OPA1需要丝裂原融合蛋白1来促进线粒体融合

摘要

线粒体是细胞生死的关键细胞器：它们产生最多的细胞ATP，形成胞浆钙²⁺瞬变，并通过释放有效激活效应半胱天冬酶所需的蛋白质辅因子来整合多种凋亡刺激(1,2). 这种功能多样性与复杂的结构组织相匹配。线粒体嵴已被确定为一个单独的隔室，通过狭窄的管状连接与薄的膜间间隙相连(三)可能会沿嵴产生离子和小分子梯度(4)负责细胞色素的分离c（c）在嵴室(5,6). 在某些细胞类型的细胞溶质中，线粒体组织在一个由单个细胞器组成的网络中，这些细胞器动态地融合和分裂(7,8)产生功能性线粒体电缆。这个组织允许刺激击中线粒体导线一端的刺激很容易传递到网络的远端组件(9)，对于心肌细胞等大细胞来说是一种有用的特性(10). 另一方面，线粒体也可以作为其他细胞类型中的单个单位，例如胰腺β细胞(11). 线粒体的形状不是静态的，因为在有丝分裂期间，线粒体分裂并分裂为子细胞(12). 在细胞凋亡过程中，线粒体形态发生了重大变化，包括线粒体网络断裂、嵴融合和嵴连接扩大(6,13).

线粒体结构的动态控制是由一组不断增长的“线粒体形成”蛋白质执行的，这些蛋白质包括前融合和前分裂成员，其中一些已在芽殖酵母中鉴定出来(14). 酵母线粒体的分裂是通过向外膜补充动力相关的大GTPase Dnm1p来完成的，在外膜中它与适配器Mdv1p和完整的膜蛋白Fis1p形成复合物(15–18). 融合涉及定位于外膜和内膜的蛋白质。GTPase Fzo1p发挥了关键作用(19,20)与外膜中的适配器Ugo1p相互作用(21)并与内膜动力蛋白相关蛋白Mgm1p结合，协调两个并列线粒体的四个膜的融合(22–24).

哺乳动物直系动物DNM1（DNM1）和FIS1系统称为动力相关蛋白1(图纸1)以及hFis1型已分别鉴定并证明参与线粒体分裂(25–27). 融合过程似乎更为复杂。两个FZO1型已经鉴定出同源物，丝裂原(Mfn公司)1和2(28,29). 两者都是胚胎发育所必需的，在小鼠中的基因消融证实了这一点(30)，但尚不清楚是否Mfn公司冗余反映了MFN1和MFN2之间的特定功能差异。mgm1p的哺乳动物同源物是内膜动力相关蛋白OPA1。中的突变Opa1公司与遗传性视神经病变的主要病因常染色体显性视神经萎缩有关(31,32). 有人提出OPA1参与裂变/碎裂途径(33–35)或维持线粒体网的结构完整性(36)，但到目前为止，OPA1的功能尚不清楚，它与其他线粒体形成蛋白的相互作用也不清楚。

在此，我们研究了OPA1在控制线粒体形状中的作用。遗传分析表明，OPA1需要MFN1而不是MFN2来诱导线粒体融合。我们的结果确定了OPA1在哺乳动物线粒体融合中的作用，并揭示了MFN1和MFN2之间的功能差异。

实验程序

质粒构建。小鼠OPA1 cDNA(33)（对应于人类转录变体1；东京东京大学Y.Kubo的一份礼物）被亚克隆到克拉pMSCV（BD-Clontech）的I站点。使用QuikChange（Stratagene）产生OPA1的K301A和R905停止突变体，并通过DNA测序确认。有关使用的其他质粒的详细信息，请参阅支持材料和方法，发布为支持信息在PNAS网站上。

RNA干扰（RNAi）。通过使用p消音器2.1-U6/hygro（德克萨斯州奥斯汀Ambion）。有关这一点和稳定克隆生成的详细信息，请参阅支持材料和方法。

成像。有关外荧光、实时和静态共焦成像系统、参数和操作的详细信息，请参阅支持材料和方法.

聚乙二醇（PEG）熔融测定。PEG融合分析，5×10⁵用线粒体靶向黄色荧光蛋白（mtYFP）或线粒体靶向dsRED（mtRFP。24小时后，将标记有不同荧光蛋白的细胞以1:1的比例连接到13-mm圆形盖玻片上。24小时后，用50%（wt/vol）PEG 1500在PBS（Sigma）中的溶液进行60秒的处理，然后在补充10%FCS的DMEM中进行广泛清洗，诱导融合。抑制从头开始在PEG处理细胞前30分钟，用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（20μg/ml，Sigma）培养荧光蛋白的合成，随后将其保存在所有溶液和组织培养基中，直到细胞在PBS中用冰镇3.7%（vol/vol）甲醛固定30分钟。用PBS洗涤两次后，盖玻片用防伪试剂（分子探针）安装在载玻片上。

结果

OPA1诱导线粒体管形成。我们研究了OPA1的表达是否影响线粒体形态。129/SvEv背景下WT-MEFs的瞬时转染(30)带OPA1(33)根据免疫印迹法判断，24小时后OPA1水平升高了几倍（图5，发布为支持信息在PNAS网站上）。线粒体靶向氰基荧光蛋白（mtCFP）转染的WT MEF成像显示线粒体为单个、杆状或圆形细胞器，平均长度为3±0.34μm(n个=五个不同实验中的100个细胞）(图1A类). 形态计量学分析证实，只有23%的分析细胞显示出细长的线粒体，即轴长>5μm、圆度指数<0.5的细胞，在>50%的线粒体中(图1我). 当mtCFP与OPA1共转染时，线粒体呈管状并在分支网络中相互连接，轴向长度可达18μm(图1B类). 超过50%的转染细胞显示线粒体拉长(图1我). OPA1在HeLa中的强过表达(35)和COS-7(33)细胞引起小线粒体聚集，而在3T3成纤维细胞中，它促进小管化(37). 我们测试了强CMV启动子OPA1是否会导致MEF中的线粒体断裂。转染pCDNA3.1-OPA1的MEF中OPA1的水平比转染pMSCV-OPA1的高出3倍以上。然而，pCDNA3.1-OPA1也促进了MEF中的线粒体伸长（数据未显示）。这一发现表明，OPA1的过度表达只会导致线粒体断裂，而线粒体已经组织在相互连接的小管网络中，例如HeLa细胞。

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图1。

OPA1的过度表达促进线粒体伸长。(A类–H（H）)GTP酶和卷曲螺旋结构域突变的影响。显示了转染线粒体形成蛋白的MEF中的线粒体形状。在盖玻片上生长的WT MEF与mtCFP和空载体共转染(A类)，WT OPA1(B类)，K301A OPA1(C类)，R905停止OPA1(D类)，Mfn1(E类)，Mfn2(F类)，WT DRP1(G公司)或K38A DRP1(H（H）). 24小时后，从随机选择的细胞中采集mtCFP荧光图像，进行反褶积并存储。（比例尺，15μm）(我)线粒体伸长的形态分析。将生长在盖玻片上的WT MEF与mtCFP和空载体或指定的线粒体形成蛋白共同转染。24小时后，采集、反褶积、存储20个随机选择的mtCFP荧光图像，然后按照支持材料和方法数据表示14个不同实验的平均值±SE。(J型–M（M）)MEF线粒体网络的三维立体重建。盖玻片上生长的MEF与mtYFP和空载体共转染(J型)或OPA1(L（左）)，24小时后，随机选择共焦z（z）-获取、存储、重建mtYFP荧光的轴堆栈，并按支持材料和方法.K（K）和M（M）表示装箱区域的3倍放大倍数J型和L（左）分别是。堆叠深度为20μm。（比例尺，15μm）

我们将观察到的OPA1对线粒体形态的影响与其他线粒体形成蛋白诱导的影响进行了比较。MFN1或MFN2表达后，杆状线粒体簇与细长的细胞器共存(28,29,38) (图1E类和F类). 量化显示，这些蛋白对MEF中线粒体微管形成有积极影响，尽管低于OPA1诱导的作用(图1我). 分裂蛋白DRP1的表达导致球形和分散线粒体的出现(图1G公司和我)而其显性阴性K38A突变体(26)促进线粒体延伸和相互连接的线粒体微管的形成(图1H（H）和我). MEF似乎是研究线粒体形成蛋白的有效模型细胞系。

在常规成像中，进出焦平面的管状结构很容易被误认为是单个杆状或球形细胞器。因此，我们沿着z（z）-整个细胞的轴，然后进行三维图像重建和体积绘制。在模拟转染的MEF中，线粒体被分离并分散在整个细胞液中，在高倍放大下可以看到单个细胞器的簇(图1J型和K（K）). 转染OPA1的细胞显示出一个错综复杂的线粒体网络，线粒体高度互联，横跨整个细胞质(图1L（左）和M（M）). 因此，在MEF中OPA1的过度表达导致细长线粒体网络的有效形成。

OPA1的功能和水平决定了线粒体网的形状。 OPA1（作战行动1）受显性视神经萎缩影响，其突变聚集在GTPase和C末端线圈结构域(39). 由于该病是作为显性性状传播的，因此有人建议这些突变要么作为显性阴性，要么导致单倍体不足状态，从而导致临床表型(36,40). 因此，我们测试了OPA1的致病突变或OPA1水平降低是否改变了线粒体形态。我们通过将Lys-301分别替换为Ala（K301A OPA1）和Arg-905替换为终止密码子（R905stop OPA1）来生成OPA1 GTPase和线圈结构域的突变体。研究表明，K301A突变使OPA1的GTPase活性降低了>80%，而R905stop突变缺乏被认为参与蛋白质-蛋白质相互作用的C末端线圈结构域(35). 转染K301A或R905stop OPA1导致OPA1水平与转染WT OPA1后观察到的OPA1水平相当（图5），表明这些突变并不影响蛋白质稳定性。K301A转染细胞的线粒体(图1C类)或R905停止OPA1(图1D类)呈球状。这两个突变体诱导的线粒体伸长减少与转染裂变蛋白DRP1后观察到的结果相当(图1我).

为了解决OPA1水平降低对线粒体形态的影响，我们转向稳定的质粒生成RNAi。我们从129/CD1混合背景中生成了MEF的克隆(41)稳定表达加扰（对照）或OPA1靶向RNAi。在OPA1缺失克隆A7中，OPA1水平与对照克隆H4相比约为30%(图2A类). 其他线粒体形成蛋白，如DRP1、hFIS1和MFN2，未受影响（数据未显示）。克隆A7线粒体呈球状且破碎，而克隆H4的细胞器呈杆状且细长(图2B类; 参见中的形态分析图2C类). 利用克隆H4中的19-mer双链RNA对OPA1进行瞬时RNAi，可以实现线粒体的碎片化，这表明克隆A7中观察到的线粒体形态并非由于该特定克隆的长期适应所致（数据未显示）。在其他筛选克隆中，线粒体断裂程度与OPA1表达水平相关（数据未显示）。综上所述，这些数据表明，OPA1的水平以及OPA1的GTPase和线圈结构域的完整性决定了线粒体形态。

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图2。

线粒体形状、线粒体融合和RNAi对抗OPA1后对丝裂原融合蛋白的反应。(A类)MEF克隆中OPA1的表达水平。电池（5×10⁶)从携带pSilencer-control的克隆H4和携带pSillecer-OPA1的克隆A7中进行裂解，分离等量的蛋白质，并用抗OPA1（1:2000）抗血清和抗肌动蛋白单克隆抗体（1:2000，Chemicon）进行免疫印迹。(B类)OPA1消融后线粒体形态和对丝裂原融合蛋白的反应。来自在盖玻片上生长的克隆H4和A7的MEFs用mtCFP转染或用指示的有丝分裂融合蛋白共转染。24小时后，采集的mtCFP荧光图像与图1A类–H（H）（比例尺，15μm）(C类)形态分析。如图所示，转染盖玻片上生长的H4和A7 MEF。实验完全按照图1我数据表示四个不同实验的平均值±SE。(D类)来自H4和A7克隆的代表性异多核体。将所示克隆的MEF转染mtYFP或mtRFP，在玻璃盖玻片上进行共涂层，并按照实验程序，4小时后固定。显示了代表性多核体的共焦图像。（比例尺，20μm）(E类)定量OPA1消融对线粒体PEG融合分析的影响。按照中所述进行实验D类，但细胞在指定时间固定。线粒体融合评估如实验程序从30个随机选择的多核体中。数据表示三个不同实验的平均值±SE。

OPA1参与线粒体融合。线粒体的形状是融合和裂变事件之间平衡的结果。原则上，从杆状小叶到管状线粒体的转变可能是由于融合增加和裂变减少所致。我们讨论了OPA1控制的聚变/裂变平衡的方向。我们对克隆H4和A7进行了PEG融合分析。转染mtYFP或mtRFP的MEF通过PEG处理进行共涂层并触发融合。微分干涉对比光学显微镜显示，早在治疗后30分钟就出现了细胞质融合，2小时后大量多核细胞变得明显。我们通过测量mtYFP和mtRFP同时阳性的线粒体比例来量化异多核细胞中的融合事件，由于靶序列在线粒体导入后被裂解，因此不能在线粒体之间交换。因此，双重标记仅报告线粒体融合与基质成分混合。PEG处理4小时后，来自对照克隆（H4）的多核体显示约65%的线粒体黄荧光蛋白和红荧光蛋白阳性(图2D类和E类). 线粒体融合随时间增加，8小时后达到78%。克隆A7中OPA1的消融破坏了融合，即使8小时后也将其降至≈52%(图2D类和E类). 我们求助于WT MEF来研究OPA1水平增加是否会增强线粒体融合。PEG处理后，WT MEF中黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白阳性的线粒体数量线性增加，8h后达到≈55%(图3C类和D类，开放方块）。OPA1在2小时后将融合率提高到≈50%，8小时后将其提高至≈80%(图3C类和D类，填充方块）。另一方面，K301A-OPA1损害线粒体融合，8小时后降至31±3.4%（数据未显示）。这些结果表明，OPA1的水平和功能通过影响细胞器融合来调节线粒体形状。

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图3。

OPA1通过促进MFN1依赖的线粒体融合改变线粒体网的形状。(A类)OPA1对WT线粒体网络形态的影响，Mfn1公司–/–，以及Mfn2公司–/–MEF。将生长在盖玻片上的指示基因型的MEF与mtCFP和空载体共转染(左侧)或OPA1(赖特). 当指示时，MFN1或MFN2与mtCFP在Mfn1型–/–MEF。24小时后，采集的mtCFP荧光图像与图1A类–H（H）.(B类)WT的形态分析，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–线粒体。将生长在盖玻片上的指示基因型的MEF与mtCFP和空载体（黑色条）或OPA1（灰色条）共转染。如有指示，Mfn1公司–/–通过与MFN1或MFN2共转染来补充细胞。实验完全按照图1我数据表示九个不同实验的平均值±SE。(C类)用mtYFP或mtRFP转染指定基因型的MEF(左侧)或与mtYFP或mtRFP加OPA1联合转染(赖特)，镀铜在玻璃盖玻片上，与PEG熔融，如实验程序，4小时后固定。显示了代表性多核体的共焦图像。（比例尺，20μm）(D类)OPA1对WT融合影响的量化，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–线粒体。实验按照C类，但异多核体在指定时间固定。在用钻石描绘的实验中，Mfn1–/–细胞与mtYFP或mtRFP+MFN1（⋄）以及mtYFP-或mtRFP+MFN1和OPA1共同转染(♦). 线粒体融合评估如实验程序从30个随机选择的多核体中。数据表示四个不同实验的平均值±SE。

OPA1融合依赖于外膜蛋白线粒体蛋白酶1。接下来，我们希望确定OPA1是否需要其他线粒体形成蛋白来控制线粒体形态。我们转向遗传学方法，测试过表达的OPA1在MEF缺乏的情况下促进线粒体微管化的能力Mfn1型或Mfn2公司酵母fzo1p的同源序列。在Mfn1公司–/–MEF，大多数线粒体呈球状，而Mfn2公司–/–MEF，线粒体形状从圆点到短杆状(图3A类) (30). 值得注意的是OPA1的水平和切割模式在WT中是可比较的，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–MEF（图6，发布为支持信息并用pMSCV-OPA1转染，在不同基因型的MEF中产生了类似水平的线粒体OPA1（图5）。OPA1诱导WT和WT线粒体微管化的表达Mfn2公司–/–但不在Mfn1型–/–单元格(图3A类). 形态计量学分析证实，在缺乏MFN2的情况下，OPA1可以有效地将线粒体微管化，但不存在MFN1(图3B类).

解决原因Mfn1公司–/–细胞对OPA1没有反应，我们进行了PEG融合分析。在来源于Mfn1公司–/–MEF，标记有黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白的线粒体有时在细胞的对侧分离，融合水平极低(图3C类)时间没有增加(图3D类). 与之前的调查结果一致(30)，这种分离仅发生在20%的Mfn1公司–/–多核体。不同标记的线粒体混合是Mfn2公司–/–多核体，但线粒体仍无法融合(图3C类和D类) (30). 线粒体融合Mfn2公司–/–转染OPA1的MEF比未转染WT MEF的MEF高，而OPA1的过度表达对来自Mfn1公司–/–单元格(图3C类和D类). 这些结果表明，依赖OPA1的线粒体融合需要MFN1。因此，OPA1与mgm1p类似酿酒酵母此外，我们的结果揭示了MFN1和MFN2之间的功能差异，至少在OPA1驱动的线粒体微管化方面。

MFN1和OPA1之间的特定功能相关性。这些结果提出了两个关键问题。缺陷是Mfn1型–/–线粒体特异性？如果是，哪一步受MFN1缺乏、线粒体对接或实际融合过程的影响？

我们首先解决了Mfn1公司–/–线粒体具有特异性。我们检查了是否在Mfn1公司–/–细胞纠正OPA1诱导的线粒体伸长和融合。MFN1在中的重新表达Mfn1公司–/–MEF恢复线粒体形状(图3A类和B类). MFN1与OPA1在Mfn1公司–/–细胞产生管状和细长的线粒体(图3A类和B类). MFN1的再次引入纠正了Mfn1公司–/–线粒体PEG融合分析中的MEF(图3D类，比较开放方块和开放方块）并启用OPA1的预融合效果(图3D类，比较填充钻石和填充方块）。因为线粒体缺陷Mfn1公司–/–MEF由MFN2补充(30)，我们评估了MFN2的引入是否也可以纠正OPA1驱动的线粒体微管化。MFN2在中的表达Mfn1公司–/–细胞恢复了线粒体形状，但不允许OPA1驱动的线粒体伸长(图3A类和B类). 为了进一步测试OPA1和有丝分裂素之间的功能相互依赖性，我们求助于OPA1敲除MEF。虽然OPA1的水平不影响MFN2诱导的线粒体伸长，但它们被证明对MFN1至关重要，MFN1只在对照H4细胞中引起小管化(图2B类和C类). 在复杂情况下Mfn1公司–/–线粒体因OPA1而融合是MFN1缺陷的一种特殊后果，MFN2不能补充这种结果。此外，MFN1而非MFN2需要足够水平的OPA1来促进线粒体伸长，进一步证实OPA1和MFN1之间的功能相互依赖性。

线粒体间接触的数量不受线粒体毒素和OPA1水平的影响。 Mfn1公司–/–线粒体的特征是运动缺陷，导致细胞质周围细胞器无序、布朗样游荡(30). 如果这种表型导致线粒体之间的接触减少，可能会导致OPA1不能促进融合Mfn1公司–/–中小微企业。要解决以下问题：Mfn1公司–/–线粒体受损，我们对线粒体进行了4D成像，即z（z）-成堆的线粒体图像。表达黄色荧光蛋白的野生型线粒体在微管中并置并融合，其中单个线粒体无法识别(图4A类 上部). 这些小管随后可能通过裂变恢复为原始的基本线粒体(图4A类 上部).Mfn1公司–/– (图4B类)以及Mfn2公司–/–线粒体(图4C类)紧密并置，保持接触数秒甚至数分钟，但在任何获得的平面中都没有融合形成微管。尽管我们从未观察到裂变事件在<500毫秒（一个堆栈的采集时间）内完成，但我们不能排除因裂变而迅速恢复的小管的形成。我们通过随机选择线粒体的体积来量化接触z（z）-整个采集序列的堆栈。WT中线粒体接触的数量相似，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–MEF（WT中8.5±1.5触点，7±0.9英寸Mfn1公司–/–和7.5±0.8英寸Mfn2公司–/–MEF；n个=16，在四个不同的实验中）。然而，“生产性”接触的数量存在差异，导致线粒体小管的形成，WT为2.3±0.4，WT的为0.7±0.3Mfn2公司–/–和0.4±0.3英寸Mfn1公司–/–单元格(n个=16，在四个不同的实验中）。尽管OPA1过度表达并没有改变接触总数，但在WT MEF中，它导致了肾小管事件增加2到3倍（在9.75±2.25接触总数中，5.25±1.25生产事件；n个=在四个不同的实验中为16）(图4A类). 在中观察到类似的模式Mfn2公司–/–MEF(图4C类)，在总共8.1±0.8次接触中发生4.2±1.1次生产事件(n个=16，在四个不同的实验中）。Mfn1公司–/–OPA1过度表达后，线粒体也无法并入小管(图4B类). 在这种情况下，触点为7.25±2.6，但只有0.5±0.3有效。总之，线粒体之间的接触总数不受OPA1过度表达或MFN缺乏的影响。OPA1有助于WT和Mfn2公司–/–但不是Mfn1公司–/–线粒体。总之，我们的结果表明，OPA1需要MFN1融合两个并列线粒体的膜，而不是产生线粒体间的接触。

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图4。

MFN1缺乏不会影响线粒体并列，但会阻止OPA1诱导的线粒体微管化。重量(A类),Mfn1公司–/– (B类)、和Mfn2公司–/– (C类)MEF与mtYFP和空载体共转染(上部)或使用mtYFP和OPA1(下部)，24小时后，共焦z（z）-按中所述获取堆栈支持材料和方法重建堆积物并重新定容，追踪单个线粒体的运动。单个的五倍放大部分z（z）-显示了与所示帧对应的平面。为了清晰起见，线粒体被分别标记为不同的颜色。箭头表示线粒体接触部位。管状线粒体的颜色是由其来源的单个线粒体的颜色合并而成的。（比例尺，4μm）

讨论

OPA1是迄今为止唯一定位于线粒体内膜的哺乳动物线粒体形成蛋白(34,37). 尽管它与酿酒酵母mgm1p，在芽殖酵母中对保持线粒体融合能力至关重要(22,23)，其生物学功能尚不清楚。据报道，OPA1的过度表达可促进线粒体的分裂和核周聚集(33–35). 相反，OPA1的消融导致线粒体去极化、线粒体网络紊乱和细胞色素释放c（c）(36)或局部收缩，然后碎裂(35). 很难将OPA1的拟议分裂前作用与其酵母同源物mgm1p的线粒体融合中的已知功能相协调。为了确定OPA1的生物学功能，我们结合了遗传学和影像学。MEF中OPA1的过度表达诱导线粒体伸长和微管形成，与3T3成纤维细胞中观察到的情况一致(37)，但与HeLa和COS7细胞的结果不同(33–35). 只有当OPA1在HeLa和COS7等细胞中以非常高的水平表达时，才可能导致断裂，因为线粒体已经被拉长。这种解释也与COS7细胞中OPA1的非活性K301A突变相一致，OPA1不水解GTP(35)，也会导致碎片(33). RNAi对OPA1水平的稳定降低导致线粒体断裂，通常与聚集有关。瞬时RNAi后在HeLa细胞中观察到类似的线粒体表型(35,36). 线粒体融合检测表明，OPA1控制着线粒体融合的复杂过程，OPA1水平与融合效率之间存在直接关系。PEG融合分析的局限性在于，它们不仅测量线粒体融合就其本身而言也包括线粒体并置和对接的准备活动，因此需要进行测量。实时成像实验表明，OPA1不会促进线粒体对接。总之，我们的数据表明OPA1影响融合步骤以调节线粒体形态。

OPA1的功能需要完整的GTPase和C末端线圈结构域，这是显性视神经萎缩患者OPA1突变的两个热点(31,32,39). OPA1突变体K301A的过度表达损害线粒体融合；有趣的是，携带OPA1 GTPase结构域突变的显性视神经萎缩患者的单核细胞显示线粒体碎片(32). C末端线圈结构域对线粒体融合也是必要的。螺旋区经常参与蛋白质-蛋白质相互作用(42)，以及酿酒酵母OPA1的同系物mgm1p是其活性所必需的(23). 最近的证据支持mgm1p通过与外膜蛋白fzo1p和ugo1p的多蛋白复合物介导线粒体融合的模型(23). 虽然ugo1p的哺乳动物同源物尚未确定，但已在MFN1和MFN2中鉴定出fzo1p同源物。它们的消融导致胚胎死亡、线粒体断裂和异质性线粒体功能障碍(30). 我们推断OPA1的功能可能依赖于其他线粒体形成蛋白，如外膜MFN。在MFN1缺陷的细胞中，OPA1不能促进线粒体融合。这一缺陷通过重新引入MFN1而非MFN2得到补充，明确确定了外膜MFN1是OPA1的重要功能伙伴。此外，如果OPA1被消融，MFN1不能促进线粒体伸长。因此，OPA1和MFN1似乎在功能上相互依赖。

一个主要的难题是，两个fzo1p同源物MFN1和MFN2是否在功能上冗余。我们的遗传分析提供了MFN1和MFN2之间功能多样性的证据，表明OPA1和MFN1之间存在功能轴。这一发现可能解释了Mfn1公司–/–和Mfn2公司–/–单元格。在没有MFN2的情况下，由OPA1和MFN1组成的内外膜融合机制仍然完好无损，可以提供低程度的融合，导致少数管状线粒体Mfn2公司–/–MEF。由于MFN1似乎允许内外膜融合，因此评估MFN2在进化过程中是否获得了其他特殊功能，如调节线粒体定位和/或与其他细胞结构的通信，将是一件有趣的事情。

有人认为OPA1可以维持嵴结构(36). 在细胞死亡期间，线粒体融合受到抑制(43); 因此，OPA1失活可能是细胞凋亡过程中线粒体重构的关键步骤。因为在没有MFN1的情况下，OPA1不能促进融合，我们的结果提供了一个框架来剖析OPA1在细胞凋亡期间对嵴结构和线粒体融合保存的特定影响。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：L.S.设计研究；S.C.、O.M.d.B.和B.d.Z.进行了研究；S.C.分析数据；O.M.d.B.贡献了新的试剂/分析工具；L.S.写了这篇论文。

缩写：DRP1，动力相关蛋白1；MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；线粒体靶向的青色荧光蛋白；线粒体靶向黄色荧光蛋白mtYFP；线粒体靶向dsRED；最惠国待遇，丝裂原；聚乙二醇；RNA干扰。

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