ATG8s、泛素样蛋白的加工及其被ATG4s解偶联对植物自噬至关重要

ATG8在C末端被ATG4蛋白酶裂解

首先，为了检测ATG8蛋白，制备了抗ATG8a和8i（以下简称抗ATG8和抗ATG8-i）的抗体。由于这些抗体对一级序列的高度保守性，在表达每个ATG8的酵母细胞的裂解液中测试了它们的交叉反应性。抗ATG8a抗体识别所有ATG8蛋白，具有不同程度的反应性，而抗ATG8抗体识别的主要是ATG8i，但很少识别ATG8h(图2A).

在单独的窗口中打开

图2。

ATG8在其C末端被ATG4蛋白酶裂解。

（A）抗ATG8a和抗ATG8 i抗体的交叉反应。酵母蛋白提取物Δ第4天Δ第8天除了拟南芥ATG8s-3Xmyc蛋白或酵母Atg8-3Xmyc外，还表达拟南芥子ATG4a的突变细胞分别使用抗ATG8a（顶面板）和抗Atg8 i抗体（中间面板）通过免疫印迹法进行分析。抗ATG8i抗体检测到的非特异性条带显示在底部面板中，作为加载到泳道中的等量蛋白质的对照。

（B）切割试验的代表性数据。酵母蛋白提取物Δ第4天Δ第8天分别使用抗myc抗体（左）或抗ATG8a抗体（右）通过免疫印迹分析表达拟南芥ATG8a-3Xmyc蛋白（第1和第4道）的突变细胞，或表达拟南质ATG4a和拟南质ATM8a-3Xmyc蛋白的突变细胞（第2和第5道）。仅从酵母中提取的蛋白质Δ第4天Δ第8天突变细胞作为阴性对照（第3和第6道）。

（C）所有ATG8的裂解分析。酵母蛋白质提取物Δ第4天Δ第8天表达拟南芥ATG8s-3Xmyc蛋白或酵母Atg8-3Xmyc（顶面板）的突变细胞，或表达拟南质ATG4a和拟南质ATM8s-3Xmyc蛋白的突变细胞或表达酵母Atg8-3Xmyc（底面板）的突变体细胞，使用抗myc抗体（顶面板上）或抗ATG8a和抗Atg8 i抗体（底面板上）进行免疫印迹分析，分别是。

为了研究ATG8是否也在C端被ATG4处理，每个ATG8在C端都被三个连续的myc表位标记，并在酵母中表达在g4atg8突变体。然后用抗myc抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹分析。在每个细胞中，检测到一条～18 kD的单条带，对应于ATG8-3Xmyc融合蛋白的分子大小(图2B，通道1和2C，顶部面板）。接下来，ATG4a或4b在这些细胞中共存，然后用抗ATG8a和8i抗体进行免疫印迹分析(图2B，车道5，和2C，底部面板；数据未显示）。出现了一条约13 kD的单条带，用抗myc抗体无法检测到(图2B，车道2；数据未显示）。这些数据表明，ATG8a-g的C端延伸已被ATG4切割。ATG8h和8i是ATG8的新类型，在Gly之后不含有额外的氨基酸，并且不像其他ATG8那样受到ATG4的裂解。然而，值得注意的是，ATG8h和8i的外胚层融合C端（3Xmyc）也易受ATG4s依赖性裂解的影响。

拟南芥中大多数ATG8s是紧密膜相关蛋白

接下来，我们通过亚细胞分离研究了ATG8s的细胞内分布。将4周龄野生拟南芥的叶片均质，通过连续离心分离核后上清液，生成13000个克颗粒分数（低速颗粒[LSP]），100000克颗粒分数（高速颗粒[HSP]），以及100000克上清液部分（高速上清液[HSS]）。抗ATG8a抗体检测到～13 kD的条带，对应于ATG8s的预测大小。ATG8主要在颗粒组分中检测到，主要在LSP中。HSP和HSS中回收了少量(图3A). 接下来，我们试图通过在含有1 M NaCl、2 M尿素、0.1 M Na的缓冲液中再悬浮来溶解颗粒部分中的ATG8₂一氧化碳_三、2%Triton X-100和1%脱氧胆酸盐（DOC）。再次离心样品，用抗ATG8a抗体对上清液和颗粒进行免疫印迹分析。LSP组分中的ATG8不能用盐、尿素或碱提取，但几乎可以被Triton X-100或DOC完全溶解(图3B，顶部面板）。这些结果表明，LSP组分中的ATG8s与膜紧密相关。另一方面，HSP组分中的ATG8被盐、尿素或碱部分溶解，几乎完全被洗涤剂溶解(图3B，底部面板），表明HSP部分中的一些蛋白质与外周膜相关。

在单独的窗口中打开

图3。

ATG8与膜的关联。

（A）ATG8s的亚细胞分布。从4周龄野生型叶片制备的总裂解物（T）在13000℃下离心克持续15分钟以生成上清液和颗粒（LSP）。然后将所得上清液以100000离心克持续1小时以生成更多上清液（HSS）和颗粒（HSP）。用纯化的抗ATG8a抗体对这些样品进行免疫印迹分析。

（B）在LSP（顶部面板）和HSP（底部面板）中恢复的ATG8的溶解。野生型叶片的LSP和HSP在含有盐、尿素、碳酸钠（Na₂一氧化碳_三)、Triton®声波风廓线仪X-100（TX-100）或DOC。再次离心样品，用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析产生的上清液（S）和颗粒（P）。

（C）颗粒部分是假定的改良形式。来自4周龄野生型叶片的细胞组分（LSP、HSP和HSS）用6 M尿素进行SDS-PAGE，用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。

以前的报告表明，与PE结合的改良型酵母Atg8在6 M尿素十二烷基硫酸钠凝胶上的迁移速度比未改良型酵母Atg8更快(Kirisako等人，2000年). 利用这种凝胶系统，我们试图检测ATG8s的修饰形式。在尿素SDS凝胶上，LSP组分中的大多数ATG8迁移速度更快，但HSS组分中ATG8的迁移速度更快(图3C). 此外，最近有报道称，LC3在动物细胞中也与PE偶联(Kabeya等人，2004年). 因此，我们假设这些快速迁移形式是假定的PE结合形式（以下简称ATG8*）。LSP组分中的大多数ATG8s是ATG8*，而HSS组分中则是未经修饰的形式。这些实验表明，大多数ATG8以ATG8+的形式存在，并且与膜相关。这些结果原则上与酵母Atg8的生化特性一致(Kirisako等人，2000年).

不同发育阶段不同器官中的ATG8蛋白

我们使用抗ATG8a抗体通过免疫印迹分析检测了ATG8蛋白在不同器官和不同生长阶段的表达(图4). 如所示图4A（顶面板），ATG8s在所有检查的器官中普遍检测到，并且在根、花和扁豆中的蛋白质水平较高。除了未修改的表单之外(图4A，中间面板，星号），检测到两个迁移速度更快的表格ATG8*(图4A、中间面板、箭头）。所有器官的带型略有不同(图4A，中间面板），表明不同的ATG8可能在功能上分配给每个器官。此外，在所有生长阶段都检测到ATG8s；蛋白质表达水平增加，直到植株长到4周，然后逐渐下降(图4B，顶部面板）。我们还研究了不同生长阶段叶片中的ATG8*。有趣的是，ATG8*的水平也随着生长进程而增加，在4周龄的植物中达到峰值，这是抽薹前的阶段(图4B，中间面板）。

在单独的窗口中打开

图4。

ATG8蛋白在不同器官发育阶段的表达。

从根（R）、茎（St）、叶（L）、花（F）和西力克（Si）制备的总蛋白质样品（A）或从生长1至6周的一系列野生植物中制备的总蛋白样品（B）在不使用（顶面板）或使用（中面板）6 M尿素的情况下进行SDS-PAGE，并使用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。将20微克的总蛋白质应用于每个柱。星号表示ATG8的未修改形式，箭头表示假定的PE共轭形式。底部面板显示了经考马斯亮蓝染色的点刻聚偏二氟乙烯膜和SDS-PAGE，作为装载到通道中的等量蛋白质的对照。

ATG8s的亚细胞定位

接下来，使用拟南芥培养细胞，通过聚乙二醇介导的瞬时表达分析，检测绿色荧光蛋白-ATG8s（GFP-ATG8s）的亚细胞定位。我们做了九个构造，每个构造自动液位计8开放阅读框（ORF）融合到GFP的C末端，并置于构成型35S启动子的控制下花椰菜花叶病毒GFP单独表达为阴性对照。GFP-ATG8s呈现环状和点状结构，除了均匀染色的胞浆外，这些结构被认为是自噬体及其前体(图5A、5D和5G; 数据未显示）。有趣的是，在某些情况下，GFP-ATG8h和GFP-ATG8i也定位在液泡内部(图5J; 数据未显示）。由于ATG8h和ATG8i不需要ATG4处理C端延伸，因此它们可能比其他GFP-ATG8更快地输送到液泡。在ATG8a-g的情况下，ATG4的表达水平可能受到限制，因为只有GFP-ATG8s在强启动子后短暂过度表达。我们还构建了GFP-ATG8a-A、e-A和i-A，其中每个C末端Gly被Ala残基取代。在野生型GFP-ATG8s表达后观察到的比环状结构小的点结构中发现了合成的融合蛋白(图5L、5O和5R; 数据未显示）。这些实验表明，C-末端Gly的替换导致前吞噬体结构定位缺陷。

在单独的窗口中打开

图5。

GFP-ATG8融合蛋白在拟南芥悬浮培养原生质体中的定位。

（A）到（K）MS中生长的表达GFP-ATG8a、8e和8i的拟南芥细胞([答],【D】,【G】、和[日本])和MS-N(【B】,[英]、和【H】)中等。Nomarski的图像（B）,（E）,（H）、和（J）如所示（C）,（F）,（一）、和（K）分别是。

（左）到（T）在MS中生长的拟南芥细胞表达GFP-ATG8a-A、8e-A和8i-A，其C端含有Gly-to-Ala替代物(【L】,【O】、和【右】)和MS-N([男],【P】、和【S】)中等。Nomarski图像（百万）,（P）、和（S）如所示（N）,（问）、和（吨）分别是。

（U）和（五）仅表达GFP的拟南芥细胞作为对照（U）Nomarski图像（U）如所示（五）星号表示淀粉颗粒。

所有刻度与中的相同（五）; bar=10μm。插入（英寸）（A）,（D）,（G）,（左）,（O）、和（右）分别在高倍率下显示环形和点状结构（条形=1.25μm）。

还研究了GFP-ATG8s在营养饥饿条件下的行为。如所示图5B、5E和5H在无氮培养基中培养48小时后，液泡膨胀，GFP-ATG8a、e和i被输送至液泡。然而，GFP-ATG8a-A、e-A和i-A未被输送至液泡(图5M、5P和5S). 最可能的解释是，ATG8-A不能被ATG4裂解或在其C端修饰，因为C端Gly被Ala残基取代；因此，GFP-ATG8-A不能定位于假定的自体吞噬前体结构，从而阻止了GFP-ATG 8-A向液泡的有效传递。这些结果表明，所有ATG8的C末端Gly对自噬至关重要，即ATG8系统在植物自噬中的功能与在酵母中相似。从这些结果中，我们还表明GFP-ATG8s是监测植物自噬的功能性和良好的分子标记。

T-DNA插入双突变体的分离atg4a4b-1

为了阐明ATG4s在整个植物中的作用，我们产生了T-DNA插入双突变体atg4a4b-1拟南芥ATG4蛋白由位于第2和第3染色体下臂的两个基因编码。我们筛选了一组从威斯康星大学拟南芥敲除设施和卡祖萨DNA研究所获得的T-DNA插入突变体，并分离出两个T-DNA插入单突变体，我们将其命名为atg4a-1和atg4b-1.在g4a-1和atg4b-1植物的T-DNA插入分别位于翻译起始密码子下游32 bp的第二外显子和翻译起始密码元下游1280 bp的第五内含子(图6A). 抗生素耐药性的分离模式显示，在atg4b-1，但不是atg4a-1植物。我们进行了回传，获得了atg4a-1只有一个T-DNA插入的突变体，其中抗生素抗性基因被删除。使用跨越T-DNA插入的基因特异性引物进行的RT-PCR分析证实了全长自动液位计4a和4b个两个突变体中的mRNA(图6B). 我们得出结论，这些等位基因代表零突变。为了获得双突变植株，植株纯合子为atg4a-1和atg4b-1被交叉了。纯合双突变体植物(atg4a4b)在F1自交后的F2后代中通过PCR鉴定。在atg4a4b-1突变体，无全长mRNA编码自动液位计4a和4b个检测到(图6B)表明该突变体缺乏功能性ATG4蛋白。经过三次回交到野生型，纯合子atg4a4b-1植物被用于进一步研究。

在单独的窗口中打开

图6。

描述atg4a-1,atg4b-1、和atg4a4b-1突变体。

（A）两个ATG4基因中T-DNA插入位点的示意图。线表示内含子，框表示外显子（开盒，非翻译区；闭盒，翻译区）。

（B）RT-PCR分析ATG4型野生型和T-DNA插入突变体中的基因。从野生型、，atg4a-1,atg4b-1、和atg4a4b-1并进行RT-PCR。使用基因特异性引物进行35个周期的RT-PCR，以扩增全长ORF。

（C）ATG8s在中的表达自动变速箱破坏突变体。6周龄野生型的总蛋白质样本，atg4a4b-1,atg4a-1,atg4b-1、和第9-1天叶片在没有（顶面板）和（中面板）6M尿素的情况下进行SDS-PAGE，并用纯化的抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。将40微克总蛋白涂敷在每根柱上。底部面板显示了考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE，作为装载到通道中的等量蛋白质的对照。

（D）ATG8蛋白的亚细胞分布自动变速箱破坏突变体。4周龄制备的总裂解物（T）atg4a-1,atg4b-1,atg4a4b-1、和第9-1天叶片在13000下离心克持续15分钟以生成上清液和颗粒（LSP）。然后将产生的上清液在100000下离心克持续1小时以生成更多上清液（HSS）和颗粒（HSP）。用纯化的抗ATG8a抗体对这些样品进行免疫印迹分析。

（E）假定的ATG8-ATG3共轭物。野生型和atg4a4b-1用纯化的抗ATG8a抗体对有DTT和无DTT的叶片进行免疫印迹分析。箭头表示假定的ATG8-ATG3共轭。

ATG8蛋白在在g4a4b-1突变体不同于野生型植物的突变体

调查ATG8的行为atg4a4b-1突变植物，从野生型叶片中制备的总蛋白，atg4a-1,atg4b-1,atg4a4b-1、和第9-1天用抗ATG8a抗体对植物进行尿素SDS-PAGE和免疫印迹分析(图6C). 如所示图6C（底部面板），在野生型中检测到迁移速度更快的条带，atg4a-1、和atg4b-1植物。像在酵母中一样，在第9-1天植物。相比之下，迁移最快的带在atg4a4b-1植物(图6C，闭合箭头）。这些结果支持这样的结论，即在野生型植物中观察到的迁移最快的带代表ATG8*。另一个迁移速度较快的带甚至在在g4a4b-1(图6C，打开的箭头）。该条带与用抗ATG8i抗体检测到的条带不一致（数据未显示）。年，ATG8的水平大幅提高atg4a4b-1和第9-1天植物(图6C，顶部面板），但在两个单一变种中，atg4a-1和atg4b-1ATG8水平与野生型相似。因此，很可能atg4a4b-1，在野生型中未检测到的未修改形式的带出现在与ATG8*相同的位置。为什么ATG8的水平在自动变速箱破坏突变体？一种可能性是自动液位计8中断突变体中的转录物增加以弥补自噬缺陷。然而，更有可能的是，由于自噬的缺陷，ATG8蛋白没有被输送到液泡中，因此没有被降解。

接下来，我们检测了ATG8s在自动变速箱亚细胞分离突变体。在atg4a-1,atg4b-1、和第9-1天与野生型植物一样，ATG8主要在LSP组分中回收(图6D). 相比之下，正如预期的那样在g4a4b-1植物，ATG8主要在HSS中回收，仅在LSP和HSP组分中以低水平回收(图6D)，表示ATG8无法在中转换为ATG8*atg4a4b-1.

野生型和atg4a4b-1生成仅表达GFP-ATG8a、8e、8i和GFP的植物，以确认ATG4s的破坏是否影响ATG8s在整个植物中的细胞内定位。如所示图7在营养丰富的条件下生长的野生型植物的根中，每个融合蛋白都以许多环状和点状结构存在，这些结构被解释为自噬体及其中间产物(图7A、7C和7E). 相比之下，这些结构在atg4a4b-1植物，尽管观察到一些小点结构(图7G、7I和7K). 推测的PE结合形式仅在表达GFP-ATG8a的野生型植物中检测到，但在atg4a4b-1表达GFP-ATG8a的植物(图7O)支持GFP-ATG8融合蛋白的功能。在增溶实验中，GFP-ATG8a融合蛋白被离子洗涤剂DOC有效增溶，但被非离子洗涤剂Triton X-100微弱增溶，这表明在atg4a4b-1细胞可能是聚集的蛋白质(图7P). 这些结果表明，ATG4是通过允许ATG8与细胞膜结合而形成自噬体所必需的。

在单独的窗口中打开

图7。

的影响atg4a4b-1稳定转化拟南芥根中GFP-ATG8融合蛋白的行为突变。

（A）到（F）稳定表达GFP-ATG8a的野生拟南芥根([答]和【B】)，第8页([中]和【D】)、和8i([英]和[女]).

（G）到（左） atg4a4b-1稳定表达GFP-ATG8a的突变体根(【G】和【H】)，第8页([我]和[日本])、和8i(【K】和【L】).

（百万）和（N）野生型拟南芥根稳定表达GFP作为对照。

利用共焦激光扫描显微镜观察MS培养基上生长一周的转基因幼苗的根系([答],[中],[英],【G】,[I],【K】、和[男]). 对于氮饥饿，将生长在MS培养基上的幼苗转移到MS-N培养基中再培养7天，然后观察(【B】,【D】,[女],【H】,[日本],【L】、和【否】). 棒材=20μm。插入（英寸）（A）,（C）,（E）,（G）,（一）、和（K）在高倍镜下分别显示圆环和圆点结构（bar=1μm）。

（O）GFP-ATG8a的推测PE结合形式。野生型和atg4a4b-1表达GFP-ATG8a融合蛋白的人用6%尿素进行8%（w/v）SDS-PAGE，并用抗GFP抗体（Molecular Probes，Eugene，OR）进行免疫印迹分析。箭头表示GFP-ATG8a的假定PE结合形式。星号表示与GFP-ATG8a无关的交叉反应带。

（P）GFP-ATG8a在在g4a4b-1突变体。亚细胞分离按方法中所述进行。来自atg4a4b-1表达GFP-ATG8a的突变体在含有盐、尿素、碳酸钠（Na₂一氧化碳_三)、Triton®声波风廓线仪X-100（TX-100）或DOC。再次离心样品，用抗GFP抗体（分子探针）进行免疫印迹分析产生的上清液（S）和颗粒（P）。

全厂自噬监测

为了监测整个植物的自噬，我们检测了野生型植物在保氮条件下GFP-ATG8s的行为。对于氮饥饿，在营养丰富的培养基（MS培养基[21mM NH₄不_三，18毫微米KNO_三，和88 mM蔗糖]）转移到缺氮培养基（MS-N[0 mM氮和88 mM蔗糖]）。氮饥饿6d后，用荧光激光扫描共聚焦显微镜观察根系。在这些条件下，每个融合蛋白都被输送到野生型根的液泡腔中(图7B、7D和7F). 另一方面，在atg4a4b-1这些融合蛋白，甚至GFP-ATG8i，在Gly残基之后没有C末端延伸，都没有被传递到液泡，这表明ATG4s通过ATG8*的去结合作用对植物自噬至关重要(图7H、7J和7L).

众所周知，当外源性添加到植物细胞中时，卷曲霉素A是一种V-ATP酶抑制剂，可以提高液泡腔的pH值(Drose等人，1993年;松冈等人，1997年). 因此，预计在如此高的pH值条件下，液泡水解酶无法发挥作用，导致自噬体在液泡中积聚（Y.Moriyasu，个人通讯）。1周龄野生型和atg4a4b-1表达GFP-ATG8s的幼苗在保氮条件下用1μM concanamycin A处理6h，然后进行显微镜观察。Nomarski图像如所示图8,9B和9D在用康奈霉素A处理的野生型根中，在发育良好的液泡中有许多球形结构(图8A至8C). 这些结构被GFP-ATG8s染色(图9A)表明它们是植物自噬体。相比之下atg4a4b-1较小，不包含球形结构(图8D至8F). 接下来，进行电子显微镜检查。在野生型根中，观察到直径约为1.5μm的单膜结合囊泡。这些小泡电子密度高，含有细胞质结构，如线粒体、内质网和高尔基体(图10A至10D)证明它们确实是植物自噬体。相比之下，在细胞的液泡中没有自噬体atg4a4b-1植物。此外atg4a4b-1在根冠或分生组织周围的细胞中，突变体比野生型植物的突变体小(图10E和10F; 数据未显示）。在酵母中，在氮气保护条件下，随着自噬的进展，通常会观察到液泡膨胀(Takeshige等人，1992年). 我们的结果表明，在暴露于缺乏营养的环境后，自噬可能会导致空泡相对较快的肿胀。

在单独的窗口中打开

图8。

野生型和atg4a4b-1在含氮条件下用刀豆霉素A处理的突变体。

（A）到（C）野生型根。

（D）到（F） atg4a4b-1突变根。

（G）和（H）补充atg4a4b-1突变体(atg4a4b-1；tATG4a公司)根。

1周龄野生型的根([答]到[中]),atg4a4b-1(【D】到[女])、和atg4a4b-1用转换自动液位计4a基因(【G】和【H】)在MS培养基上生长的幼苗在含有康那霉素A的MS-N液体培养基中培养12 h，然后用常规透射光显微镜观察。棒材=20μm（A）,（B）、和（E）到（H）和10μm（C）和（D）.

在单独的窗口中打开

图9。

Concanamycin A处理后，许多囊泡中积聚的囊泡被GFP-ATG8蛋白染色。

（A）和（C）野生型根的荧光显微照片（A）和atg4a4b-1 （C）表达GFP-ATG8a的幼苗。

（B）和（D）Nomarski图像（A）和（C）分别是。

将表达GFP-ATG8蛋白的转基因幼苗的根用康那霉素A（1μM）处理6至12 h，并用光镜和荧光显微镜进行观察。代表性图片如图所示。条形=20μm。插入（A）显示了球形结构的放大（bar=5μm）。

在单独的窗口中打开

图10。

植物自噬体的电子显微照片。

（A）到（D）康乃霉素A处理野生型根的电子显微照片。

（E）和（F）电子显微照片atg4a4b-1用康那霉素A处理突变体根。

1周龄野生型的根([答]到【D】)和atg4a4b-1([电子]和[女])在保氮条件下，用康奈霉素A（1μM）处理幼苗6h。比较根尖相同区域。棒材=10μm（A）和（E），500 nm（C）和（D）和1μm（B）和（F）.

补充atg4a4b-1突变体

为了验证自噬体积累的缺陷，即自噬atg4a4b-1突变体是由两种基因中的T-DNA插入引起的自动液位计4基因，我们进行了功能互补实验。基因组学自动液位计4a包含其5′侧翼区和编码区的片段(tATG4a公司)已转换为atg4a4b-1突变体。五个独立的转化体携带tATG4a公司通过抗生素耐药性筛选转基因，并通过PCR确认是否存在tATG4a公司转基因和缺少野生型自动液位计4a和自动液位计4b等位基因（数据未显示）。的表达式tATG4a转基因挽救了自噬体的缺陷堆积(图8G和8H)表明自噬缺陷是由atg4a和atg4b突变。

高等植物自噬发生的时间和地点？

自噬在整个植物中发生的时间和地点对于理解植物自噬的生理作用是一个有趣而重要的问题。表达分析显示自动液位计8s和自动液位计4s普遍表达，并且ATG8蛋白存在于大多数器官中。mRNA和蛋白质在许多不同器官中的存在意味着自噬可能作为一个基本的细胞过程在所有器官中发生。我们还发现ATG8蛋白在所有发育阶段都有表达，这表明除了在营养限制条件下发生外，自噬总是发生在基础水平。然而，9个ATG8也有可能具有不同的组织特异性，因此，自噬可能以组织特异性的方式发生。此外，我们发现ATG8蛋白水平和向ATG8*的转化率在4周龄的植物中最高，这是抽薹前的阶段。人们认为当植物从营养阶段转换到生殖阶段时，植物自噬特别活跃。然而，目前尚不清楚Atg8蛋白的诱导是否对自噬的发生是必要的，以及其PE结合形式在酵母中的实际作用。此外，具有C末端延伸的ATG8可能具有与自噬无关的其他功能；然而，在这项研究中，我们已经表明，所有9个ATG8都在植物自噬中发挥作用，至少在被ATG4切割后。

在营养丰富的条件下，自噬体积累，GFP-ATG8被输送到野生型根的液泡中（数据未显示），这表明无论营养条件如何，基础自噬都是组成性的。

ATG8s的膜结合和亚细胞定位

酵母Atg8是自噬的关键分子，在这一过程中表现出一些有趣的行为，其分子功能的细节也在不断积累。亚细胞分馏实验表明，酵母Atg8主要存在于颗粒组分中，尤其是热休克蛋白中。根据增溶实验的结果，LSP只含有Atg8-PE，而HSP同时含有未修饰和PE结合形式。基于上述证据，在酵母中，人们认为Atg8在自噬体形成之前在热休克蛋白的膜结构上与PE结合，而LSP中的Atg8-PE与自噬小体及其前体结构有关(Kirisako等人，2000年). 与这些结果一致的是，在植物中，大多数ATG8也存在于颗粒组分中。此外，尽管LSP中的ATG8s都与膜紧密结合，但HSP中有两种形式的ATG8，松散的膜结合和紧密的膜结合，这表明部分ATG8-G在HSP中的膜结构上的C末端发生了改变。然而，在颗粒组分内ATG8s的分布方面，在植物和酵母之间观察到差异。在植物中，颗粒组分中的大多数ATG8s包含在LSP中，而不是HSP中。这些结果表明，在植物中，自噬体和前自噬体结构可能大量稳定存在。事实上，在表达GFP-ATG8s的野生型植物的根中观察到许多环状和点状结构，这些结构被认为是自噬体或前自噬体内结构。与酵母菌和动物不同，植物自噬可能会持续发生，但速度缓慢，数量巨大。

Atg系统在植物中的功能与在酵母中相似

拟南芥Atg8同源物与酵母Atg8具有高度的同源性，并且拟南芥子、ATG4、ATG7和ATG3中的重要催化域保持不变，这强烈表明拟南芥斯具有与酵母相似的自噬机制。野生型ATG7可以补充拟南芥T-DNA突变体ATG7中的表型，但ATG7C/S含有一个催化氨基酸突变，并被预测为酶不活性，因此不能补充这种表型，这进一步支持了这一预测(Doelling等人，2002年). 在这项研究中，我们清楚地表明，在植物自噬中，泛素化样的Atg8脂质体系统的功能与酵母中的功能类似。这一结论是基于以下观察得出的：ATG8s的C末端以ATG4依赖的方式被裂解，GFP-ATG8-a在氮储存条件下并没有被转运到液泡，而是以扩散或小斑点的形式积聚在胞浆中。这也得到了以下观察结果的支持：在野生型植物中，GFP-ATG8s在营养丰富的条件下定位于假定的自噬体，并在氮饥饿的条件下运输到液泡，但在自动液位计4-被破坏的突变体，atg4a4b-1此外，蛋白质印迹分析表明，ATG8*在野生型植物中检测到，但在atg4a4b-1此外，我们可以在野生型植物中检测到假定的ATG8-ATG3结合物，但在atg4a4b-1使用不含还原剂的样品缓冲液进行免疫印迹(图6E). 然而，ATG8是用PE修改的，这一点尚待最终证明。

很可能ATG8i能够在其C末端进行修饰而不需要处理，因为Gly残基暴露在新合成的分子中。因此，GFP-ATG8i有望在氮气保护条件下被运输至液泡，即使在atg4a4b-1突变体。然而，我们观察到atg4a4b-1在氮气保护条件下，GFP-ATG8i不被转运到液泡，但其行为与ATG8a和8e类似。即使在没有ATG4的情况下，ATG8i可以在其C末端进行修饰，但它也无法从假定的PE结合形式中去共轭。因此，我们得出结论，去偶联反应对植物自噬也是必不可少的。

的标识自动液位计基因

与酵母同源的基因(酿酒酵母)自动液位计使用拟南芥信息资源BLAST 2.2.8程序在拟南芥子全基因组数据库中搜索(Altschul等人，1997年)，并使用Megalign程序（威斯康星州麦迪逊市DNASTAR）进行氨基酸序列比对。

RT-PCR分析自动液位计8和自动液位计4表达式

检查组织特异性表达ATG8a-i公司,自动液位计4a、和4b个使用异硫氰酸胍/CsCl方法，从水培培养4至5周的野生型拟南芥的根、茎、叶、花和角果中制备总细胞RNA(考克斯和戈德堡，1988年). 按照制造商的说明，使用ProSTAR RT-PCR试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）生成cDNA。从0.2μg总RNA中提取的cDNA用作每次PCR反应的模板。使用的基因特异性引物如下：ATG8a公司（At4g21980），5′-TCGGACATAATCGAATCGC-3′和5′-CATCAAAGTCATCCAAGATCG-3′；对于ATG8b型（At4g04620.1和At4g004620.2），5′-CATCGTAGATACATAACCGAATCATC-3′和5′-GATCAGACGTAGAGCTG-3′；对于ATG8c公司（At1g62040），5′-AATCTTTATTCTTAATCGCC-3′和5′-CAAAGCAACATTATATAGTAG-3′；对于ATG8d公司（At2g05630），5′-TCTCTCTGTTTCTCTCG-3′和5′-TCGACACATTCAAGC-3′；对于自动液位计8e（At2g45170.1），5′-TTCACAAATTCCTCTCTCTAAG-3′和5′-CGGATTCTCAGAGGTCAG-3′；对于ATG8f型（At4g16520.1和At4g1620.2），5′-GTAGTCTACAGGCGTGGAAGG-3′和5′-TTATGGATCAAACAATG-3′；对于ATG8克（At3g60640）、5′-CGTCATCATCAGAGAGACC-3′和5′-CTTCATCATAAAAGCAAGAACACC-3′；对于ATG8小时（At3g06420），5′-TCATTCGTGAAATCTG-3′和5′-AAATCTTTGAGCCGAAAAG-3′；对于ATG8i（At3g15580），5′-CCGGGCGGTCGAAGAAGA-3′和5′-ACACAGACTACATTATGG-3′；对于自动液位计4a（At2g44140.1），5′-ATGAGGCTTTATGGATATTTGTTC-3′和5′-TCAGAGCATTTGCCATCTTCAC-3′；对于自动液位计4b（At3g59950.1），5′-ATGAAGCTTTATGGATATTTGTTC-3′和5′-GTCACAAGAAAAGAAATGGCTAGG-3′；对于UBQ10型（见4g05320），5′-TTCCACTTGTCCTGCGTTCGTGTGGTGTTTC-3′和5′-CATCAGGATTATACAAGCCCC-3′。研究氮饥饿对ATG8a-i公司,自动液位计4a、和4b个在氮饥饿1、3、6和12小时后，从叶片中分离出0.2μg的总细胞RNA基因，并进行定量或半定量RT-PCR。采用上述方法进行定量RT-PCR(Kamada等人，2003年). 用于定量RT-PCR的基因特异性引物如下：ATG8a公司，5′-TCGATTCTTCTTCCAGTTTCAATCA-3′和5′-CCATTGCGATTCGATTAGTCTCCGAAG-3′；对于ATG8b型（At4g04620.1和At4g004620.2），5′-TTACCTCAGCTTCTACGTCTCTCTCT-3′和5′-AGAGAGTCAAATATACATCTTGTTTCA-3′；对于ATG8c公司，5′-CCTAATTGTTCTACACGAACCC-3′和5′-GGCGATAAGAATAGAATCAAAGATTAGGC-3′；对于ATG8d公司，5′-TGCGCTGGAATATGTGGATGCATCAG-3′和5′-CACCATGAACGGAGACCTTATCAT-3′；对于自动液位计8e（At2g45170.1和At2g4.5170.2），5′-ATTAGTCTATGTAGTACATTAACAGTG-3′和5′-TAACTCTGACCTCTGAGAATCGCCA-3′；对于ATG8f型（见4g16520.1），5′-GCTTTATGTCTTTTTCTTTCATATTTTCCG-3′和5′-CATTCTCCACGCTGTAGACTAAAAG-3′；对于ATG8克，5′-CCAACACTTTTGTGCAAACCGATGG-3′和5′-GGTGTCTCTTTTAATTGATGAATGAA-3′；对于ATG8小时，5′-GAACAAAAAACTAACAACCAAAC-3′和5′-ATCCCATTACAGATTCACGAATGA-3′；对于ATG8i，5′-GCAGTGAAAACCTTGGTTGATCC-3′和5′-GCTTAAGTGTTGATGTTTTTTTG-3′。使用质粒亚克隆每个全长cDNA，通过PCR确认每个引物的基因特异性（数据未显示）。

抗体产生和免疫印迹分析

这个ATG8a公司和第8页编码区，从核苷酸1到351ATG8a公司和1至345ATG8i，使用以下引物从全长cDNA中通过PCR扩增：ATG8a公司，5′-CGCggatccCAATGGCTAAGAGTTTCCTTC-3′和5′-CGCggatccTCCAAAAGTGTTCTCCACTGT-3′；和ATG8i，5′-CGCggatccAGATGAAAATCGTTCAAGGAACAATAC-3′和5′-CGC巴姆两端的HI站点（小写）。所得产物用巴姆HI并插入pGEX-3X（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）中表达大肠杆菌用0.05 mM异丙基-β诱导5小时后-d日-硫代吡喃半乳糖苷、ATG8a和8i重组蛋白通过谷胱甘肽-Sepharose 4B柱上的亲和层析利用因子Xa（Amersham Biosciences）从裂解产物中纯化，并用于在兔子体内制备多克隆抗体。随后，通过将血清通过与溴化氰活化的Sepharose 4B（Amersham Biosciences）偶联的ATG8a或8i重组蛋白柱，亲和纯化抗ATG8i和8i的抗血清。

植物蛋白样品的制备如下：300 mg每株植物在300μL SDS样品缓冲液中均匀化，不含还原剂和溴酚蓝（0.1 M Tris-HCl，pH 6.8，4%[w/v]SDS和20%[v/v]甘油），并煮沸2至3 min，然后在500克1分钟。将所得上清液用作总蛋白。通过BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce，Rockford，IL）对总蛋白质进行定量。

对于免疫印迹分析，将经过SDS-PAGE加或不加6-M尿素处理的总蛋白提取物转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA）上，并使用5%奶粉封闭膜。一级和二级抗体分别在含有0.1%吐温20的TBS中稀释1:200和1:5000。使用的二级抗体是过氧化物结合山羊抗兔免疫球蛋白（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）。使用Western Lightning Chemillumination试剂盒（马萨诸塞州波士顿Perkin-Elmer Life Sciences）检测信号。

酵母中拟南芥ATG8s的裂解分析自动变速箱突变体

在酵母中表达拟南芥ATG4蛋白自动液位计4基因被插入到酵母表达载体pKT10中，其中包含URA3公司标记，受GAP启动子控制(Hanaoka等人，2002年). 为了在酵母中表达3xmyc标记的ATG8s蛋白，自动液位计8使用以下引物通过PCR从全长cDNA中扩增基因：ATG8a公司，5′-CGCggatccCAATGGCTAAGATCTCTC-3′和5′-CGC ggatccTCCAAAAGTCTCCACTGT-3′；对于ATG8b型，5′-CGCggatccTCATGGAGAACACTCTTCAAGC-3′和5′-CGC ggatccACCAAGTGTGTCCACTGT-3′；对于ATG8c型，5′-CGCggatccCCATGGCTAATAGCTCTCTCAAG-3′和5′-CGC ggatccACCAAGGTTCTCCACTG-3′；对于ATG8d公司，5′-CGCggatccTCATGGCGATCTCTCAA-3′和5′-CGC ggatccCCCGAACGTGTTCACCACATG-3′；对于自动液位计8e，5′-CGCggatccAGATGAATAAGGAAGCATCTTTAAGATGG-3′和5′-CGC ggatccACCGATGTTCGCCACTG-3′；对于ATG8f型，5′-CGCggatccGAATGGCAAAAAGCTCGTCAAG-3′和5′-CTCggatccTCCAAATGTTTCCGCTG-3′；对于ATG8克，5′-CGCggatccAGATGATACGTCAGCTTCAGG-3′和5′-CGCggatccTCCAAAAGTGTTTTCCCCACTG-3′；对于ATG8小时，5′-CGCggatccTAATGGGATTGTTGTCAAGTCTTTC-3′和5′-CGC ggatccGCCGAAAGTTTTCTCGGTGCTG-3′；和ATG8i，5′-CGCggatccAGATGAAAATCGTTCAAGGAACAATAC-3′和5′-CGC ggatccACCAAGGTTTTCACTGCT-3′，设计用于包含巴姆两端的HI站点（小写）。碎片被消化巴姆HI被替换为巴姆HI（高）-巴姆夏威夷群岛自动液位计8pRS315:ATG8的ORF片段，其中包含自动液位计8包含启动子区域和插入的3xmyc序列的片段。pRS315:ATG8是通过克隆1.3kb的Spe公司我-生态源自pRS316载体的ATG8质粒的RI片段(Kirisako等人，2000年)，插入酵母表达载体pRS315中，该酵母表达载体含有LEU2级标记。Δ的单元格第4天Δ第8天(材料αleu2 ura3 his3 trp1 lys2 suc2-Δ9Δ第8天::HIS3型Δ第4天::TRP1号机组Δ第8页::电话8Δ60)用这些质粒转化。转化子在SC-无亮氨酸培养基中培养以表达自动液位计8s或SC-minus亮氨酸和尿嘧啶培养基表达自动液位计8s和自动液位计4s.然后将所有培养物转移到SD-N培养基中(Burke等人，2000年).

如前所述制备酵母全细胞裂解物(Hanaoka等人，2002年)并进行13.5%（w/v）聚丙烯酰胺SDS-PAGE，并使用抗myc抗体（9E10）（加州里士满伯克利抗体）或抗ATG8a和抗ATG8 i抗体进行免疫印迹分析。

ATG8s的亚细胞分离和溶解

在冷冻提取缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，400 mM蔗糖，1 mM EDTA，0.1 mM苯甲基磺酰氟，10μg/mL亮氨酸蛋白酶，10μg/mL胃蛋白酶抑制素A和4%[v/v]蛋白酶抑制剂鸡尾酒，德国彭茨堡罗氏）中切叶使用剃刀，然后通过四层粗棉布过滤，并在500℃下离心克5分钟以清除细胞碎片。上清液（T）在13000离心克15分钟生成13000克膜部分（LSP）。结果是13000克然后将上清液在100000下离心克1小时生成100000克膜组分（HSP）和可溶性组分（HSS）。将颗粒重新悬浮在提取缓冲液中，并使用纯化的抗ATG8a抗体对部分进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

为了溶解ATG8s，将LSP和HSP部分重新悬浮在萃取缓冲液中，再加上1 M NaCl、2 M尿素、0.1 M Na₂一氧化碳_三、2%Triton X-100和1%DOC，并在冰上培养1小时。然后在100000下离心样品克将可溶部分与不可溶部分分离1小时。将颗粒重新悬浮在SDS样品缓冲液中。使用TCA沉淀上清液，在丙酮中洗涤蛋白质颗粒，并在SDS样品缓冲液中重新悬浮。用纯化的抗ATG8a抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品。

GFP-ATG8融合蛋白在拟南芥悬浮培养细胞中的瞬时表达

全长ORFATG8a公司,第8页、和第8页具有巴姆通过PCR扩增两端的HI位点，并融合到pEZS-CL质粒中EGFP ORF的C端。使用的底漆如下所示，每种底漆都旨在引入巴姆HI站点（用小写字母表示）：用于ATG8a公司，5′-CGCggatccCAATGGCTAAGATCTCTC-3′和5′-CGC ggatccTCAAGCAACGGTAAGATCCAA-3′；对于自动液位计8e，5′-CGCggatccAGATGAATAAGGAAGCATCTTTAAGATGG-3′和5′-CGC；对于ATG8i，5′-CGCggatccAGATGAAAATCGTTCAAGGAACAATAC-3′和5′-CGC ggatccTCAACAAGGTTTCTCACTGC-3′。以上述野生型GFP-ATG8-A质粒为模板，通过定点突变产生GFP-ATG-A质粒。使用的底漆如下：ATG8a-A型，5′-GAGAGAACACTTTTGcATCTTACCGTTCGC-3′和5′-GCAAGTGTAGAGATGCAAAGTTCTC-3′；对于ATG8e-A型，5′-GGCGAGAACACATTCGcTGCTTCTTCAATCTA-3′和5′-TAGATGAGAGCAGGCGAAATGTGTTCTCGCC-3′；对于ATG8i-A型，5′-GTGGAAAACCTTTGcTTGAGGATCACCG-3′和5′-CGTGGATCCCAAgCAAAGGTTTTCTCAC-3′（小写字母代表点突变位点）。使用仅含GFP的pEZS-CL质粒作为对照。

GFP融合ATG8蛋白在拟南芥培养细胞悬浮液中的瞬时表达是通过上述方法进行的(Ueda等人，2001年). 为了进行氮饥饿，将转化细胞转移到补充有0.4 M甘露醇的MS-N培养基中，并在23°C的温和搅拌下在黑暗中培养48小时。用荧光显微镜观察转化细胞（Olympus IX81；日本东京）。

T-DNA突变体的鉴定

这个在g4a-1该植物是从威斯康星大学拟南芥敲除设施创造的拟南芥T-DNA突变群体中分离出来的，使用基于PCR-的反向遗传筛选(Krysan等人，1996年,1999). 这个atg4b-1如前所述，该植物是使用Kazusa DNA研究所设计的T-DNA插入线筛选系统进行分离的(Hanaoka等人，2002年). 用于检测T-DNA插入自动液位计4a和自动液位计4b基因如下：atg4a-1,ATG4a型-特异性引物为5′-ATGAAGCTTTATGGATATTTGTTC-3′和5′-TCAGAGCATTTGCACACATTCTCAC-3′，T-DNA特异性引数为5′-CATTTAATAACGCTGGACATCTAC-3′和5’-TTTTCCATGACCATCATCATTG-3′。对于atg4b-1,自动液位计4b-特异性引物为5′-GTCACAAATAGAAAAGAGGCTAGGAG-3′和5′-CGGAATTCGTGTGTGTGCTTAATGA-3′，T-DNA特异性引数为5′-TAGACCGAACTATCAGTG-3′及5′-ATAACGCTGGATAC-3′。携带T-DNA基因组连接的PCR-扩增片段的DNA测序决定了T-DNA插入每个基因的位置。

质粒构建与拟南芥转化

为了构建质粒以产生稳定的组成性表达GFP-ATG8融合蛋白的转化子，在35S启动子的控制下瞬时表达每个GFP-ATG蛋白的质粒花椰菜花叶病毒和奥托品合成酶终止子被消化不是我和钝头绑在了Sma公司pCAMBIA 2300（喀麦隆，黑山，澳大利亚）的现场。仅含GFP的pEGAD质粒(Cutler等人，2000年)用作对照。构建用于补体的质粒atg4a4b-1突变体，一个5357bp的基因组片段，包含起始密码子上游的3kb序列和自动液位计4a使用引物集5′-CGGggtaccTCTGCAACCTACCCCCCACATGCGCAGTC-3′和5′-CG1GggtaCCCTCTCTTCCATTCTCTCTCGCGCTTC-3′通过PCR扩增编码区，目的是引入一个千磅I站点（小写）分为两端。碎片被消化千磅然后克隆到千磅pCAMBIA2300载体（CAMBIA）的I位点，导致tATG4a公司构造。这些结构通过测序进行验证，并引入野生型和/或atg4a4b-1拟南芥植物的植物区系浸染法根癌农杆菌–介导的转化(克拉夫和本特，1998年). 表达GFP-ATG8s或atg4a4b-1表达tATG4a公司在不含50μg/mL卡那霉素的蔗糖的MS培养基上筛选转基因。至少获得了五株独立的转基因植物，代表性数据显示在图7和​和88.

拟南芥根中GFP融合蛋白的细胞定位分析

将表达GFP-ATG8s的转基因植物的初生根在MS培养基上生长1周，然后将其切成块，置于水中进行显微镜观察。在氮气保护条件下，将生长在MS培养基上1周的转基因植物转移到MS-N培养基中，在黑暗中再培养7天，然后进行观察。使用德国耶拿蔡司LSM 510共焦激光扫描显微镜（Zeiss，Jena，Germany），使用488/568-nm ArKr激光和505-550nm带通滤波器组，对GFP融合蛋白的亚细胞定位进行分析。使用蔡司激光扫描显微镜（LSM 510，2.01版）和Adobe Photoshop 5.5（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）进行图像采集和处理。

霉素A治疗

野生型的初生根，atg4a4b-1，或atg4a4b-1;tATG4a公司在MS培养基上垂直生长1周的植物被切割，然后在含有1μM concanamycin A（C-9705；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）的MS-N液体培养基中培养，在23°C的温度下在黑暗中轻轻搅拌6至12小时。根被固定在水中，并通过常规透射光显微镜（Olympus IX81）进行观察。表达GFP-ATG8s的转基因植物的初生根也用如上所述的concanamycin A处理，并用表观荧光显微镜观察（Olympus IX81）。

电子显微镜

野生型和atg4a4b-1将用康乃霉素A处理的初生根固定在含有2%戊二醛的0.1M二羧酸缓冲液中，在冰浴中放置3h。将样品在相同的缓冲液中冲洗，并在冰浴中在2%四氧化锇中后固定3小时。将脱水试样嵌入环氧树脂（Epon 812）中。使用LKB-8800超薄切片机（Amersham Biosciences）使用金刚石刀制作超薄切片（70至80 nm），并将其安装在200米的铜网格上。切片用2%醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。用JEM-2000EX透射电子显微镜（日本东京JEOL）在100 kV电压下观察切片。

我们感谢威斯康星州拟南芥敲除设施团队提供的T-DNA插入池。我们还感谢国家基础生物学研究所的Hirokazu Tsukaya和静冈大学的Yuji Moriyasu提出的有益意见，感谢Miwa的Masami技术援助，感谢植物培养实验室的Chieko Nanba和Keiko Suzuki对我们植物的专业护理。pEZS-CL质粒是华盛顿卡内基研究所的David Ehrhardt赠送的礼物。这项研究得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部科学研究补助金的部分支持。