神经科学杂志。2012年11月28日;32(48):17186–17196。
突触前功能障碍触发α-突触核蛋白的积累
,1,4 ,1,4,5 ,2 ,三 ,三 ,1,4 ,1,4 ,1 ,6 ,1 ,2 ,三 ,4和
1,4,5 中田康夫
1神经科,
4日本神奈川县胜原北佐大学医学院神经再生医学部252-0374,
安田拓夫
1神经科,
4日本神奈川县胜原北佐大学医学院神经再生医学部252-0374,
5大阪大学医学研究生院神经内科,日本大阪,邮编565-0871
Tomoko Nihira先生
1神经科,
4日本神奈川县相模原市北陆大学医学院神经再生医学科252-0374,
Hideki Hayakawa先生
1神经科,
4日本神奈川县胜原北佐大学医学院神经再生医学部252-0374,
片冈Masakazu Kataoka
6日本长野市长野市新竹大学工程学院环境科学与技术系380-8553
吉野美久(Yoshikuni Mizuno)
4日本神奈川县胜原北佐大学医学院神经再生医学部252-0374,
Hideki Mochizuki先生
1神经科,
4日本神奈川县相模原市北陆大学医学院神经再生医学科252-0374,
5大阪大学医学研究生院神经病学系,大阪住地,565-0871,日本
1神经科,
2解剖,和
三生物化学和
4日本神奈川县胜原北佐大学医学院神经再生医学部252-0374,
5大阪大学医学研究生院神经病学系,大阪住地,565-0871,日本
6日本长野市长野市新竹大学工程学院环境科学与技术系380-8553
通讯作者。贡献者作者贡献:Y.N.、T.Y.和H.M.设计的研究;Y.N.、T.Y.、M.F.、S.Y.、MI.、T.N.、H.H.和A.K.进行了研究;Y.N..、T.Y.、M.F.、S.Y.、M.I.、T.N.、H.H.、A.K.、M.K.、M.N.、H.S.、M.T.、Y.M.和H.M.分析数据;Y.N.和T.Y.写了这篇论文。
2012年5月8日收到;2012年8月28日修订;2012年10月5日验收。
版权©2012作者0270-6474/12/3217186-11$15.00/0 摘要
路易体痴呆患者的病理检查发现突触前终末存在异常的α-突触核蛋白(α-Syn)聚集体。αSyn参与可溶性蛋白的调节N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)复合物。重要的是,α-Syn-转基因小鼠和帕金森病患者的尸检表明SNARE蛋白在突触前终末的异常分布。在本研究中,我们研究了SNARE功能障碍对内源性αSyn使用的影响快照25S187A/S187A突变小鼠。这些小鼠具有纯合敲入基因,编码不可磷酸化的S187A取代的25 kDa突触体相关蛋白(SNAP-25)。小鼠αSyn及其Ser的分布具有明显的年龄依赖性变化129-纹状体中异常肥大的谷氨酸能神经末梢磷酸化。电镜分析显示突触小泡异常浓缩,同时αSyn蛋白定位错误,位于谷氨酸能神经末梢的潜伏区。然而快照25S187A/S187A突变小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元未见异常。我们目前的研究结果表明,SNARE功能障碍是α-Syn定位错误和积聚的初始触发因素,可能是α-突触核蛋白病的重要病理机制。
材料和方法
老鼠。
本研究中描述的所有实验方案均由北大医学院动物实验与伦理委员会批准。根据以下详细描述的程序,产生了具有S187A突变的纯合SNAP-25敲除突变小鼠和野生型同窝对照小鼠:Kataoka等人(2011年)简言之,具有杂合子的胚胎干细胞快照25S187A型产生突变等位基因并将其微注射到C57BL/6N囊胚中,获得杂合突变小鼠。雄性嵌合体由C57BL/6N雌性小鼠繁殖而成。在该系回交13次后,纯合小鼠(指定为快照25S187A/S187A小鼠)通过在体外施肥。PCR检测基因型。在这个实验中,野生型和快照25S187A/S187A小鼠在11周龄(雌性)、54周龄(雌鼠)、60周龄(雄性)和61周龄(雌鼠)时使用。
组织加工。
深度麻醉小鼠(静脉注射250 mg/kg戊巴比妥钠)经心灌注PBS或2%多聚甲醛/2%戊二醛0.1米磷酸盐缓冲液(PB)。将大脑整体从颅骨中取出,并矢状切成两个大脑半球,用于共焦显微镜、细胞计数、电子显微镜、Western blotting和儿茶酚胺分析。常规电子显微镜的组织处理如下所述(参见常规电子显微镜)。对于共焦显微镜和细胞计数,小鼠半球脑块经心灌注PBS或2%多聚甲醛/2%戊二醛0.1米将PB固定在PBS中4%多聚甲醛中过夜,并浸没在含有30%蔗糖的PBS中直到下沉。使用低温恒温器(CM1850;Leica Microsystems)连续切割纹状体的冠状切片和黑质(SN)的整个口轮回范围,厚度为20μm。为了通过HPLC进行Western blotting和儿茶酚胺测量,使用我们小组之前描述的方法对经心灌注PBS的小鼠脑块进行解剖,以获得包括SN在内的纹状体组织和中脑组织腹侧部分(Yasuda等人,2011年). 完成解剖后,立即将切片冷冻在干冰上,并在−80°C下保存,直至分析。
共焦显微镜。
在含有0.05%Triton X-100(PBS-T)的PBS培养基中清洗自由漂浮部分。对于用2%多聚甲醛/2%戊二醛0.1经心灌注小鼠的切片米PB,用解放抗体结合(L.A.B.)溶液(Polysciences)培养,然后在PBS培养基中洗涤,然后按照与其他切片相同的方式处理。用阻断剂浸泡切片,然后与稀释试剂中溶解的一级抗体在4°C下孵育48小时。根据制造商提供的说明,使用载体M.O.M.免疫检测试剂盒(载体实验室)进行阻断和抗体稀释。随后,为了荧光显示抗原,将切片在含有异硫氰酸荧光素结合抗鼠或兔IgG和Cy3-结合抗鼠、兔、山羊或大鼠IgG二级抗体(1:200–500;Jackson ImmunoResearch Laboratories)的新鲜培养基中培养2小时。节段安装在载玻片上,盖上Vectashide安装介质(带或不带DAPI(Vector Laboratories))。使用配备ZEN 2009软件(蔡司)的共焦激光扫描显微镜(型号LSM510;Zeiss)以相同的设置拍摄图像。该软件用于图像处理(亮度和对比度调整),同样适用于野生型和突变型小鼠的图像。
常规电子显微镜。
在常规电子显微镜下,用2%多聚甲醛/2%戊二醛经心灌注0.1的小鼠大脑半球米PB在2%OsO中后固定4在水中清洗后,将样品在2%乙酸铀酰中培养30分钟。使用50、70、90和100%乙醇溶液和100%环氧丙烷脱水后,将样本嵌入Epon 812树脂(Nissin EM)中。使用徕卡超切UCT获得超薄切片,并用2%乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用H-7650电子显微镜(日立)拍摄电子显微照片。
免疫电子显微镜。
对于包埋前免疫电子显微镜,将矢状窦旁脑切片(60μm厚)与5%正常山羊血清、一级抗体和过氧化物酶或胶体金(1.4 nm)结合的二级抗体(Invitrogen)连续孵育。用3,3′-二氨基联苯胺或银增强试剂盒(HQ银;纳米探针)观察免疫反应。当将两种方法结合起来进行双重免疫电子显微镜检查时,首先对脑组织进行免疫过氧化物酶处理,然后进行银增强免疫金处理。免疫过氧化物酶和银增强免疫金标记的切片按上述方法进行电子显微镜检查。使用ImageJ 1.43软件量化神经末梢的大小(Wayne Rasband,NIH,Bethesda,MD;http://rsb.info.nih.gov/ij).
蛋白质印迹。
冷冻的纹状体和腹侧中脑组织在与蛋白酶抑制剂混合物组I(Calbiochem)和磷酸酶抑制剂混合物组V(Calbiochem)混合的冷冻CelLytic MT哺乳动物组织裂解/提取试剂(Sigma-Aldrich)中进行超声处理。样品离心(20000×克在4°C下持续10分钟),收集所得上清液并用于Western印迹。使用BCA蛋白质检测试剂盒(Pierce)测定所有样品裂解液中的蛋白质浓度。每个蛋白质样品(5–15μg)通过SDS-PAGE通过Compact-PAGE-twin(ATTO)进行拆分,然后使用电动BLOTmini(ATTO。在PBS-T中清洗膜,在含有50%ChemiBLOCKER(Millipore)的PBS-T内孵育1 h,然后在相同的新鲜培养基中与一级抗体孵育24 h。随后,将膜在含有辣根过氧化物酶相关抗鼠或兔IgG二级抗体(1:10000–20000;GE Healthcare)的新鲜培养基中培养2小时,然后使用GE Health ECL Plus Western Blotting检测系统(GE Healthcare)开发化学发光。使用LAS-4000(富士胶片)拍摄图像,并使用ImageJ 1.43软件量化信号强度。
SNARE复合物组件的分析。
通过在凝胶电泳前不煮沸样品的情况下进行的Western blotting中测量高分子量SDS抗性复合物的水平来评估SNARE复合物的组装(胡等,2002;Asuni等人,2008年;Sakisaka等人,2008年). 野生型和快照25S187A/S187A小鼠在SDS样品缓冲液中溶解。样品在室温下孵育20分钟,然后在室温下进一步孵育或在100°C下煮沸3分钟。随后,使用SDS-PAGE进行分析,然后使用兔抗SNAP25ct一级抗体(1:1000)进行免疫印迹(山森等人,2011年)和辣根过氧化物酶相关抗兔IgG二级抗体(1:10000;GE Healthcare)。除凝胶电泳前的样品制备外,所有程序均如上所述(见Western blotting)。
用HPLC测定DA及其代谢物的纹状体水平。
冷冻纹状体组织在50米范围内进行超声检测米醋酸钠。样品离心(20000×克在4°C下持续10分钟),并将所得上清液与等体积的0.2N高氯酸混合。样品离心(20000×克在4°C下保持10 min),并使用配备电化学检测(ECD-100;EICOM;施加电压,500 mV)和反相柱(TSK凝胶ODS-80TM;Tosoh)的HPLC系统,通过HPLC测量DA、高香草酸(HVA)和2-(3,4-二羟苯基)-乙酸(DOPAC)浓度。HPLC系统由一个泵(PU-980;Jasco;流速,1.0 ml/min)、自动进样器(AS-1550;Jasco)、柱烘箱(860-CO;Jasco)和脱气器(DG-2080-53 Jasco)组成。流动相由pH值为3.72的溶液组成,含有以下物质:0.085米不2人事军官4·2小时2O、 2.5米米1-辛烷磺酸钠盐,20μ米EDTA-2Na和15%甲醇。DA、HVA和DOPAC的浓度以纳摩尔/克组织重量为单位进行测定,结果相对于野生型小鼠的值进行表达。
细胞计数。
为了对致密部(SNpc)的DA细胞计数,对大脑的每四个20μm厚的连续切片进行TH免疫染色,并用甲酚紫(尼塞尔染色)进行复染(Furuya等人,2004年;Yasuda等人,2011年). 在野生型和快照25S187A/S187A老鼠以一种盲目的方式。用TH免疫染色法对细胞核最清晰可见的SNpc细胞进行计数,用Nissl染色法对核、细胞质和核仁进行显著染色。为了避免对形状异常的神经元进行重复计数,TH-和Nissl双阳性细胞仅在其细胞核和核仁被最佳可视化时进行计数。SNpc的吻端被确定为TH-和Nissl-双阳性细胞开始出现的水平(至前角水平尾部2.60 mm)(Franklin和Paxinos,2008年)SNpc的尾端被定义为可以观察到TH-和Nissl-双阳性细胞和动眼神经的水平(尾侧~3.80 mm到角水平)(Yasuda等人,2011年). 在SN的头端半区(距前角水平约2.60–3.16mm,尾侧),SNpc与内侧腹侧被盖区(VTA)的区别在于从大脑脚内侧端延伸的垂直线。在可以观察到内侧丘系的SN尾侧区域(~3.16–3.80尾侧至前角水平),SNpc和内侧VTA沿着内侧丘系分开。
统计分析。
所有数据均以平均值±SEM表示,不包括VGLUT1阳性神经区的数据,其表示为平均值±SDt吨进行试验(两组)。值为第页<0.05表示存在统计学显著差异。
结果
αSyn蛋白在大鼠纹状体突触前终末的异常分布快照25S187A/S187A老鼠
采用免疫组织化学方法,我们研究了内源性αSyn在大鼠纹状体中的分布快照25S187A/S187A小鼠,在Ser位置有不可磷酸化的丙氨酸187在SNAP-25蛋白中。杏仁核内5-羟色胺能和多巴胺能系统的神经递质释放显著减少,这与行为异常有关,包括自发惊厥发作(Kataoka等人,2011年). 纹状体切片的共焦显微镜分析快照25S187A/S187A与年龄匹配的野生型对照组相比,11周龄的小鼠表现出内源性αSyn的分布改变,类似于粗颗粒沉积物。这些变化在60周龄时尤为明显(下文中,54周龄或以上被指定为老年人)快照25S187A/S187A老鼠(A类,B类)表明了一种年龄依赖的渐进式再分配方式。
αSyn在纹状体突触前终末的定位改变及其蓄积快照25第187页/第187页老鼠。A类,B类、野生型纹状体切片和快照25S187A/S187A在出生后第11周和第60周对(突变)小鼠进行αSyn免疫染色(n个=每个基因型3个)。与野生型小鼠相比(A类1,B类1),αSyn在出生后11周和60周在突变小鼠中定位并形成粗颗粒沉积物(A类2,B类2). 变化的严重程度在出生后第60周更为显著。比例尺,10μm。C–H型对切片进行αSyn、突触素(SYP)或p-αSyn的联合免疫保护。共焦图像显示SYP的定位改变(D类2)和p-αSyn(G公司2)与αSyn阳性粗颗粒沉积物共定位(D类1,G公司1)在突变小鼠中(D类三,G公司三). 暴露于单一一级抗体的突变小鼠切片在治疗两种二级抗体后未观察到交叉反应(E类1,E类2;H(H)1,H(H)2)[即绿色可忽略不计(E类1)和红色荧光(E类2)分别用抗SYP抗体和αSyn抗体处理的切片]。比例尺,5μm。
接下来,我们用抗突触素抗体检测了αSyn在突触前终末的定位。老年人快照25S187A/S187A与野生型相比,小鼠表现出与αSyn相似的突触素免疫反应性变化(C类,D类). 此外,αSyn免疫阳性颗粒结构与突触素有很大重叠。这些结果表明,αSyn主要积聚在纹状体突触前终末。我们还分析了Ser的免疫染色模式129-磷酸化αSyn(p-αSyn),在人类α-突触核蛋白病中特异性发现(Fujiwara等人,2002年). 大多数αSyn阳性颗粒沉积物对p-αSyn呈免疫阳性,在野生型对照小鼠中检测到的数量可以忽略不计(F类,G公司). 这些结果表明αSyn在纹状体中的异常积累快照25S187A/S187A小鼠部分代表了人类DLB大脑中的病理变化。
αSyn和p-αSyn蛋白在大鼠纹状体中的异常积累快照25S187A/S187A老鼠
接下来,我们测量了老年人纹状体组织中的αSyn和p-αSyn蛋白水平快照25S187A/S187A老鼠。SNAP-25蛋白在快照25S187A/S187A老鼠(第页<0.0001)与年龄匹配的野生型小鼠进行比较,证实了我们之前的发现(Kataoka等人,2011年). 重要的是,αSyn(~1.5倍;第页=0.0047)和p-αSyn(~1.7倍;第页=0.0080)蛋白质水平高于年龄匹配的野生型小鼠(A类,B类). 这些结果表明αSyn和p-αSyn在突触前终末的异常分布(F类)这些蛋白质的增加反映了这一点。此外,高水平的VAMP-2(~1.3倍;第页=0.0011),但在老年人纹状体中未发现突触素和突触素快照25S187A/S187A老鼠(A类,B类)与从幼鼠制备的全脑裂解物相比快照25S187A/S187A老鼠(Kataoka等人,2011年).
纹状体内源性αSyn和p-αSyn的增加快照25S187A/S187A老鼠。A类,B类,在出生后第61周使用纹状体组织对突触标记蛋白进行蛋白质印迹。A类,两到五个独立实验的代表性Western blotting图像,每个实验涉及三只和五只野生型和快照25S187A/S187A(突变体)。与野生型相比,突变小鼠的αSyn、p-αSyn和VAMP-2谱带强度增加,而SNAP-25谱带强度降低。B类相对蛋白表达水平相对于负荷对照(β-微管蛋白)。使用ImageJ 1.43软件量化条带强度,并表示为相对蛋白表达水平。在突变小鼠中观察到α-Syn、p-αSyn和VAMP-2显著增加,SNAP-25显著降低。其他突触蛋白标记物没有显著差异。数据是两到五个独立实验的平均值±SEM,每个实验分别涉及野生型和突变型的三只和五只小鼠***第页<0.01(双尾t吨测试)。
突触前终末α-Syn分布的超微结构分析
为了详细研究突触前终末的形态学变化,我们使用电子显微镜分析了老年小鼠的纹状体。在快照25S187A/S187A与野生型小鼠小泡的正常均匀分布相比,小鼠大的兴奋性神经末梢中富含浓缩的突触小泡(A类,B类). 这些结果表明突触前神经递质释放可能减少快照25S187A/S187A老鼠。随后对突触中αSyn的免疫电镜检查显示,αSyn蛋白主要定位于老年人兴奋性突触前神经末梢扩大的潜伏区快照25S187A/S187A与野生型相比(C类,D类).
纹状体异常兴奋性神经末梢快照25S187A/S187A(突变)小鼠。出生后第60周野生型和突变型小鼠的典型电子显微照片(n个=每个基因型3个)。野生型小鼠兴奋性神经末梢的细胞质中均匀分布着突触小泡(A类)而它们在突变小鼠中紧密组装(B类). 注意突变小鼠中α-Syn(免疫金颗粒)亚细胞定位的改变,以及与增大的神经末梢潜伏区的质膜细胞质面相关的α-Syn-聚集体数量的增加(D类),但不适用于野生型小鼠(C类). 箭头,兴奋性神经末梢;箭头、活动区域的边缘。NT,神经末梢;Sp,树突棘。比例尺,500 nm。
SNARE复杂装配能力下降快照25S187A/S187A老鼠
鉴于此快照25S187A/S187A小鼠突触前终末SNAP-25蛋白表达显著下降,突触小泡异常分布(,B类),我们评估了在快照25S187A/S187A老鼠。通过在Western blotting中测量高分子量热敏SDS抗性复合物的水平来评估SNARE复合物的组装。如所示A类与野生型煮沸样品相比,SNAP-25非反应带在野生型和快照25S187A/S187A老鼠。然而,β-微管蛋白(负荷控制)归一化的高分子量的相对信号强度在快照25S187A/S187A小鼠与野生型小鼠的比较(第页= 0.00463) (B类). 这些观察结果表明,SNARE复合体在快照25S187A/S187A小鼠与野生型小鼠进行比较。这被认为是由于SNAP-25水平降低和蛋白激酶C介导的磷酸化在Ser187在里面快照25S187A/S187A老鼠。
SNARE复杂组件在中的能力降低快照25S187A/S187A(突变)小鼠。A类,B类对野生型和突变型小鼠(出生后第61周)的未煮熟或煮熟样品进行蛋白质印迹,然后进行电泳,然后使用SNAP-25ct抗体进行免疫印迹。A类,提供了两到三个独立实验的代表性Western blotting图像。在野生型和突变型小鼠的高分子量(~75~~250 kDa)中检测到对热敏感的SDS抗性SNAP-25ct-免疫活性条带,表明存在SNARE复合物。然而,与野生型小鼠相比,突变小鼠的谱带强度降低,尤其是在~75kDa时。B类,SNARE复合物组合相对于负荷控制的相对水平(β-微管蛋白)。使用ImageJ 1.43软件对条带强度进行定量,并表示为相对蛋白质表达水平。与野生型小鼠相比,突变小鼠的SNARE复合物组装显著减少。数据是两到三个独立实验的平均值±SEM,每个实验涉及每个基因型的三只小鼠***第页<0.01(双尾t吨测试)。
αSyn积聚与皮质纹状体神经末梢扩大
纹状体棘状中间神经元接收来自皮层和丘脑束的兴奋性输出,这些投射使用谷氨酸作为神经递质(Gerfen和Surmeier,2011年). VGLUT1和VGLUT2分别位于纹状体皮质区和丘脑区的兴奋性神经末梢。然后,我们研究了αSyn-免疫阳性沉积物与VGLUT1或VGLUT2的分布,以验证αSyn在皮质纹状体或丘脑三核神经元终末的异常积聚。如所示B类2,我们发现VGLUT1的免疫反应性变化与在老年人中观察到的αSyn的免疫反应性变化相似快照25S187A/S187A小鼠与野生型正常小鼠的比较(A类2). 重要的是,VGLUT1的这种免疫反应性,而不是VGLUT2的免疫反应性,仅与αSyn共定位(B类三,E类三). 我们还用抗pSyn和抗VGLUT1抗体进行双重免疫染色,发现VGLUT1-免疫阳性结构对p-αSyn呈免疫阳性(G公司三). 这些观察结果表明,αSyn和p-αSyn主要积聚在VGLUT1阳性神经末梢的增大处。
αSyn在肥大的VGLUT1阳性神经末梢中的积聚。A–E、野生型纹状体切片和快照25S187A/S187A在出生后第60周对(突变)小鼠进行αSyn(绿色)和VGLUT1或VGLUT2(红色)联合免疫(n个=每个基因型3个)。共聚焦图像显示突变小鼠中VGLUT1的定位发生改变,出现更多颗粒状外观(B类2)与野生型小鼠的比较(A类2). VGLUT1的免疫阳性结构,但VGLUT2没有,与αSyn阳性颗粒沉积物标记共定位(B类三,E类三). 用一种抗体和两种二级抗体处理的突变小鼠的切片没有观察到交叉反应,绿色可以忽略不计(C类1)和红色荧光(C类2)分别用抗VGLUT1和αSyn抗体处理的切片。比例尺,5μm。F–H(飞行高度),对切片进行VGLUT1(红色)和p-αSyn(绿色)联合免疫检测(n个=每个基因型3个)。共聚焦图像显示VGLUT1和p-αSyn在突变小鼠中显著共定位(G公司三). 同样,没有观察到交叉反应,可以忽略的红色证明了这一点(H(H)1)和绿色荧光(H(H)2)分别用抗VGLUT1和αSyn抗体处理的切片。比例尺,5μm。我,J型,显示VGLUT1阳性神经末梢的典型电子显微照片(用免疫金颗粒标记)。注意突变小鼠中VGLUT1阳性神经末梢的肥大(J型),但不适用于野生型小鼠(我). 比例尺,500 nm。K(K),我,每组3只小鼠VGLUT1阳性神经末梢面积的定量分析。测量每只动物100个神经末梢的大小。累积概率(K(K))和组平均值(我)并且在突变小鼠中显示出比野生型更大的神经末梢面积。数据为平均值±标准偏差***第页<0.01(双尾t吨测试)。
免疫电镜检查显示,老年人VGLUT1阳性神经末梢显著增大快照25S187A/S187A老鼠(我,J型). 基于累积概率曲线对VGLUT1阳性神经末梢大小的定量分析证实快照25S187A/S187A小鼠与野生型小鼠的比较(K(K)). VGLUT1阳性神经末梢的大小在0.8μm处达到稳定2在野生型小鼠中快照25S187A/S187A小鼠在3.6μm时达到稳定2突变小鼠中约40%的VGLUT1阳性神经末梢的大小大于野生型小鼠中测得的最大大小。具体来说,突变小鼠中VGLUT1阳性神经末梢的大小大约是野生型的四倍(第页= 0.0030) (我).
黑质纹状体多巴胺能系统无明显变化
最后,我们研究了SNARE功能障碍对黑质纹状体多巴胺能系统的影响,该系统在帕金森病患者大脑中受到影响。老年人纹状体切片快照25S187A/S187A对小鼠进行αSyn和多巴胺能神经元标记物(TH或DAT)的联合免疫检测。αSyn-免疫阳性沉积物似乎与DAT和TH相邻,但几乎不与两者共定位快照25S187A/S187A老鼠。野生型和突变型小鼠纹状体中DAT-和TH-免疫活性沉积物的分布模式没有显著差异(A–D). 这些结果表明黑质纹状体多巴胺能神经元在快照25S187A/S187A老鼠。
黑质纹状体多巴胺能神经元缺乏神经退行性改变。A–D、野生型纹状体切片和快照25S187A/S187A在出生后第60周对(突变)小鼠进行α-Syn(绿色)和TH或DAT(红色)联合免疫(n个=每个基因型3个)。TH的分布模式没有显著差异(A类2,B类2)和DAT(C类2,D类2)野生型和突变型小鼠之间。αSyn阳性颗粒沉积物(B类1,D类1)很少与TH或DAT共存(B类三,D类三). 比例尺,5μm。E–H(E–H),出生后第60周多巴胺能神经末梢的典型电子显微照片(n个=每个基因型3个)。它们是由银粒子识别的(E类,F类)或DAB标签(G公司,H(H))DAT(箭头)。突触小泡的亚细胞定位没有显著差异(E类,F类)或αSyn(箭头、银颗粒)(G公司,H(H))野生型和突变型小鼠之间。比例尺,500 nm。我,J型,野生型和突变型小鼠出生后第60周黑质的代表性显微照片,TH免疫染色,甲酚紫复染。比例尺:我1,我2,200微米。每个基因型的三只小鼠中DA细胞体的数量。数据为平均值±SEM(J型).K(K),我,在出生后第61周使用黑质组织进行Western blotting。来自两个独立实验的代表性蛋白质印迹图像,每个实验分别涉及三只和五只野生型和突变型小鼠(K(K)). 相对于野生型小鼠的值,TH蛋白的相对表达水平(相对于β-微管蛋白的表达)得到了表达(我). 数据是两个独立实验的平均值±SEM,每个实验分别涉及三只和五只野生型和突变型小鼠。M(M),出生后第54周小鼠纹状体DA、HVA和DOPAC水平的量化。数据表示为相对于野生型小鼠的数据,并表示每个基因型四只小鼠的一次实验重复测量的平均值±SEM。野生型和突变型小鼠之间没有显著差异(J型,我,M(M))(双尾t吨测试)。
为了进一步阐明这一点,我们对DAT阳性多巴胺能神经末梢进行了免疫电镜检查。在包括突触小泡凝集在内的任何结构改变方面都没有显著差异(E类,F类). 此外,我们发现老化野生型和老化野生型之间αSyn蛋白的亚细胞定位没有显著差异快照25S187A/S187A老鼠(G公司,H(H)).
我们还研究了老年人黑质纹状体多巴胺能神经元的功能保存快照25S187A/S187A老鼠。野生型和非野生型SNpc中TH和Nissl双阳性细胞的数量没有显著差异快照25S187A/S187A老鼠(我,J型). 在老年野生型和老年野生型之间,中脑组织中TH蛋白和纹状体中DA及其代谢物HVA和DOPAC的水平也没有显著差异快照25S187A/S187A老鼠(K–M公司). 这些结果表明SNARE功能障碍似乎与黑质纹状体多巴胺能神经元PD相关病理改变的发生无关。
脚注
这项工作得到了日本科学技术署进化科学技术核心研究(H.M.)的资助;日本卫生、劳动和福利部中枢神经系统退行性疾病研究委员会的资助;日本卫生、劳动和福利部卫生技术应用研究拨款(H23–015);日本教育、文化、体育、科学技术部拨款S0801035(H.M.);以及日本教育、科学、体育和文化部(H.M.)的创新领域科学研究拨款(大脑环境)。
作者声明没有竞争性的经济利益。
参考文献
- Asuni AA、Cunningham C、Vigneswaran P、Perry VH、O’Connor V。朊病毒体内模型中未经修饰的陷阱复合物形成。大脑研究。2008;1233:1–7.[公共医学][谷歌学者]
- Bamford NS、Robinson S、Palmiter RD、Joyce JA、Moore C、Meshul CK。多巴胺调节皮质纹状体终末的释放。神经科学杂志。2004;24:9541–9552. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Burgoyne RD,Morgan A.监管SNARE:在预防神经退行性变中的作用?自然细胞生物学。2011;13:8–9.[公共医学][谷歌学者]
- BurréJ、Sharma M、Tsetsenis T、Buchman V、Etherton MR、Südhof TC。Alpha-synuclein在体内外促进SNARE复合物组装。科学。2010;329:1663–1667. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Cabin DE、Shimazu K、Murphy D、Cole NB、Gottschalk W、McIlwain KL、Orrison B、Chen A、Ellis CE、Paylor R、Lu B、Nussbaum RL。突触小泡缺失与缺乏α-突触核蛋白的小鼠对长时间重复刺激的弱突触反应相关。神经科学杂志。2002;22:8797–8807. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Chandra S、Gallardo G、Fernández-Chacón R、Schlüter OM、Südhof TC。Alpha-synuclein与CSPalpha合作预防神经退行性变。单元格。2005年;123:383–396.[公共医学][谷歌学者]
- Chung CY,Koprich JB,Siddiqi H,Isason O。在AAVα-同核蛋白病大鼠模型中,突触前和轴突转运蛋白的动态变化与纹状体神经炎症相结合是多巴胺能神经元丢失的先兆。神经科学杂志。2009;29:3365–3373。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Chung YH,Joo KM,Kim MJ,Cha CI。表达人Cu/Zn超氧化物歧化酶突变的转基因小鼠中枢神经系统α-同核蛋白分布的免疫组织化学研究。神经科学快报。2003;342:151–154.[公共医学][谷歌学者]
- Darios F、Ruipérez V、López I、Villanueva J、Gutierrez LM、Davletov B.α-同核蛋白螯合物花生四烯酸调节SNARE介导的胞吐。EMBO代表。2010;11:528–533。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Franklin KBJ,Paxinos G。小鼠大脑在立体定向坐标系中。第3版。纽约:学术;2008[谷歌学者]
- Fujiwara H、Hasegawa M、Dohmae N、Kawashima A、Masliah E、Goldberg MS、Shen J、Takio K、Iwatsubo T。α-突触核蛋白在同核蛋白病变中磷酸化。自然细胞生物学。2002;4:160–164.[公共医学][谷歌学者]
- Furuya T、Hayakawa H、Yamada M、Yoshimi K、Hisahara S、Miura M、Mizuno Y、Mochizuki H。Caspase-11在帕金森病的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶小鼠模型中介导炎症性多巴胺能细胞死亡。神经科学杂志。2004;24:1865–1872. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Galvin JE、Lee VM、Trojanowski JQ。突触核蛋白病:临床和病理意义。神经系统科学。2001;58:186–190.[公共医学][谷歌学者]
- Garcia-Reitböck P、Anichtchik O、Bellucci A、Iovino M、Ballini C、Fineberg E、Ghetti B、Della Corte L、Spano P、Tofaris GK、Goedert M、Spilantini MG。帕金森病转基因小鼠模型中SNARE蛋白重分布和突触失败。大脑。2010;133:2032–2044. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Gerfen CR,Surmeier DJ。多巴胺对纹状体投射系统的调节。《神经科学年鉴》。2011;34:441–466. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Gimbel DA、Nygaard HB、Coffey EE、Gunther EC、Laurén J、Gimbel ZA、Strittmatter SM。转基因阿尔茨海默病小鼠的记忆障碍需要细胞朊蛋白。神经科学杂志。2010;30:6367–6374. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Gureviciene I,Gurevixius K,Tanila H。α-突触核蛋白在突触谷氨酸释放中的作用。神经生物学疾病。2007;28:83–89.[公共医学][谷歌学者]
- Haucke V,Neher E,Sigrist SJ。突触胞吐和胞吞耦合中的蛋白质支架。Nat Rev神经科学。2011;12:127–138.[公共医学][谷歌学者]
- Hayes NVL,Baines AJ公司。突触小泡。收件人:Lee AG,编辑。生物膜:多卷论文。康涅狄格州格林威治:JAI;1996年,第75-122页。[谷歌学者]
- Herzig MC、Kolly C、Persohn E、Theil D、Schweizer T、Hafner T、Stemmelen C、Troxler TJ、Schmid P、Danner S、Schnell CR、Mueller M、Kinzel B、Grevot A、Bolognani F、Stirn M、Kuhn RR、Kaupmann K、van der Putten PH、Rovelli G等。LRRK2蛋白水平由激酶功能决定,对小鼠的肾和肺稳态至关重要。人类分子遗传学。2011;20:4209–4223. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Hu K,Carroll J,Rickman C,Davletov B.复合物对SNARE复合物的作用。生物化学杂志。2002;277:41652–41656。[公共医学][谷歌学者]
- Iwai A、Masliah E、Yoshimoto M、Ge N、Flanagan L、de Silva HA、Kittel A、Saitoh T。阿尔茨海默病非Aβ成分的前体蛋白淀粉样蛋白是中枢神经系统的突触前蛋白。神经元。1995;14:467–475.[公共医学][谷歌学者]
- Iwasaki S、Kataoka M、Sekiguchi M、Shimazaki Y、Sato K、Takahashi M。佛波酯刺激克隆大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞释放神经递质的两种不同机制。生物化学杂志。2000;128:407–414。[公共医学][谷歌学者]
- Kataoka M、Yamamori S、Suzuki E、Watanabe S、Sato T、Miyaoka H、Azuma S、Ikegami S、Kuwahara R、Suzuci-Migishima R、Nakahara Y、Nihonmatsu I、Inokuchi K、Katoh-Fukui Y、Yokoyama M、Takahashi M。SNAP-25中的一个氨基酸突变可诱导小鼠的焦虑相关行为。公共科学图书馆一号。2011;6:e25158。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Kaushal N、Seminerio MJ、Shaikh J、Medina MA、Mesangeau C、Wilson LL、McCurdy CR、Matsumoto RR。CM156是一种高亲和力的sigma配体,可减弱甲基苯丙胺对小鼠的刺激性和神经毒性作用。神经药理学。2011;61:992–1000. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Kawamura Y、Fukaya M、Maejima T、Yoshida T、Miura E、Watanabe M、Ohno-Shosaku T、Kano M。CB1大麻素受体是海马和小脑突触前兴奋部位的主要大麻素感受器。神经科学杂志。2006;26:2991–3001. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Kramer ML、Schulz-Scheffer WJ。突触前α-突触核蛋白聚集体(而非路易体)导致路易体痴呆患者的神经退行性变。神经科学杂志。2007;27:1405–1410. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Kuwahara T、Koyama A、Koyaman S、Yoshina S、Ren CH、Kato T、Mitani S、Iwatsubo T。系统RNAi筛选揭示了α-synuclein转基因秀丽隐杆线虫神经元功能障碍中的内吞途径参与。人类分子遗传学。2008;17:2997–3009.[公共医学][谷歌学者]
- Larsen KE、Schmitz Y、Troyer MD、Mosharov E、Dietrich P、Quazi AZ、Savalle M、Nemani V、Chaudhry FA、Edwards RH、Stefanis L、Sulzer D.PC12和嗜铬细胞中α-突触核蛋白过表达通过干扰胞吐的后期步骤来损害儿茶酚胺的释放。神经科学杂志。2006;26:11915–11922. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Majewski H,Iannazzo L.蛋白激酶C:增强递质输出的生理介质。神经生物学进展。1998;55:463–475.[公共医学][谷歌学者]
- Maroteaux L,Campanelli JT,Scheller RH。突触核蛋白:一种定位于细胞核和突触前神经末梢的神经元特异性蛋白。神经科学杂志。1988;8:2804–2815. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Masliah E、Rockenstein E、Veinbergs I、Sagara Y、Mallory M、Hashimoto M、Mucke L.β-淀粉样肽增强阿尔茨海默病和帕金森病转基因小鼠模型中α-同核蛋白的积累和神经元缺陷。美国国家科学院院刊。2001;98:12245–12250. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- McFarland MA、Ellis CE、Markey SP、Nussbaum RL。蛋白质组学分析确定磷酸化依赖的α-同核蛋白相互作用。分子细胞蛋白质组学。2008;7:2123–2137. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Miyazaki T,Fukaya M,Shimizu H,Watanabe M。发育中的小鼠小脑中平行纤维浦肯野细胞突触处囊泡谷氨酸转运体的亚型转换。欧洲神经病学杂志。2003;17:2563–2572.[公共医学][谷歌学者]
- Morgan A、Burgoyne RD、Barclay JW、Craig TJ、Prescott GR、Ciufo LF、Evans GJ、Graham ME。蛋白激酶C对胞吐的调节。生物化学Soc Trans。2005年;33:1341–1344.[公共医学][谷歌学者]
- Morgan JR、Prasad K、Hao W、Augustine GJ、Lafer EM。一种对突触囊泡内吞至关重要的保守网格蛋白组装基序。神经科学杂志。2000;20:8667–8676. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Murphy DD、Rueter SM、Trojanowski JQ、Lee VM。突触核蛋白在发育过程中表达,α-突触核素调节初级海马神经元突触前囊泡池的大小。神经科学杂志。2000;20:3214–3220. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Nagy G、Matti U、Nehring RB、Binz T、Rettig J、Neher E、Sørensen JB。Ser187突触体相关蛋白25 kDa的蛋白激酶C依赖性磷酸化增强了小泡募集。神经科学杂志。2002;22:9278–9286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Nemani VM、Lu W、Berge V、Nakamura K、Onoa B、Lee MK、Chaudhry FA、Nicoll RA、Edwards RH。α-突触核蛋白表达增加通过抑制内吞后突触小泡重新聚集来减少神经递质释放。神经元。2010;65:66–79。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Neumann M、Kahle PJ、Giasson BI、Ozmen L、Borroni E、Spooren W、Müller V、Odoy S、Fujiwara H、Hasegawa M、Iwatsubo T、Trojanowski JQ、Kretzschmar HA、Haass C。运动能力退化的老年转基因小鼠和人类α-同步核蛋白病中的错误折叠蛋白酶K抗性超磷酸化α-同步蛋白。临床投资杂志。2002;110:1429–1439. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Orimo S、Uchihara T、Nakamura A、Mori F、Kakita A、Wakabayashi K、Takahashi H。轴突α-突触核蛋白聚集预示着帕金森病心脏交感神经向心性变性。大脑。2008;131:642–650.[公共医学][谷歌学者]
- Pan-Montojo F、Anichtchik O、Dening Y、Knels L、Pursche S、Jung R、Jackson S、Gille G、Spilantini MG、Reichmann H、Funk RH。通过小鼠胃内注射鱼藤酮,可以复制帕金森病病理学的进展。公共科学图书馆一号。2010;5:e8762。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Saito Y、川岛A、Ruberu NN、藤原浩H、小山S、Sawabe M、Arai T、Nagura H、Yamanouchi H、Hasegawa M、岩手聪T、村山S。老化人脑中磷酸化α-同核蛋白的积累。神经病理学实验神经学杂志。2003;62:644–654.[公共医学][谷歌学者]
- Sakisaka T、Yamamoto Y、Mochida S、Nakamura M、Nishikawa K、Ishizaki H、Okamoto Tanaka M、Miyoshi J、Fujiyoshi Y、Manabe T、Takai Y。tomosyn对SNARE复合物形成的双重抑制可确保受控的神经递质释放。细胞生物学杂志。2008;183:323–337. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- 舒尔兹·谢弗WJ。路易体痴呆、帕金森病和帕金森病痴呆患者α-同核蛋白聚集的突触病理学。神经病理学学报。2010;120:131–143. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Scott DA、Tabaran I、Tang Y、Cartier A、Masliah E、Roy S。α-突触核蛋白诱导的神经退行性变中导致突触功能障碍的病理级联反应。神经科学杂志。2010;30:8083–8095. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Sharma M,BurréJ,Südhof TC。CSPhalpha通过在突触活动中伴随SNAP-25促进SNARE-复合物组装。自然细胞生物学。2011;13:30–39.[公共医学][谷歌学者]
- Shimazaki Y、Nishiki T、Omori A、Sekiguchi M、Kamata Y、Kozaki S、Takahashi M。25-kDa突触体相关蛋白的磷酸化。可能参与蛋白激酶C介导的神经递质释放调节。生物化学杂志。1996年;271:14548–14553.[公共医学][谷歌学者]
- Shoji-Kasai Y、Itakura M、Kataoka M、Yamamori S、Takahashi M。蛋白激酶C介导分泌小泡向质膜的移位,并增强PC12细胞的神经递质释放。欧洲神经病学杂志。2002;15:1390–1394.[公共医学][谷歌学者]
- Spialantini MG,Goedert M.α-同核蛋白病:帕金森氏病、路易体痴呆和多系统萎缩。Ann N Y科学院。2000;920:16–27.[公共医学][谷歌学者]
- Südhof TC。突触小泡周期。神经科学年鉴。2004;27:509–547.[公共医学][谷歌学者]
- Tabuchi K,Blundell J,Etherton MR,Hammer RE,Liu X,Powell CM,Südhof TC。与自闭症相关的神经ligin-3突变增加了小鼠的抑制性突触传递。科学。2007;318:71–76. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Tapia-González S、Giráldez-Pérez RM、Cuartero MI、Casarejos MJ、Mena Má、Wang XF、Sánchez-Capelo A.Smad3阴性小鼠的多巴胺和α-同核蛋白功能障碍。摩尔神经变性剂。2011;6:72. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Tong J,Wong H,Guttman M,Ang LC,Forno LS,Shimadzu M,Rajput AH,Muenter MD,Kish SJ,Hornykiewicz O,Furukawa Y.多系统萎缩、帕金森病和进行性核上性麻痹患者的脑α-同核蛋白积聚:一项比较研究。大脑。2010;133:172–188.[公共医学][谷歌学者]
- Ubhi K,Low P,Masliah E.多系统萎缩:临床和神经病理学视角。《神经科学趋势》。2011;34:581–590. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Wickens JR,Arbuthnott GW.纹状体在受体水平上的结构和功能相互作用。作者:Dunnett SB、Bentivoglio M、Björklund A、Hökfelt T,编辑。多巴胺,化学神经解剖学手册。第21卷。阿姆斯特丹:爱思唯尔;2005年,第199-236页。[谷歌学者]
- Yamamori S、Itakura M、Sugaya D、Katsumata O、Sakagami H、Takahashi M。SNAP-25家族蛋白在小鼠大脑中的差异表达。《计算机神经学杂志》。2011;519:916–932.[公共医学][谷歌学者]
- Yasuda T、Hayakawa H、Nihira T、Ren YR、Nakata Y、Nagai M、Hattori N、Miyake K、Takada M、Shimada T、Mizuno Y、Mochizuki H.Parkin介导的帕金森病慢性MPTP-minipump小鼠模型中多巴胺能神经元的保护。神经病理学实验神经学杂志。2011;70:686–697.[公共医学][谷歌学者]
- Yasuda T、Nakata Y、Mochizuki H.α-突触核蛋白与神经元细胞死亡。摩尔神经生物学。2012年doi:10.1007/s12035-012-8327-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Yoshida M.多系统萎缩:α-突触核蛋白和神经元变性。神经病理学。2007;27:484–493.[公共医学][谷歌学者]