且当自噬被阻断(第页>0.05，单因素方差分析）。左轨迹和酒吧，野生型；中间迹线和条，netrin缺乏(unc-5号机组突变体）；右迹线和bar、netrin缺陷和自噬缺陷(unc-5；unc-51号机组双突变体）。误差线为SEM。比例尺，5微米。

讨论

在这项研究中，我们描述了突触前神经支配在突触后GABAA类受体簇。GABA公司A类受体定位模式进行了比较秀丽线虫身体上的肌肉与GABA和ACh运动神经元缺乏正常接触。结果表明：突触前神经支配起着两种作用。首先，它促进GABAA类受体表面稳定性。受体从细胞表面运输到自噬体进行降解当突触前接触缺失时，表明突触前神经元通常提供阻止自噬的信号。这种信号存在于GABA和ACh运动神经元和不依赖于突触小泡的释放。第二，神经支配组织GABAA类受体进入突触后簇。聚集是由GABA神经元特异性诱导的，聚集信号与突触小泡有关(加里和贝塞罗，2003年). 我们的研究结果证实了对哺乳动物的研究显示GABA末端诱导GABA的神经元A类受体突触聚集，但非GABA终端也可以发挥作用(Levi等人。，1999；Rao等人，2000年；Brunig等人，2002年；Christie等人，2002年；Studler等人。，2002). 它们还提供了两种新颖的见解。第一，突触前神经支配独立监管GABAA类受体表面稳定性和突触聚集。其次，自噬可以作为GABA的选择性降解途径A类受体。

尽管自噬在压力条件下经常上调，但观察到自噬无神经支配秀丽线虫肌肉似乎与典型的细胞应激反应。自噬的一个主要功能是通过降解和循环细胞质和细胞器(克利恩斯基和Emr，2000年). 然而，我们观察到背部肌肉中的自噬远远多于腹侧肌肉，尽管动物两侧的细胞可以平等地获得营养。因此，自噬不太可能是对可能的饥饿的第二反应运动轴突寻路缺陷的不协调蠕虫。的另一个重要功能自噬是执行程序性细胞死亡(Gozuacik和泡菜，2004). 然而，我们没有观察到电子密度的损失具有自噬细胞死亡的特征，非神经化细胞不会死亡。自噬我们观察到它与失神经哺乳动物骨骼的萎缩也不同肌肉。肌肉萎缩不是自噬，而是由泛素蛋白酶体系统(Trout等人，1981年；Lecker等人，1999年). 相反非神经支配的自噬秀丽线虫肌肉可能会退化通常并入突触的突触后蛋白质。自噬可以是由蛋白质聚集体刺激，如发生在蛋白质构象紊乱中亨廷顿病和帕金森病(Ravikumar等人，2002年). 无神经支配的自噬秀丽线虫肌肉细胞可能受到形成异位突触支架蛋白的刺激细胞质聚集是因为它们没有正常的组装位点。一次自噬体的形成，它们可能是GABA的运输目的地A类含有受体的内吞囊泡，因此可以协同降解细胞质和膜结合突触后蛋白。

我们的结果证明了自噬在细胞表面降解中的新作用受体。我们发现一个折叠良好且功能齐全的受体可以被贩运从细胞表面到自噬体。此外，该途径被选择性使用：ACh受体在相同的细胞中表达，具有相似的结构和亚细胞本地化为GABAA类受体，但在相同的条件。自噬对表面表达受体的选择性降解对调节细胞功能的多方面可能很重要。例如，有人提出，自噬通过选择性降解抑制癌症进展细胞表面生长因子受体等促生长蛋白(Qu等人，2003年；Yue等人al.，2003年). 我们的结果通过证明正常功能性细胞表面受体可以选择性地运输到自噬体。

这些发现的一个重要含义是自噬可能是一种控制机制神经元兴奋与抑制的平衡。这种平衡取决于抑制性和兴奋性突触的强度。在抑制性突触处，GABAA类受体通过内吞作用不断内化。当GABAA类受体循环到质膜，突触强度得以维持。当他们进入降解途径，突触强度降低(基特勒和莫斯，2003年). GABA自噬A类受体满足两个重要条件作为调节兴奋-抑制平衡机制的标准。首先，自噬是GABA的降解途径A类受体：受体由于自噬和GABA，表面水平降低A类受体当新受体从质膜涌入时，自噬体逐渐消失被阻止。第二，自噬对GABA具有选择性A类受体而非ACh受体，所以它可以在离开兴奋性突触的同时控制抑制性突触强度强度不受影响。GABA公司A类受体自噬通常由突触前信号。调节该信号通路提供了一种可能的机制控制激发-抑制平衡。

最后，我们的结果证明了GABA的膜动力学A类受体转运和自噬在生化水平上可能相似。我们展示了GABA中自噬蛋白的参与A类受体降解贩运。其他人已经证明自噬蛋白参与GABAA类受体出口到质膜。具体来说，GABAA类受体相关蛋白（GABARAP）促进GABA贩运A类高尔基体受体质膜(Leil等人，2004年). GABARAP是一个酵母自噬蛋白Atg8的同源物，这两种蛋白都经历C末端脂质氧化，可与自噬体膜结合(Kabeya等人，2004年). 自噬蛋白在GABA的生物合成和降解A类受体增加了以下可能性GABA公司A类受体转运和自噬使用重叠生化机制。

脚注

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款MH64699和NS43345（B.A.B.）、RR12596（D.H.H.）和NS041477（J.E.R.），白厅基金会，以及初级儿童医疗中心基金会（犹他州）。A.M.R.得到了NIH遗传学培训拨款GM007464（犹他大学）。我们感谢秀丽线虫遗传学中心提供菌株，Y.Jin提供juIs14阵列，B.Levine提供GFP-LGG-1质粒和菌株，B.Grant提供rme-8突变体，J.-L.Bessereau，用于提供抗UNC-49抗体、抗UNC-29抗体、，以及UNC-38-GFP构建，B.Bass和S.Mango慷慨提供访问设备，J.Culotti提供unc-5 cDNA，K.Schuske，S.Mango提供关键阅读，和约根森实验室进行菌株和有益的讨论。

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文章来自神经科学杂志由提供神经科学学会