跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
美国国家科学院院刊。2017年4月25日；114(17): 4531–4536.
2017年4月10日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1618659114
预防性维修识别码：项目经理5410849
PMID：28396408

靶向内皮鞘氨醇1-磷酸受体1选择性打开血脑屏障

柳田圭介,a、，b、，c、，1 凯瑟琳·H·刘,c、，1 朱塞佩·法拉科,天 西尔万·加尔瓦尼,a、，b条 海伦·K·史密斯,c（c） 纳撒利·伯格,c（c） 约瑟夫·安克雷特,天 特蕾莎·桑切斯,c（c） 科斯坦蒂诺·伊德科拉,天和蒂莫西·赫拉a、，b、，c、，2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

重要性

血脑屏障（BBB）是药物输送到中枢神经系统（CNS）的主要障碍。本研究揭示了鞘氨醇1-磷酸受体-1（S1P）的遗传或药理学靶向性1)促进小分子选择性BBB开放，无CNS炎症或损伤的主要迹象。这种大小选择性的BBB开放可能归因于紧密连接蛋白的细胞骨架结合的变化。重要的是，通过药物阻断S1P打开BBB1是可逆的，表明以S1P为靶点1可能是一种有希望的策略，可以将治疗药物安全地输送到中枢神经系统，以治疗神经退行性疾病、神经炎症疾病和神经癌症。

关键词：血脑屏障、1-磷酸鞘氨醇、内皮、紧密连接、药物输送

摘要

中枢神经系统（CNS）的血管系统形成一种选择性屏障，称为血脑屏障（BBB）。血脑屏障的破坏可能导致各种中枢神经系统疾病。相反，完整的BBB限制了CNS靶向药物的有效渗透。在此，我们报道了内皮鞘氨醇1–磷酸（S1P）受体-1的BBB调节作用，该受体是一种已知的G蛋白偶联受体，可促进外周血管的屏障功能。内皮特异性第1季度基因敲除小鼠(S1月1日iECKO公司)显示小分子质量荧光示踪剂（<3 kDa）的BBB破裂，但较大示踪剂的BBB断裂（>10 kDa。根据新的物体识别测试评估，慢性BBB泄漏与认知障碍相关，但与脑炎症症状无关。脑微血管第1季度iECKO公司小鼠表现出紧密连接蛋白的亚细胞分布发生改变。S1P的药理抑制1功能导致瞬时BBB破坏。这些数据表明脑内皮S1P1通过调节紧密连接蛋白的正确定位来维持BBB，并提高内皮S1P的可能性1抑制可能是暂时性BBB开放和向中枢神经系统输送小分子的策略。

血脑屏障（BBB）是一个保护和调节界面，允许必需营养物质进入，同时防止有害物质进入中枢神经系统（CNS）(1). BBB内皮细胞（EC）含有丰富的紧密连接（TJ）蛋白，可产生细胞旁封闭。此外，脑内皮细胞内吞小泡的缺乏导致细胞内吞率低。此外，大脑内皮细胞可以有效地将葡萄糖和氨基酸等特定分子运输到中枢神经系统(2). 毛细血管内皮被明确的基底膜、周细胞和星形细胞终末足突包围，构成神经血管单位（NVU），对维持中枢神经系统的稳态至关重要(三). 血脑屏障的破坏与各种中枢神经系统疾病有关，包括多发性硬化症（MS）、阿尔茨海默病（AD）和缺血性中风(1–三). 相反，在正常状态下，BBB通过限制药物输送阻碍了CNS疾病的药物治疗(4). 在综合医学化学数据库中分析的7000种药物中，只有5%的药物表现出有效的血脑屏障通透性，可以转运到中枢神经系统(5). 因此，调控BBB开放的新方法可能有助于促进中枢神经系统疾病的有效药物治疗。

鞘氨醇1-磷酸（S1P）是一种多效性脂质介质，与五种G蛋白偶联受体（GPCR）、S1P相互作用1–5，调节细胞迁移、粘附、存活和增殖(6). 最近，一位S1P1调节剂FTY720（fingolimod）被批准为治疗复发缓解型MS的一线口服药物(7). 此外，S1P及其原型受体S1P1与AD和缺血性中风等神经血管疾病有关(8,9). EC S1P的S1P激活1对血管发育和屏障功能至关重要(10). 第1阶段1调节G我-依赖性Rac激活、细胞骨架重组、粘附连接（AJ）组装和局部粘附形成，所有这些都是增强血管屏障功能所必需的(10). 事实上，S1P的遗传和药理抑制1肺、视网膜和结肠等不同器官的血管通透性增加(11–14). 然而，EC S1P的作用1中枢神经系统中的血管系统尚不清楚。

在这里，我们研究了内皮S1P的参与1使用EC特异性的体内BBB完整性S1月1日敲除小鼠（称为第1季度iECKO公司老鼠）。结果表明，脑内皮S1P1以大小相关的方式调节BBB的完整性。长期血脑屏障渗漏，EC特异性第1季度敲除小鼠表现出认知障碍，但没有脑炎症的迹象。脑微血管的生化分析表明，TJ蛋白的亚细胞定位在第1季度iECKO公司小鼠，这为这些小鼠的大小选择性BBB泄漏提供了分子解释。S1P的短暂药理抑制1导致小分子在中枢神经系统的渗透性增加，表明以S1P为靶点1可能是将治疗药物安全输送到中枢神经系统的一种有希望的策略。

结果

可选BBB开口尺寸S1月1日iECKO公司老鼠。

评估内皮S1P的作用1在脑血管系统中，我们使用了一种小鼠模型，其中S1P1以特定于EC的方式删除(第1季度flox/flox公司 加拿大存托凭证5–Cre公司–急诊室T2段; 称为第1季度iECKO公司) (12,15–17). 在出生后的前3天用三苯氧胺治疗小鼠，并允许其发育到成年。成人大脑内皮细胞RNA的定量PCR（qPCR）分析显示第1季度表达式(图S1A类). 脑内皮细胞没有显示代偿性上调第1季度第2季度和第三季度(图S1A类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114sfig01.jpg

S1P受体、pan-EC、脑EC和NVU细胞的基因表达分析。(A类)主要内皮S1P受体mRNA表达的qPCR分析，S1月1日,第1季度第2季度、和第三季度在与对照组隔离的大脑ECs中(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司小鼠(n个=1）。(B类)pan-EC标记基因mRNA表达的qPCR分析，佩卡姆1和德在大脑皮层和海马中第1季度iECKO公司小鼠(n个= 5). (C类)从全脑分离出的代表性微血管的Brightfield图像。微血管直径为4至15μm。（比例尺：20μm）(D类和E类)脑-EC特异基因mRNA表达的qPCR分析(D类)以及构成NVU的其他单元类型；平滑肌细胞、周细胞、星形胶质细胞和血管周巨噬细胞(E类)来自对照和第1季度iECKO公司小鼠(n个= 4).

探讨内皮S1P的作用1在BBB功能方面，我们注射1-kDa荧光示踪剂Alexa Fluor 555–尸体，并检查其在大脑中的分布。如所示图1A类,第1季度iECKO公司与对照小鼠相比，脑实质中的示踪剂积累增加了大约五倍(图1B类)表明中枢神经系统血管系统有泄漏。当给予3-kDa右旋糖酐-四甲基罗丹明（TMR）时，也观察到示踪剂在脑实质中的积累(图1C类). 然而，当小鼠注射10-和70-kDa右旋糖酐–TMR时，对照组和对照组之间的示踪剂积累没有显著差异第1季度iECKO公司大脑(图1D类和E类). 与BBB相似的血-视网膜屏障是紧密且限制性的(18). 与大脑相似，3-kDa右旋糖酐-TMR的渗漏也在第1季度iECKO公司视网膜(图S2).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114fig01.jpg

示踪剂向大脑的外渗增加S1月1日iECKO公司老鼠。第1季度在出生后诱导缺失A类–E类在成人中F类. (A类)注射1-kDa Alexa Fluor 555尸体后拍摄的全脑图像。（比例尺：5 mm。）(B类–E类)渗出的1-kDa Alexa Fluor 555尸体碱的定量(B类)，3-kDa右旋糖酐–TMR(C类)，10-kDa右旋糖酐–TMR(D类)和70-kDa右旋糖酐–TMR(E类)在控制中(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司小鼠(n个=3或4）。(F类)对照组和对照组中渗出尸体的定量第1季度iECKO公司在成年小鼠中诱导缺失(n个= 3). 数据表示为平均值±SD*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01（学生的吨测试）。NS，无显著性。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114sfig02.jpg

第1季度iECKO公司小鼠表现出3-kDa右旋糖酐-TMR示踪剂渗入视网膜的增加。数据表示为平均值±SD。n个= 5. *P（P）<0.05（学生的吨测试）。

CNS血管在出生后早期经历血管生成和重塑(19,20)，其更改可能会影响随后的BBB属性(2,21). 确定S1P是否1通过血管发育缺陷直接或间接调节血脑屏障(2,21)，我们删除了内皮细胞第1季度在成年小鼠中（>8周），并在基因缺失4周后分析其BBB功能。如出生后早期缺失，成人缺失第1季度将1-kDa Alexa Fluor 555尸胺的血脑屏障通透性提高约四倍(图1F类). 总之，这些结果表明内皮S1P1以规模选择性的方式直接监管BBB的完整性。

正常脑血管结构第1季度iECKO公司老鼠。

因为S1P1是新生血管生成的关键调节因子(12,22,23)，我们接下来检查内皮细胞是否缺失第1季度影响中枢神经系统血管的发育、成熟和模式形成。脑血管密度、直径和分支点在第1季度iECKO公司小鼠(图2A类和B类). 因为内皮S1P1在胚胎发育过程中调节周细胞投资(24)，我们评估了周细胞覆盖率第1季度iECKO公司脑血管系统。周细胞标记物CD13的免疫组织化学染色显示，周细胞覆盖率或相对于毛细血管壁内皮细胞的位置没有任何异常(图2A类和B类). pan-EC标记基因的表达，如佩卡姆1和德在整个皮层或海马组织中没有改变(图S1B类). 此外，分离的微血管碎片(图S1C类)来自第1季度iECKO公司大脑EC-特异性基因的mRNA表达正常(Slco1c1公司,Slc2a1系列,Abcb1a型,Mfsd2a公司、和Zic3公司)（参考。21;图S1D类)或NVU的其他成分，平滑肌细胞(学报2)，周细胞(Pdgfrb公司)，星形胶质细胞(Gfap公司,问题4、和制造商8)和血管周围巨噬细胞(Mrc1公司和Lyve1号机组)（参考。25;图S1E类). 这些结果表明第1季度iECKO公司大脑EC经历正常发育、CNS特异性EC分化和NVU发育。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114fig02.jpg

内皮细胞缺失第1季度在新生儿期不影响脑血管发育或诱发炎症，但与认知功能障碍有关。(A类)对照组大脑皮层的典型共焦图像(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司小鼠用IV型胶原（基底膜）和CD13（周细胞）染色。A类,下部显示高倍放大图像。（比例尺：100μm）(B类)皮质血管密度、分支、直径和周细胞覆盖率的量化(n个= 3). (C类)表达的qPCR分析伊尔1b,伊尔6、和Tnfa公司大脑皮层和海马(n个= 5). (D类和E类)在控制和第1季度iECKO公司出生后开始缺失的小鼠通过NOR任务(D类)或者在成人身上(E类). 新物体的探索时间用新物体和熟悉物体的百分比表示(n个= 11,D类;n个= 7,E类). 数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05（学生的吨测试）。NS，无显著性。

出生后早期缺失的炎症基因表达与认知功能第1季度iECKO公司老鼠。

BBB通透性增加与神经炎症有关(26). 例如，炎性细胞因子基因的mRNA表达包括伊尔1b,Tnfa公司、和伊尔6在多种动物中风模型中增加（高达40至60倍）(27). 接下来，我们检测了对照组和对照组大脑皮层和海马的炎症基因表达第1季度iECKO公司老鼠。然而，在表达水平上没有显著差异伊尔1b,Tnfa公司、和伊尔6之间第1季度iECKO公司鼠标和控件(图2C类). 此外，第1季度iECKO公司大脑没有血管周围反应性星形胶质细胞增生症的迹象(三) (图S3).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114sfig03.jpg

第1季度iECKO公司小鼠没有血管周围反应性星形胶质细胞增生的迹象。对照组大脑皮层的代表性共焦图像(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司显示CD31和GFAP染色的小鼠。（比例尺：200μm）

BBB中断也与认知障碍有关(28,29). 值得注意的是，慢性但非急性高血压增加了小分子血BBB的泄漏，这通过增加血管周围巨噬细胞对血管紧张素II的暴露而导致认知障碍(30). 因此，我们询问是否内皮细胞缺失第1季度而BBB打开后会影响识别记忆。为此，控制和第1季度iECKO公司对小鼠进行新型物体识别（NOR）任务测试，这是一种常用于研究识别记忆性能的范式(31). 在这个行为测试中，我们发现第1季度iECKO公司与对照组小鼠相比，小鼠探索新物体的时间显著减少(图2D类)尽管损害程度比小鼠慢性高血压模型轻（新物体探索时间减少10%vs.20%）。尤其是，S1月1日iECKO公司当内皮细胞第1季度在成人中诱导缺失(图2E类). 因此，内皮S1P的慢性缺陷1出生后早期开始的信号导致认知记忆缺陷。

TJ蛋白的亚细胞分布改变第1季度iECKO公司脑微血管。

BBB的特征是高度专业化的TJ封闭了相邻EC之间的细胞旁间隙，并且从血管腔到脑实质的细胞转归率低(1–三). 在TJ基因（包括氯化物5编码子句-5和/或奥克兰编码闭塞素，被删除或敲除(32–34). 因此，我们试图确定BBB是否在第1季度iECKO公司小鼠与TJ蛋白调节有关。为此，我们首先比较了对照组和对照组之间主要TJ蛋白claudin-5、clodin和ZO-1以及AJ蛋白VE-钙粘蛋白的表达水平第1季度iECKO公司老鼠。检测纯化脑微血管中的mRNA和蛋白表达水平表明第1季度iECKO公司小鼠的这些TJ和AJ蛋白表达水平正常(图3A类和B类). TJ和AJ与皮质肌动蛋白细胞骨架相连，后者控制这些粘附蛋白的亚细胞分布和功能(35). 因为S1P1是内皮肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子(10)，我们进一步研究了TJ和AJ蛋白在脑血管中的亚细胞分布。为此，用免疫荧光共聚焦显微镜检查TJ蛋白的亚细胞分布。然而，我们没有观察到对照组和对照组微血管中TJ蛋白分布的明显差异第1季度iECKO公司大脑(图S4A类). 接下来，我们使用来自对照组和第1季度iECKO公司老鼠。无论基因型如何，CD31和VE–钙粘蛋白分别只在膜和细胞骨架部分检测到(图S5). 同时，在膜、核和细胞骨架部分检测到克劳丁-5和闭塞素。这些TJ蛋白在膜组分中的表达较高，但在肌动蛋白细胞骨架组分中表达较少第1季度iECKO公司微血管碎片与对照小鼠的比较(图3C类). 然而，免疫荧光共聚焦显微镜并没有检测到TJ蛋白亚细胞分布的改变(图S4B类). 这些结果表明第1季度减少TJ蛋白的细胞骨架结合，而不会显著改变其表达水平或在脑EC中的定位，这可能有助于增加BBB对小分子的渗透性。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114fig03.jpg

TJ蛋白在脑微血管中亚细胞分布的改变第1季度iECKO公司老鼠。(A类)TJ蛋白mRNA表达的qPCR分析氯化物5,奥克兰、和Tjp1型和AJ蛋白镉5在对照组的微血管碎片中(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司老鼠。相对表达水平归一化为pan-EC标记佩卡姆1显示了(n个= 4). (B类)代表性免疫印迹图像(左侧)带量化(赖特)对照组和对照组的TJ蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1和AJ蛋白VE-cadherin第1季度iECKO公司脑微血管。使用抗CD31抗体作为负荷控制和量化标准化(n个= 3). (C类)对照组和对照组TJ蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1的亚细胞分布第1季度iECKO公司脑微血管(n个= 5). 代表性免疫印迹图像(C类,上部)带量化(C类,下部)如图所示。TJ蛋白在每个组分中的分布占总蛋白的百分比(C类,下部). 数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05（单因素方差分析）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114sfig04.jpg

TJ蛋白的免疫组织化学分析。(A类)对照组脑毛细血管的典型高分辨率共焦图像(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司用谷氨酸1（EC）和TJ蛋白克劳丁-5、闭塞素和ZO-1染色的小鼠。三维重建z（z）-给出了堆栈（XY投影或YZ投影）。（比例尺：3μm）(B类)通过Pearson分析量化claudin-5或clodin和ZO-1之间的共定位系数。数据表示为平均值±SD(n个=21-30）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114sfig05.jpg

内皮细胞缺失第1季度不影响CD31和VE-cadherin的亚细胞分布(第1季度flox/flox公司)以及第1季度iECKO公司脑微血管显示。注意，CD31或VE-cadherin分别只在细胞膜或肌动蛋白细胞骨架部分中检测到。

以S1P为靶点的可逆和选择性BBB开放1。

因为第1季度缺失诱导了大小选择性BBB开放，接下来我们研究了S1P是否1抑制剂可以打开BBB。为此，我们使用了FDA批准的药物FTY720（fingolimod），该药物针对除S1P外的所有S1P受体2(7). FTY720是一种在体内磷酸化形成FTY720-P的前药，作为S1P的功能性拮抗剂1通过诱导其内在化和退化(11,36,37). 事实上，连续三天服用FTY720成功降低了S1P的表达1在微血管碎片中(图4A类). FTY720处理的野生型小鼠显示出1-kDa Alexa Fluor 555尸胺示踪剂的较高脑蓄积，但10kDa示踪剂的脑蓄积不高，概括了第1季度iECKO公司小鼠表型(图4B类和C类). 然而，FTY720治疗并未显示1-kDa Alexa Fluor 555对脑实质的尸体外渗有任何增强作用第1季度iECKO公司小鼠，表明这种作用是S1P1-从属的(图4D类). 重要的是，FTY720诱导的BBB开放是可逆的，在注射后7天未观察到(图4E类). S1P治疗1-选择性功能拮抗剂NIBR-0213(38)注射后6小时，1-kDa Alexa Fluor 555在脑实质中的尸体蓄积量增加了5倍，但注射NIBR-0213后48小时没有增加(图4F类和G公司). 总之，这些结果表明S1P的药理靶向性1以大小选择性的方式可逆地增加BBB渗透率。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为pnas.1618659114fig04.jpg

S1P的药理靶向性1脑示踪剂外渗增加，具有一定的选择性和可逆性。(A类)S1P的免疫印迹分析1溶媒或FTY720处理（连续三天5 mg/kg）小鼠的微血管碎片。CD31表达式显示为加载控件。(B类和C类)1-kDa Alexa Fluor 555渗出尸体的定量(B类)和10-kDa右旋糖酐–TMR(C类)车内或FTY720处理的小鼠。(D类)1-kDa Alexa Fluor 555的量化——经载体或FTY720治疗的尸体脑漏第1季度iECKO公司老鼠。(E类)治疗后第7天，对经溶媒或FTY720处理的小鼠体内1-kDa Alexa Fluor 555（尸体）外渗的量化。(F类和G公司)在6小时时对经车用或NIBR-0213治疗（30 mg/kg）的小鼠体内溢出的1-kDa Alexa Fluor 555尸体进行定量(F类)或48小时(G公司)治疗后。数据表示为平均值±SD。n个=3或4*P（P）<0.05（学生的吨测试）。NS，无显著性。

讨论

血脑屏障对维持脑内稳态至关重要，而血脑屏障功能障碍与许多中枢神经系统疾病有关(1–三). 因此，维持和恢复正常血脑屏障功能被认为是一种潜在的治疗方法。相反，BBB阻碍药物输送到中枢神经系统。因此，详细了解血脑屏障的发展和维持对于许多中枢神经系统疾病的新型治疗方法的开发至关重要(4). 在本研究中，我们检测了内皮细胞S1P的作用1在BBB函数上使用第1季度iECKO公司老鼠。我们发现了第1季度iECKO公司小鼠表现出小分子选择性BBB开放，没有CNS炎症或损伤的主要迹象。这种大小选择性血脑屏障开放可归因于TJ蛋白亚细胞定位的变化。此外，我们通过药物阻断S1P成功地可逆地、选择性地打开了BBB1。

许多研究已经检查了BBB的开发或维护(2); 然而，关于小鼠体内BBB的大规模选择性破坏的证据有限。例如，氯化物5淘汰赛(32)以及两者的击倒氯化物5和奥克兰(33,34)，导致BBB对小分子的渗透性增强。这些报告强调了小分子通过BBB的转运可能通过细胞旁途径进行。有趣的是，在S1月1日iECKO公司小鼠（3–10 kDa）与氯化物5和奥克兰两次击倒(34). 因此，抑制S1P1-脑EC中调节的TJ蛋白功能可能允许小分子进入脑实质。

最近，另外两种分子，脂溶酶刺激的脂蛋白受体(39)和GPR116(40)，显示出以大小选择性的方式调节BBB渗透性。尽管TJ形态在这些模型中没有显示出重大变化(39,40)，仍然可以想象S1P1可能通过与这些分子合作来调节BBB功能。的确，S1P1和GPR116都是富含EC的GPCR，可能通过通用机制促进BBB维护。

作为增强障碍的GPCR，S1P1据报道，通过调节VE-钙粘蛋白在培养内皮细胞中的分布来调节AJ(10,41). 虽然我们的生化方法没有显示VE–钙粘蛋白亚细胞分布在第1季度iECKO公司AJ结构或功能的改变也可能参与这些小鼠血脑屏障渗漏的增加。

S1P丢失的分子机制1改变脑ECs中TJ蛋白的定位尚不清楚。一种可能性是S1P的持续激活1可能对大脑内皮细胞中皮质肌动蛋白的形成至关重要，它可以直接促进TJ蛋白复合物的适当维护(35). 重要的是，S1P1/Rac途径通过调节肌动蛋白相关蛋白、皮质素和肌球蛋白轻链激酶，在培养的内皮细胞中强烈诱导皮层肌动蛋白重排(10). 另一种可能性是S1P1调节TJ蛋白的磷酸化。克劳丁-5、闭塞素和ZO-1中有多个磷酸化位点(42)与肌动蛋白细胞骨架相互作用的增加和减少有关(43). 值得注意的是，这些磷酸化位点是c-Src、FAK、PI3Ks、Rho激酶和PKC的靶点(42)，可通过S1P进行调制1发送信号。需要进一步的研究来检测TJ磷酸化是否在第1季度iECKO公司小鼠，如果是，评估使用了哪些信号通路。

观察到BBB的尺寸选择性泄漏S1月1日iECKO公司小鼠可能影响中枢神经系统疾病的发生或发展。血液中发现高水平（～1μM）的S1P，超过一半的血浆S1P与高密度脂蛋白（HDL）有关(44). 重要的是，据报道，低血浆HDL浓度与痴呆症有关(45). 考虑到小分子（血管紧张素II）的BBB泄漏可能导致认知缺陷(30)，衰减HDL/S1P1-血脑屏障的依赖性收紧可能是痴呆的危险因素。最近的一项研究还表明，在小鼠缺血性脑损伤的早期阶段，BBB的破坏对小分子具有选择性(46). 最初的尺寸选择性BBB破坏归因于肌动蛋白细胞骨架的改变(46)这可能是BBB中断的机制第1季度iECKO公司小鼠，如上所述。重要的是，S1P1激动剂对缺血性卒中可能具有保护作用(9)抗凝蛋白S在S1P缺氧/缺血BBB破坏中发挥保护作用1-依赖方式(47). 总之，这些观察结果提高了脑内皮S1P的可能性1在缺血性脑损伤或痴呆中可能具有保护作用。

内皮S1P1可能是稳态血脑屏障功能的关键调节因子之一。S1P的张力激活1脑内腔侧的内皮细胞可能会拉紧细胞旁屏障，促进BBB功能。此外，S1P1活动也可以通过循环S1P从阴道侧调节。在淋巴器官中，多个血管周细胞成分维持局部血管周S1P梯度，这对免疫细胞贩运很重要(44). 最近的研究表明，BBB在睡眠-觉醒周期中具有高度动态性(48). 血脑屏障的可塑性似乎很重要，有助于保护大脑免受血液毒素的伤害，并消除大脑代谢的有害副产物。由于脑毛细血管内皮被NVU的其他细胞成分包围，S1P潜在的血管周围局部供应可能促进S1P1-通过与循环S1P合作维持依赖性BBB。

我们的研究还表明靶向内皮S1P1可能是向中枢神经系统输送治疗药物的一种有希望的方法。已经多次尝试绕过BBB进行中枢神经系统药物输送(4). 然而，BBB的大规模中断可能会对CNS造成破坏性后果(4). 因此，BBB的可逆性和有限开放性将是一种理想的中枢神经系统给药策略。事实上，使用FTY720和NIBR-0213，我们能够可逆地打开BBB。靶向S1P的BBB开放的尺寸选择性1还可以通过避免血液中的大分子转移到脑实质（如纤维蛋白原）引起的严重脑炎症或水肿，为CNS提供安全的化合物输送。这一观点得到了以下观察结果的进一步支持：第1季度iECKO公司小鼠的大脑没有任何炎症或胶质增生的迹象。的确，第1季度iECKO公司如果内皮细胞第1季度在成人阶段被删除。

值得注意的是，据报道S1P1-激动剂降低啮齿动物原位灌注实验中的P-糖蛋白（P-gp）转运活性(49). 在该研究中，FTY720通过其激动活性增加了药物在大脑中的积累。此外，作者发现两种S1P均未改变蔗糖在大脑中的分布1激动剂或拮抗剂，提示TJ介导的细胞旁BBB通透性可能不受S1P调节1虽然这种差异的原因尚不清楚，但示踪剂的化学性质差异（尸体碱或右旋糖酐vs.蔗糖）、模型系统（清醒小鼠vs.原位灌注）或配体给药途径（灌胃vs.颈动脉灌注）可能起了作用。未来的研究测试不同类别的示踪剂，包括P-gp底物第1季度iECKO公司小鼠将有助于更好地了解决定BBB功能特征的不同因素。

总之，我们已经证明内皮细胞S1P1以大小依赖的方式调节血脑屏障通透性。此外，我们已经证明S1P的药理靶向性1诱导BBB可逆性开放，这可能对药物安全输送到中枢神经系统具有潜在的治疗价值。S1P贡献的进一步调查1在其他NVU成分中，BBB的发展和维持将为S1P的未来治疗应用提供重要信息1多种中枢神经系统疾病的调节剂。

材料和方法

老鼠拉伤。

小鼠被安置在威尔康奈尔医学院的温度控制设施中的单独通风笼中，该设施具有12小时的光/暗循环。EC特定第1季度基因敲除小鼠(第1季度flox/flox公司 加拿大存托凭证5–Cre公司–急诊室T2段;第1季度iECKO公司)按说明生成(12,13,16,17). 小鼠出生后前3天口服他莫昔芬（50μg/d），并在10-16周龄时用于实验。在成人缺失实验中，8周龄小鼠连续三天口服他莫昔芬（100μg/g体重），并在最后一次注射他莫昔酚后4周用于实验。S1月1日flox/flox公司没有加拿大存托凭证5–Cre公司–急诊室T2段用三苯氧胺处理基因的方法与第1季度iECKO公司小鼠和用作对照小鼠(第1季度flox/flox公司). 所有实验均在雄性小鼠中进行。所有动物实验都得到了威尔-康奈尔动物护理和使用机构委员会（Weill Cornell Institutional animal Care and Use Committee）的批准。

示踪剂注入实验。

大脑示踪剂泄漏实验按所述进行(40,50). 将Alexa Fluor 555尸体碱（6μg/g；Invitrogen）、3-kDa右旋糖酐-TMR（10μg/g，Invitrogen）、10-kDa葡聚糖-TMR，或70-kDa左旋糖酐-TMR（100μg/g）溶解于盐水中，在小鼠（10–12周龄）的尾静脉内注射。在2小时（Alexa Fluor 555-尸体或3-kDa右旋糖酐-TMR）、4小时（10-kDa左旋糖酐-TMR）或16小时（70-kDa葡聚糖-TMR。解剖后，称量皮质并用1%Triton X-100在PBS中均质。皮质裂解物在12000×克在4°C下持续20分钟，并使用上清液量化荧光（激发/发射540/590 nm；SpectraMax M2e；分子器件）。相对荧光值用皮质重量标准化。

视网膜示踪剂渗漏实验按所述进行(51). 在深度异氟醚麻醉下，静脉注射3-kDa右旋糖酐–TMR（50μg/g）。10分钟后，打开胸腔，用冰冷的PBS灌注小鼠7分钟。灌注后，取出视网膜并在蒸馏水中匀浆。提取物通过30000分子量过滤器（Amicon Ultra-0.5 mL；Millipore）在13000×克持续10分钟。测量每个300μL样品中的荧光（激发/发射540/590 nm；SpectraMax M2e）。

脑微血管碎片。

大脑微血管碎片的制备如下所述(52,53)稍作修改（详见SI材料和方法).

qPCR分析、免疫印迹分析和免疫组织化学。

RNA分离、RT-qPCR分析、总裂解物或亚细胞组分的制备、蛋白质印迹和免疫荧光实验如SI材料和方法。

正常。

NOR任务的执行如所述(30)（详见SI材料和方法).

药物治疗。

FTY720和NIBR-0213是诺华公司赠送的礼物。为了检查FTY720的作用，给小鼠服用5 mg·kg−1●天−1连续三天口服FTY720或载体（水）。在最后一次注射FTY720后1或7天，将这些小鼠用于示踪注射实验。对于NIBR-2013实验，小鼠通过口服灌胃给予60 mg/kg NIBR-0213或载体[30%（vol/vol）PEG/磷酸盐缓冲液（pH 7.4）]。在NIBR-0213注射后6或48小时，将小鼠用于示踪剂注射实验。

统计分析。

使用双尾Student’s进行统计分析吨使用Prism软件（GraphPad）进行Bonferroni多重比较测试或单向方差分析。P（P）数值<0.05被认为具有统计学意义。所有结果均表示为平均值±SD。

SI材料和方法

脑微血管碎片。

大脑微血管碎片的制备如下所述(52,53)稍作修改。收集大脑并在补充有0.5%无脂肪酸BSA（Fisher）的MCDB131培养基（Corning）中冲洗。通过肉眼解剖将小脑、脑干、白质和软脑膜在冰上切除，并用7毫升宽松的Dounce组织研磨机将皮质在8毫升PBS中均匀化，每次10次。匀浆在2000×克在4°C下保持5分钟。将颗粒悬浮在PBS中15%（wt/vol）70-kDa右旋糖酐（Sigma；目录号31390）中，并在10000×克在4°C下保持15分钟。将颗粒（包含微血管片段）重新悬浮在补充有0.5%无脂肪酸BSA的MCDB131中，捕获在40μm的细胞过滤器（Corning）中，用5mL PBS洗涤，并用补充有0.5%脂肪酸无BSA的5mL MCDB 131收集到50-mL猎鹰管中。用PBS清洗微血管碎片，并用于蛋白质提取或分离。新鲜微血管制剂也全部应用于玻璃载玻片（每张载玻片200μL培养基中），用玻璃盖玻片覆盖，并立即使用亮场显微镜成像（观察者Z1；蔡司）。使用AxioCam MRm（蔡司）的10倍镜头拍摄图像，并使用ImageJ软件进行编辑，以提高未染色组织的对比度。

qPCR分析。

根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从皮层、海马或脑微血管提取总RNA。通过使用具有随机引物的SuperScript III FirstStrand Synthesis Kit（Invitrogen）或qScript XLT cDNA SuperMix（Quanta）进行逆转录。使用PerfeCTa SYBR Green FastMix Low ROX（Quanta）在7500实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行实时PCR。用于基因表达的引物如下（F，正向；R，反向）：

  • 第1季度F： ATGGTGTCCACTAGCATCCC公司
  • R： CGATGTTCAACTTGCCTGTGTAG公司
  • 第1季度第2季度F： ATGGGCGGCTTATACTCAGAG公司
  • R： GCGCAGCACAAGATGAT公司
  • 第三季度F： GCCTAGCGAGAGAACCT公司
  • R： CCGACTGCGGGAGAGTGT公司
  • 佩卡姆1F： TTGAGCCTCACCAAGAGAACGGAA公司
  • R： AATCCAGGAATCGGCTGCTCTTCT公司
  • 德F： AGGAAGAAAGAGAGAGAAAATG公司
  • R： CAGGTGAGGAGCAGAGTGAGAGAG公司
  • Slco1c1公司F： gtccagcagtcaccaag公司
  • R： CCCAGGAAGACATACACA公司
  • Slc2a1系列F： GAGAGCCCATCCATCCAC公司
  • R： GAGAAGCCATAGAGCA公司
  • Abcb1a型F： GCCAACATAGCGCTCC
  • R： TCCCAGTCCCCACCCTCT公司
  • Mfsd2a公司F： CGTGCGGGAGAGAGA公司
  • R： AAGCCAGGGAGGTAAAAAGGAAG公司
  • Zic3公司F： ACCCTTCCGTGTCCCTTC公司
  • R： GGGCTTGTCCGAGGTGTG
  • 学报2F： CGGGAGAAAATGACCCAGA公司
  • R： CCAGAGCCAGCAATACA公司
  • Pdgfrb公司F： TCTTGGCTCTCGGGCTTC公司
  • R： GCTTCTCGCTACTTGTGCTGT
  • Gfap公司F： gttgaatcctggaggga
  • R： CGCTGTGAGGTCGCTTTG公司
  • 问题4F： GCTTCTCGCTACTTGTGCTGT
  • R： CCACATCAGGACAGAGACATACTC公司
  • 制造商8F： GAGGAGCAAGGAGCAGCAA公司
  • R： TGCGGTTATGCAGGACAC公司
  • Mrc1公司F： 猫
  • R： CCCCCCCTCCTTCCTACAA公司
  • Lyve1号机组F： TGGGAAGAAATGGCAAAGGTG公司
  • R： TCCAACAGGGGTAAAAATGTG公司
  • 伊尔1bF： CTCTCCACCTCAATGACAGA公司
  • R： TTTTGTCGTTGCTTGGTTCC公司
  • 伊尔6F： ATGGATGCTACAACTGGAT公司
  • R： TGAAGGACTCTGGCTTGTCT公司
  • Tnfa公司F： TTGGAGTCATTGTCTGAA公司
  • R： GGGTCAGAGTAAAGGGGTCAG
  • 氯化物5F： CCAGAGAGGCACAGA公司
  • R： AGACAGACCACA（阿加卡卡卡卡卡）
  • 奥克兰F： AGATTCTCTGACCTTGTGTGGG公司
  • R： TCCTGCTTTCCCCTTCGTG公司
  • Tjp1型F： 关贸总协定
  • R： TCGCAAACCCACACTATCCC公司
  • 加拿大存托凭证5F： TAGCAAGAGTGCGCTGGATTCA公司
  • R： ACACATCATAGCTGGTGGTTCCA公司
  • 卢比0F： CTGAGATTCGGATATGTGTTG公司
  • R： AAAGCCTGAAGAAGGAGGTCTT。

脑微血管总裂解物和亚细胞组分的制备。

在两次冷冻/解冻循环后，将微血管碎片重新悬浮在200μL 2×SDS样品缓冲液中。然后对裂解产物进行超声处理，并在12000×克持续5分钟，使用上清液（每个10μL）进行免疫印迹分析，如下所述。根据制造商的说明，使用ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒（Calbiochem）从snap冷冻微血管碎片中提取四种亚细胞组分，包括细胞溶质、膜、核和细胞骨架组分。共使用200μL提取缓冲液I/II或100μL提取缓冲液III/IV进行分级，分别使用20或10μL裂解物进行免疫印迹分析。

免疫印迹分析。

将总提取物或分馏蛋白质样品分离成8%、12%或15%（wt/vol）的聚丙烯酰胺凝胶，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。转移的蛋白质用5%（wt/vol）脱脂奶封闭，并用抗克劳丁-5（1:5000；Invitrogen，目录号35-3500）、闭塞素（1:2000；Invit罗gen，分类号331500）、ZO-1（1:1000；Invitrogen；目录号617300）、VE-cadherin（1:500；研发，目录号AF1002）、CD31（1:2000，Dianova，目录编号SZ31）、，和S1P1（1:1000；圣克鲁斯，目录号sc-25489）。使用ImageJ软件对图像进行密度分析，获得相对带强度。

免疫组织化学。

麻醉小鼠用冰冷的PBS灌注，然后用冰冷的4%（wt/vol）多聚甲醛（PFA）在PBS中灌注。在4°C下用4%的PFA在PBS中固定大脑过夜，然后用PBS彻底清洗。固定的大脑在振动体上以50μm切片。切片在封闭缓冲液（1%BSA和0.5%Triton X-100，PBS）中通透并封闭过夜，然后与一级抗体、胶原蛋白IV（1:300；Serotec，目录号2150-1470）、CD13（1:300，Serotec目录号MCA2183EL）、CD31（1:100；Dianova，目录号SZ31）和GFAP（1:400；Invitrogen，目录编号180063）孵育在4°C的封闭缓冲液中以恒定搅拌进行稀释。与一级抗体孵育2天后，将切片在洗涤缓冲液（PBS中0.5%Triton X-100）中洗涤6 h，并用荧光二级抗体（1:200；Alexa荧光染料；Invitrogen）在4°C下在封闭缓冲液中稀释24 h。然后用清洗缓冲液清洗切片6小时，将其安装在ProLong Gold Antifade Mountant（Life Technologies）中，并使用Olympus FluoView FV10i共焦显微镜进行成像。所有呈现的图像都是z（z）-堆栈。使用Adobe Photoshop、ImageJ或斐济软件（国家卫生研究院）进行图像处理和量化。对IV型胶原或CD13阳性免疫荧光信号进行阈值处理，并使用斐济软件量化其信号所占的面积。通过将CD13阳性区域归一化为IV型胶原阳性区域来确定周细胞覆盖率。血管密度通过将IV型胶原阳性区域归一化为皮质总面积来确定。在骨骼化的胶原IV信号上量化分支点数，并将其标准化为皮层的总面积。根据骨骼化IV型胶原信号量化血管总长度，并通过将IV型胶原阳性区域除以总血管长度来确定血管直径。给出了每种基因型的三只独立动物的平均值±SD。

在甲醇固定的新鲜冷冻脑切片（30μm）上对TJ蛋白进行免疫组织化学染色。漂浮部分在封闭缓冲液中通透并隔夜封闭（1%BSA和0.5%Triton X-100在PBS中），然后用以下主要抗体隔夜培养：claudin-5（1:400；小鼠IgG1，Alexa Fluor 488-conjugated；Invitrogen，目录号352588）或cloddin（1:400）；小鼠IgG1、Alexa Fluor 488-conjugated、Invitrogen，目录号331588）和ZO-1（1:300；Invitrogen，目录编号617300），在4°C下持续搅拌。将切片在洗涤缓冲液（PBS中0.5%Triton X-100）中洗涤3 h，并在4°C下用荧光二级抗体（1:300；驴抗兔IgG，Alexa Fluor 568-conjugated；Invitrogen）孵育过夜，以观察ZO-1。清洗切片3 h，然后用上述荧光二级抗体（1:400；山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 405-conjugated；Invitrogen）对谷氨酸1（1:400，兔子IgG；目录号07-1401，Millipore）进行免疫染色。为了避免抗ZO-1和抗谷氨酸抗体之间的交叉反应，用驴抗兔Fab片段（1:100；Jackson Laboratories）孵育切片，并用4%PFA固定，然后用抗谷氨酸1抗体孵育。切片安装在ProLong Gold Antifade Mountant上，并使用蔡司LSM 800和Airyscan共焦显微镜进行成像。三维重建z（z）-显示堆栈（XY投影或YZ投影）图像。对于claudin-5或clodin与ZO-1的共定位分析，免疫荧光信号经过阈值处理，并使用ZEN软件（Zeiss）盲法分析Pearson的共定位。图像(21–30)对每种基因型的三只独立动物进行分析，结果以平均值±SD表示。

正常。

NOR任务是在昏暗的光线下在一个29×47×30厘米高的塑料盒中进行的，如所述(30). 刺激物由不同颜色和形状的塑料物体组成，但大小相似。使用安装在盒子正上方墙上的摄像机记录测试过程，以进行离线分析。试验前，小鼠（16周龄）在试验室和试验室中适应1 d（在试验室中30 min，在空盒子中探索5 min）。在习惯化24小时后，将小鼠放在同一个盒子里，有两个相同的样品物体，并允许其探索5分钟。在间隔1小时后，小鼠被放在相同的盒子里，但两个物体中的一个被一个新物体取代。让小鼠探索5分钟。探索行为随后由对治疗组不知情的实验者手动评估。物体探测被定义为鼠标在观察物体时嗅物体或触摸物体(31). 在测试阶段（～10 s），使用了两个物体的最小探测时间（总探测时间）。探索新物体所花费的时间用总探索时间的百分比表示，并提供了识别记忆的指标。

致谢

我们感谢Steven Swendeman、Akira Ito、Nichole Chang（Weill Cornell Medicine）、Christer Betsholtz、Bonnam Jung（乌普萨拉大学）、Annika Keller和Josephin Wagner（苏黎世大学医院）提供的技术帮助和建议。这项工作得到了NIH拨款HL89934、HL117798和HL135821（给T.H.）、NS89323、NS95441和NS100447（给C.I.）以及HL094465（给T.S.）的支持；Leducq跨大西洋网络基金会拨款（给T.H.、C.I.和T.S.）；美国心脏协会拨款GIA12GRNT12050110（给T.S.）和15SDG22760007（给G.F.）。K.Y.得到了日本科学促进会的支持。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/lookup/supl/doi:10.1073/pnas.1618659114/-/DC补充。

工具书类

1Zhao Z，Nelson AR，Betsholtz C，Zlokovic BV。血脑屏障的建立和功能障碍。单元格。2015;163:1064–1078. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Chow BW，Gu C.血脑屏障的分子成分。《神经科学趋势》。2015;38:598–608. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Obermeier B、Daneman R、Ransohoff RM。血脑屏障的发展、维护和破坏。自然医学。2013;19:1584–1596. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4华盛顿银行。从血脑屏障到血脑界面：中枢神经系统药物输送的新机会。Nat Rev药物发现。2016;15:275–292.[公共医学][谷歌学者]
5帕德里奇WM。血脑屏障：脑药开发的瓶颈。NeuroRx公司。2005;2:3–14. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Proia RL，Hla T.1-磷酸鞘氨醇的新兴生物学：其在发病机制和治疗中的作用。临床投资杂志。2015;125:1379–1387. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Brinkmann V等人。Fingolimod（FTY720）：一种治疗多发性硬化症的口服药物的发现和开发。Nat Rev药物发现。2010;9:883–897.[公共医学][谷歌学者]
8Brunkhorst R、Vutukuri R、Pfeilschifter W.Fingolimod治疗神经疾病——游戏状态和未来展望。前细胞神经科学。2014;8:283. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Sanchez T.内皮疾病中的鞘氨醇-1-磷酸信号传导。当前动脉粥样硬化代表。2016;18:31.[公共医学][谷歌学者]
10Xiong Y，Hla T.S1P对内皮完整性的控制。当前顶级微生物免疫学。2014;378:85–105. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Oo ML等。S1P的参与1-降解机制导致小鼠血管渗漏。临床投资杂志。2011;121：2290–2300。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Jung B等。流量调节内皮S1P受体-1信号传导维持血管发育。开发单元。2012;23:600–610. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Montrose DC等人S1P1在溃疡性结肠炎中定位于结肠血管系统并保持血管完整性。脂质研究杂志。2013;54:843–851. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Christensen PM等。载脂蛋白M缺乏小鼠的内皮屏障功能受损依赖于鞘氨醇-1-磷酸受体1。美国财务会计准则委员会J。2016;30：2351–2359。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Allende ML、Yamashita T、Proia RL。G蛋白偶联受体S1P1在内皮细胞内起作用，调节血管成熟。鲜血。2003;102:3665–3667.[公共医学][谷歌学者]
16Blaho VA等。结合高密度脂蛋白的1-磷酸鞘氨醇抑制淋巴生成和神经炎症。自然。2015;523:342–346. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Galvani S等。结合HDL的1-磷酸鞘氨醇作为内皮细胞受体S1P1的偏向性激动剂，限制血管炎症。科学信号。2015;8：ra79。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18London A、Benhar I、Schwartz M。视网膜作为大脑的窗口，从眼睛研究到中枢神经系统疾病。Nat Rev Neurol公司。2013;9:44–53.[公共医学][谷歌学者]
19Whiteus C，Freitas C，Grutzendler J.在出生后的关键时期，受干扰的神经活动会干扰脑血管生成。自然。2014;505:407–411. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Wälchli T等人，出生后小鼠大脑中血管生成、灌注血管和内皮尖端细胞的定量评估。国家协议。2015;10:53–74.[公共医学][谷歌学者]
21Ben-Zvi A等人。Mfsd2a对血脑屏障的形成和功能至关重要。自然。2014;509:507–511. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Gaengel K等人。鞘氨醇-1-磷酸受体S1PR1通过调节VE-cadherin和VEGFR2之间的相互作用来限制新生血管的萌芽。开发单元。2012;23:587–599.[公共医学][谷歌学者]
23Ben Shoham A等。S1P1在血管发育过程中抑制新生血管的萌芽。发展。2012;139:3859–3869.[公共医学][谷歌学者]
24Paik JH等。N-钙粘蛋白的鞘氨醇1-磷酸受体调节介导血管稳定。基因发育。2004;18:2392–2403. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Zeisel A等人。大脑结构。单细胞RNA-seq显示小鼠皮层和海马的细胞类型。科学。2015;347:1138–1142.[公共医学][谷歌学者]
26Engelhardt B，Ransohoff RM。捕获、爬行、穿越：突破血脑屏障的T细胞代码。趋势免疫。2012;33:579–589.[公共医学][谷歌学者]
27Lambertsen KL、Biber K、Finsen B.实验性和人类中风中的炎症细胞因子。大脑血流代谢杂志。2012;32:1677–1698. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Zlokovic BV。阿尔茨海默病和其他疾病中神经变性的神经血管途径。Nat Rev神经科学。2011;12：723–738。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Sagare AP、Bell RD、Zlokovic BV。阿尔茨海默病中的神经血管功能障碍和淀粉样β肽清除缺陷。冷泉Harb Perspect Med。2012;2：a011452。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Faraco G等。血管周围巨噬细胞介导与高血压相关的神经血管和认知功能障碍。临床投资杂志。2016;126：4674–4689。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Leger M等人。小鼠物体识别试验。国家协议。2013;8:2531–2537.[公共医学][谷歌学者]
32Nitta T等。克劳丁-5缺乏小鼠血脑屏障的选择性松解。细胞生物学杂志。2003;161:653–660. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Campbell M等人。RNAi介导的血脑屏障可逆开放。基因医学杂志。2008年；10:930–947.[公共医学][谷歌学者]
34Keaney J等。淀粉样蛋白-β通过血脑屏障的细胞旁自动清除。科学高级。2015;1：e1500472。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Spindler V，Schlegel N，Waschke J.GTPases在微血管通透性控制中的作用。心血管研究。2010;87:243–253.[公共医学][谷歌学者]
36Gräler MH、Goetzl EJ。免疫抑制剂FTY720下调1-磷酸鞘氨醇G蛋白偶联受体。美国财务会计准则委员会J。2004;18:551–553.[公共医学][谷歌学者]
37Oo ML等。免疫抑制和抗血管生成鞘氨醇1-磷酸受体-1激动剂诱导受体的泛素化和蛋白酶体降解。生物化学杂志。2007;282:9082–9089.[公共医学][谷歌学者]
38Quancard J等。一种有效且选择性的S1P（1）拮抗剂，对实验性自身免疫性脑脊髓炎有效。化学生物。2012;19:1142–1151.[公共医学][谷歌学者]
39Sohet F等人LSR/angulin-1是一种参与血脑屏障形成的三细胞紧密连接蛋白。细胞生物学杂志。2015;208:703–711. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Niaudet C等。Gpr116受体调节肺细胞和血管内皮的独特功能。公共科学图书馆一号。2015;10：e0137949。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Lee MJ等。1-磷酸鞘氨醇诱导的血管内皮细胞粘附连接组装和形态发生。单元格。1999;99:301–312.[公共医学][谷歌学者]
42González-Mariscal L、Tapia R、Chamorro D。紧密连接元件与信号通路的串扰。Biochim生物物理学报。2008年；1778:729–756.[公共医学][谷歌学者]
43Bazzoni G，Dejana E.内皮细胞-细胞连接：分子组织和在血管内稳态中的作用。生理学评论。2004;84:869–901.[公共医学][谷歌学者]
44Yanagida K，Hla T.循环鞘氨醇1-磷酸梯度的血管和免疫生物学。《生理学年鉴》。2017;79:67–91. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Vitali C、Wellington CL、Calabresi L.HDL和大脑中胆固醇的处理。心血管研究。2014;103:405–413.[公共医学][谷歌学者]
46Shi Y，等。内皮细胞骨架的快速重组可导致早期血脑屏障破坏和长期缺血再灌注脑损伤。国家公社。2016;7:10523. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Zhu D等。蛋白质S通过TAM受体Tyro3和1-磷酸鞘氨醇受体控制缺氧/缺血血脑屏障的破坏。鲜血。2010;115:4963–4972. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Keaney J，Campbell M.动态血脑屏障。FEBS J公司。2015;282:4067–4079.[公共医学][谷歌学者]
49Cannon RE、Peart JC、Hawkins BT、Campos CR、Miller DS。靶向血脑屏障鞘脂信号降低基础P-糖蛋白活性并改善药物向大脑的传递。美国国家科学院院刊。2012;109:15930–15935. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Armulik A等人。周细胞调节血脑屏障。自然。2010;468:557–561.[公共医学][谷歌学者]
51Muranaka K等人。过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其配体对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型中血-视网膜屏障的影响。投资眼科视觉科学。2006;47:4547–4552.[公共医学][谷歌学者]
52Biegel D、Spencer DD、Pachter JS。分离和培养人脑微血管内皮细胞用于体外血脑屏障特性研究。大脑研究。1995;692:183–189.[公共医学][谷歌学者]
53Boulay AC、Saubaméa B、Declèves X、Cohen-Salmon M。小鼠脑血管的纯化。J签证费用。2015;（105）：e53208。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院