自噬将货物输送到溶酶体进行降解，这表明这些系统可能在PDA中受到协同调节。LC3和LAMP2的免疫染色显示，与未转化的人胰腺导管上皮细胞（HPDE）相比，PDA细胞系中的两种细胞器都显著扩增(,). 值得注意的是，透射电镜显示，与正常胰腺组织相比，治疗组PDA标本中的溶酶体数量/细胞增加（15.0±1.9 vs 1.0±0.9；). 因此，溶酶体生物发生的增加伴随着PDA中自噬小室的扩大，并可能促进高水平的自噬通量。与这些细胞器变化的转录控制一致，多个独立数据集的基因集富集分析（GSEA）显示，与正常胰腺组织相比，人类PDA标本的自噬溶酶体基因表达增加(,;表S1,S2系列). 因此，免疫组织化学证实肿瘤上皮细胞自噬/溶酶体蛋白上调().
MiT/TFE蛋白协同诱导PDA自噬溶酶体基因程序a）免疫荧光染色显示，与HPDE细胞相比，8988T细胞中的自噬体（LC3）和溶酶体（LAMP2）广泛重叠。
b）典型的透射电镜照片显示，与正常胰腺相比，PDA中溶酶体的丰度增加。定量相对溶酶体数量/细胞（见方法）。N=4个正常标本中的473个细胞和3个PDA标本中的406个细胞。**p<0.001
c）PDA中自噬/溶酶体基因相对于匹配正常组织的上调（参见表S2).
d、 e）与正常胰腺相比，免疫组织化学显示PDA上皮（闭合箭头）中自噬和溶酶体蛋白（d）和核定位TFE3（e）上调(左边)或基质细胞（开放箭头）。图（e）显示了正常（N=31）和PDA样品（N=354）中TFE3染色强度的量化（0=无染色到3=高染色）。
f）GSEA显示了原发性人类PDA中MiT/TFE（3TF）表达与自噬溶酶体基因特征之间的相关性。
g、 h）8988T细胞中TFE3的敲除导致自噬溶酶体基因的协同下调。（g）N=3个独立实验的RNA-seq值；每个基因p<0.05；(h）GSEA。
比例尺：11μm（a）、500 nm（b）、50μm（d）和20μm（e）。
在暴露于营养应激的正常细胞中，这两种细胞器的生物发生受到基本螺旋-环-螺旋转录因子的MiT/TFE亚类的转录调控6–1110种常见实体瘤类型的RNA测序数据显示，PDA中这些因子的相对表达水平较高，仅在黑色素瘤和肾癌中高于此水平，其中MiT/TFE是确定的致癌基因(). 免疫组织化学显示，在PDA亚群的肿瘤上皮中，细胞核定位的TFE3过度表达（在23%的PDA和3%的正常胰腺标本中，染色得分≥2；p<0.001；,; 参见方法）。同样，显微切片标本和异种移植物显示PDA细胞相对于正常导管上皮的TFEB和MITF mRNA频繁上调，PDA细胞系的亚群显示与HPDE细胞相比MiT/TFE过度表达(). 一般来说，单个标本中以单一MiT/TFE家族成员为主。
多个人类初级PDA数据集和培养的PDA细胞系的GSEA显示，MiT/TFE因子的表达与自噬溶酶体特征之间有很强的相关性(,). 因此，在8988T PDA细胞系中敲低TFE3（TFE3高，TFEB/MITF低）导致该特征的显著抑制（全局RNA-seq；). 染色质免疫沉淀（ChIP）证实，MITF和TFE3与多个自噬和溶酶体基因结合，其中含有一致的CLEAR（协调溶酶体表达和调节）元件7,8PDA细胞中(). 此外，MITF、TFE3或TFEB的敲除导致一系列PDA细胞系中许多携带CLEAR基因的下调，这些细胞系与MiT/TFE家族成员的相对表达较高，而未转化胰腺细胞系（HPDE和HPNE）和胰腺神经内分泌肿瘤细胞系（QGP1）没有显著变化(). 抗RNAi MITF或TFE3 cDNA的表达恢复了靶基因的表达，而显性阴性MITF的表达再现了RNAi的作用(). 因此，MiT/TFE蛋白在PDA细胞中选择性地发挥作用，在基础条件下调节广泛的自噬溶酶体程序。
在营养充足的条件下生长的非转化细胞中，MiT/TFE蛋白在溶酶体膜上被mTORC1磷酸化，导致其与14-3-3蛋白相互作用和细胞质滞留，而饥饿时mTORC2失活使其核移位9–11相应地，HPDE和HPNE细胞在全营养条件下主要表现为内源性和外源性表达的TFE3、MITF和TFEB的细胞质驻留，并在营养饥饿或用mTOR抑制剂Torin1处理后表现出核移位(,). 与之形成鲜明对比的是，一系列PDA细胞系显示出每个MiT/TFE蛋白的构成性核定位，而不管营养状况如何，也不管Torin1或MEK抑制剂的治疗如何，MEK抑制剂是另一种参与其调节的途径8(,). 磷酸化p70S6K的免疫印迹，mTORC1活性的读数，以及mTOR和LAMP2的免疫染色表明，mTORC 1在PDA细胞中是活性的，并表现出氨基酸调节的溶酶体结合(). 此外，所有细胞都表现出TFE3和MITF与14-3-3的共同免疫沉淀，并且在Torin1治疗后失去结合，尽管PDA细胞中的结合分数较低，这与MiT/TFE蛋白的主要核驻留相一致(). 因此，尽管显示完整的mTORC1信号，PDA细胞仍显示MiT/TFE的构成性核驻留。
MiT/TFE因子的构成核输入控制PDA自噬溶酶体功能a、 b）荧光显微镜显示（a）GFP-MITF和（b）在喂食和饥饿（3小时HBSS）条件下，指示细胞中的GFP-TFE3。
c）TFE3免疫印迹(左侧三个面板)、MITF(中间面板)和TFEB(右侧面板)用载体或Torin1（250 nM）处理细胞的细胞质（C）和核（N）部分1小时。
d）FLAG-TFE3在细胞中稳定表达，用抗FLAG抗体或对照IgG免疫沉淀裂解物，并对FLAG（TFE3）或IPO8进行免疫印迹。
e）人类标本中具有代表性的IPO8免疫染色。f）用指示的siRNA转染PDA细胞系，分离并免疫印迹TFE3，（8988T细胞，左侧面板)、MITF（PL18细胞，中间面板)或TFEB（8902个细胞，右侧面板).
g）如LAMP2染色所示，TFE3敲除导致溶酶体形态异常和大小增加。插入：放大视图。图表(正确的)：表达shGFP（N=151）、shTFE3（N=193）或用BafA1处理（N=52）的细胞中溶酶体直径的量化。**p<0.0001。
h）电子显微照片显示TFE3击倒后未消化的货物在溶酶体中积聚。
i）测定转染有指示siRNAs的8988T细胞溶酶体pH值。N=3个独立实验；**p<0.001（见方法）。
j）自体溶酶体总数的定量（mCherry+/GFP公司−斑点），使用串联mCherry-GFP-LC3报告器从N=10个细胞/条件。误差线表示平均值±标准误差。**p<0.0001。
k）通过DQ-BSA脉冲相测定，TFE3敲除或BafA1处理会破坏大胞吞蛋白的蛋白质降解。DQ-BSA在溶酶体中的降解是定量的（对于N=3个独立实验，与LAMP2+溶酶体共定位的荧光点/细胞数量，每个实验至少得分50个细胞）。**p<0.0001。
比例尺=18μm(a、 b)，50微米(e（电子）)，7.5微米(克).
为了揭示超越细胞质保留机制的机制，我们采用亲和纯化和定量蛋白质组学12鉴定PDA特异性TFE3相互作用蛋白。值得注意的是，Importin 8（IPO8）是核质转运蛋白Importinβ家族的成员13,14在PDA细胞中TFE3免疫沉淀物中显著富集，但在HPDE细胞中不富集(). 我们证实FLAG标记的TFE3在PDA细胞中特异性结合内源性IPO8(,). 此外，与对照组相比，人PDA标本和细胞系中IPO8的表达水平较高(,).
IPO8及其最密切相关的同源物，IPO7直接核导入特定货物，包括生长调节蛋白14–19因此，在多个PDA细胞系中，IPO8敲除导致核TFE3显著降低，并降低了总TFE3蛋白水平(
左边,). 在IPO8和IPO7联合击倒时，MITF和TFEB都观察到类似的效果(
中间的,正确的,). 重要的是，在非转化的HPDE和HPNE细胞中，IPO8敲除不影响基础（细胞质）TFE3水平，也不影响Torin1诱导的TFE3核移位(). 此外，IPO7/IPO8失活并未显著改变MiT/TFE mRNA水平(). 这些发现表明，Importins除了促进其核转运外，还可能调节MiT/TFE蛋白的稳定性。事实上，环己酰亚胺（CHX）处理研究表明，IPO8敲低加速了898T细胞中TFE3的周转(). 因此，依赖IPO8的MiT/TFE因子的核积累导致其在PDA细胞中转录程序的稳定和上调。
我们发现MiT/TFE蛋白的组成性激活对PDA细胞的自噬溶酶体功能至关重要。一系列PDA细胞系中MiT/TFE蛋白的耗竭导致溶酶体形态显著缺陷和溶酶体直径增加，这些效应通常与溶酶体应激和蛋白水解缺陷有关20,21（siCTRL和siTFE3分别为986.4±30.7nm和2722±72.6 nm,)而HPDE细胞受到的影响最小(). 用液泡型H（+）-ATP酶抑制剂Bafilomycin A1（BafA1）处理PDA细胞，可以观察到这些效应(). 相应地，TFE3击倒细胞的透射电镜和免疫荧光显微镜显示含有未消化货物的自溶体积聚(,). 此外，使用pH敏感染料俄勒冈州绿514与葡聚糖偶联后，溶酶体pH值显著增加(). 此外，mCherry-GFP-LC3自噬报告子分析显示，TFE3失活降低了8988T细胞的自噬通量（55.7%±9.6%mCherry+/GFP公司−siCTRL中的斑点vs siTFE3中的19.8%±2.9%，). 最后，为了检测蛋白水解活性，8988T细胞被喂食BODIPY染料结合的BSA（DQ-BSA），该BSA在溶酶体蛋白水解后被大胞饮作用和荧光吸收。TFE3敲除或BafA1处理导致与LAMP2共定位的荧光点显著减少（siCTRL中14.8±6.1个点/细胞，siTFE3和BafA1中分别为3.7±1.8和0.2±0.7个点/电池，). TMR-右旋糖酐的摄取没有受到影响，这表明溶酶体蛋白水解而不是细胞外物质的内化发生了特异性损伤（未显示）。值得注意的是，通过大胞饮作用清除的细胞外白蛋白的溶酶体分解是PDA的重要营养来源22因此，通过控制自噬流量和溶酶体分解代谢，MiT/TFE蛋白支持一个整合的细胞清除程序，该程序能够有效处理自噬和大胞饮作用产生的货物，为PDA细胞提供细胞内和细胞外营养物质的关键来源。
胰腺细胞中MITF或TFE3的过度表达加强了这些发现，表明自噬溶酶体基因、LC3B foci和脂质化LC3-II的诱导作用在溶酶体酸化抑制剂氯喹（CQ）治疗后进一步增强，表明自吞噬流量显著增加().
溶酶体中降解的货物产生代谢中间产物，可进入多种途径23,24为了深入了解MiT/TFE控制的自噬溶酶体功能的代谢产物，我们对转染了TFE3靶向siRNA的8988T和PSN1细胞进行了整体代谢产物分析。这些研究表明，在15.2%（53/347）的检测到的代谢物中，这两种细胞系的共同统计显著变化。最显著的变化是氨基酸（AA）及其分解产物，31%（25/80）显示丰度下降，而在其他一般代谢物组中仅观察到有限的变化(;表S3). TFE3沉默不影响AA摄取()，表明自噬-溶酶体系统可能提供大量的细胞内AA，而与PDA的外部可用性无关。为了支持这一模型，TFE3敲除、BafA1处理和ATG5敲除导致自噬失活显著降低PDA细胞系中细胞内AA水平，但不降低对照细胞中的AA水平(;)，并导致AMP-活化蛋白激酶（AMPK）激活和细胞ATP水平降低，提示能量应激的诱导(). 反过来，HDPE细胞中MITF或TFE3的过度表达导致AMPK信号的下调().
MiT/TFE因子维持自溶体衍生的氨基酸库a）TFE3敲除后8988T和PSN1细胞的整体代谢物分析显示，与其他一般代谢物组相比，AA优先减少（见方法）。（灰色：无变化，红色：增加，绿色：减少）。
b）量化转染siCTRL或siTFE3的8988T细胞中AA水平的折叠变化。*p<0.03，**p<0.003。
c）BafA1导致PDA细胞中AA水平下降(左侧面板)而在HPDE细胞中AA不变或增加(右侧面板); * p<0.05，**p<0.005。
d）10%AA饥饿后连续时间免疫印迹检测所示细胞中的p-p70S6K水平。
e）用siCTRL或siTFE3转染8988T细胞的p-p70S6K免疫印迹，并在对照条件下或0%或10%AA中生长指定时间。
f、 g）HPDE-MITF细胞显示(（f）)AA饥饿和（g）10%AA（图中定量）在短暂饥饿条件下增强菌落形成。*p<0.001。对于所有图形，误差条表示N=3个独立实验的平均值±标准差。
这些研究结果表明，PDA细胞在营养缺乏的条件下应该具有更强的缓冲AA水平的能力。为了测试这一点，我们将细胞切换到低AA浓度（正常浓度的10%），并监测p70S6K的磷酸化，这是对细胞内AA水平敏感的mTORC1活性读数25HPDE细胞在10%AA中5-15分钟内p-p70S6K消失，而PDA细胞（8988T和PSN1）在>30分钟内保持稳定水平(). 相应地，8988T细胞中TFE3失活大大加速了p-p70S6K的下降(). 反过来，HPDE细胞中MITF的过度表达导致p-p70S6K水平在10%AA饥饿时保持不变，并且在这种情况下显著增加了克隆生成性生长，同时不影响全营养中的克隆生成性(,). 综上所述，这些数据表明PDA细胞依赖自噬溶酶体功能维持细胞内AA池，这有助于在营养应激下存活。
与MiT/TFE在细胞器功能和代谢调节中的关键作用一致，表达高内源性MITF、TFE3或TFEB的PDA细胞系的生长因该因子的敲除而显著受损，这一效应可通过shRNA-resistant cDNA的共同表达来挽救(,). 相比之下，HPNE和QGP1细胞的生长不受影响(). 如前所述，与对照细胞相比，PDA细胞对CQ治疗普遍敏感2(). 此外，MITF或TFE3的异位表达使HPNE细胞对CQ过敏，将MiT/TFE调节的清除途径与这些生长表型联系起来().
PDA增长需要MiT/TFE因素a）击倒指定的MiT/TFE因子会损害在体外一组PDA细胞系中的集落形成能力。
b）抗shRNA的MITF在PL18细胞中的表达(左边)或Panc1细胞中的TFE3(正确的)抑制shRNA介导的MITF或TFE3基因敲除后的生长。误差线表示N=3个独立实验的平均值±标准差；**p<0.001。
c）强制表达MITF或TFE3使HPNE细胞对CQ的生长抑制敏感。误差条表示N=3个独立实验的平均值±标准差；*p<0.005，**p<0.0001。
d）用两个独立的shRNAs敲除TFE3可显著抑制Panc1细胞皮下异种移植的生长。误差线表示N=6个肿瘤/组的平均值±s.e.m.；*p<0.03。
e）Kras中MITF过度表达G12D系列小鼠PanIN细胞在原位注射后促进肿瘤发生。N=每组5只小鼠；**p＜0.001。比例尺=200μm。
f）在PDA中，由于IPO8/IPO7介导的转运，MiT/TFE因子上调并显示出增加的核驻留，导致自噬溶酶体基因的转录诱导，并增加这些细胞器的生物发生和功能。自噬溶酶体扩张整合了PDA中营养物质清除和代谢适应的两条主要途径，即自噬和消化通过大胞饮作用获得的血清蛋白。
为了扩大我们在初级患者衍生样本中的发现，我们检查了一系列PDA早期传代培养。重要的是，这些细胞还表现出高度的基础自噬、核定位的MiT/TFE蛋白以及依赖于MiT/TFE-的自噬溶酶体基因表达、细胞器功能和集落形成能力().
值得注意的是，TFE3和MITF的敲除实际上分别抑制了Panc1和8988T细胞以及PL18细胞的异种移植瘤生长(,). 相反，MITF过表达增强了原发性Kras的致瘤性G12D系列-表达小鼠胰腺上皮细胞。鉴于克拉斯G12D系列原位注射后6周，对照细胞仅形成局灶性低级别PanIN样病变，MITF的共同表达导致3/5小鼠出现大的侵袭性肿瘤(,). 因此，为了满足其增强自噬溶酶体功能的要求，MiT/TFE因子是PDA发病的潜在驱动因素体内.
总之，我们的工作将新的重点放在MiT/TFE蛋白对溶酶体的调节上，作为PDA细胞代谢重编程的连接。溶酶体活性的增加整合了清除营养物质的自噬和大细胞吞噬的主要途径，从而维持细胞内AA的可用性(). MiT/TFE因子从mTORC1的抑制中逃逸，使癌细胞能够保持合成代谢途径的强劲激活，同时受益于代谢微调和对自噬和溶酶体分解代谢激活所产生的应激的适应。因此，我们认为在MiT/TFE转录程序控制下的溶酶体激活是PDA的一个新特征。这些发现以及最近的工作26–28提示靶向异常溶酶体功能对癌症具有潜在的治疗益处。
材料
试剂来自以下来源：圣克鲁斯生物技术公司的MITF抗体（sc-71587）；Millipore的GAPDH（MAB374）；来自Cell Marque的TFE3（MRQ-37；354R-14））；来自Abcam的LAMP2（ab-25631）；来自细胞信号技术的TFEB（4240）、LC3B（3868）、磷酸-T389 S6K1（9234）、S6K1，（2708）、磷酸-AMPK（Thr 172）（2535）、AMPK（2603）、磷酸化-ACC（Ser 79）（3661）、ACC（3676）、Lamin（2032）、mTOR（2893）和FLAG表位（2368）；Novus Biologicals的IPO8（NBP2-24751）和LC3II（NB600-1384）；Sigma Aldrich的CTSS（HPA002988）、ATP6V1H（HPA023421）和ULK2（HPA009027）；FLAG M2亲和凝胶，来自Sigma Aldrich的氨基酸；RPMI、DMEM、胎牛血清（FBS）和透析FBS（dFBS）、Alexa 488和568-结合二级抗体；70KDa Dextran-Regon Green 514，来自Invitrogen的DQ-Green-BSA；美国生物制品无氨基酸RMPI；托克里斯Bafilomycin A1。
细胞培养
细胞系取自美国类型培养收集。马萨诸塞州总医院（MGH）产生了患者源性PDA培养物。所有受试者均获得知情同意。MGH分子治疗中心对所有细胞系进行STR分析。根据IRB批准的方案02–240和2007P001918（另见补充表S4). 所有使用的品系都证实激活了KRAS突变。细胞在以下培养基中培养：8988T、Panc1、PL18、PSN1、8902，在添加10%FBS的DMEM中；含10%FBS的RPMI中的HupT3、KLM1；如前所述培养HPDE细胞30使用LookOut支原体PCR试剂盒（Sigma，MP0035）确定研究中使用的所有细胞系和原代细胞的支原体阴性污染状态。
构件
通过将MITF-H（Origene）的cDNA亚克隆到pLJM1（Addgene）慢病毒载体的NheI和EcoRI位点、pRetroX-Tight-Pur（Clonetech）的NotI和EcoSI位点，生成了N-末端FLAG标记的人MITF-H-亚型表达结构多西环素诱导载体或pBabe-puro逆转录病毒载体的EcoRI和SalI位点。如前所述，产生了缺乏5′反式激活域的显性负MITF-H亚型31简单地说，删除对应于840 bp的前280 aa，然后删除R301（对应于MITF-M的R218）。该cDNA被克隆到pLJM1的NheI和EcoR1位点。通过从pcDNA3.1-（HA）中亚克隆TFE3的cDNA，生成了N末端FLAG标记的全长人TFE3表达结构2-TFE3（取自MGH David Fisher博士）进入pBabe-puro逆转录病毒载体的BamHI和EcoRI位点。GFP标记的MITF和TFE3是通过将MITF-H的cDNA亚克隆到pEGFP-C1（Clonetech）载体的BglII和SalI位点以及将TFE3亚克隆到HindIII和BamHI位点而产生的。MITF和TFE3的siRNA抗性表达构建物是通过快速改变位点定向突变（安捷伦科技）产生的。mCherry-GFP-LC3是Alec Kimmelman（Dana Farber癌症研究所）赠送的一份礼物。
siRNA和慢病毒介导的shRNA靶点
抗MITF、TFE3、TFEB、ATG5和IPO8的siRNA购自Ambion和Thermo Scientific。本研究中使用的shRNA的RNAi联盟克隆ID如下：shMITF:TRCN0000329793（CGGGAACTTGATTTT），TRCN0000019122（CGTGGACTATCCGAAAGTT）；shTFEB:TRCN0000013108（CCCACTTGGTGCTAATAGCT），TRCN000001109（CGATGTCCTTGGCTACATCAA）。通过将抗人TFE3的寡核苷酸（对应于下文所述的siRNA序列）退火到pLKO.1-puro载体的AgeI和EcoRI位点，生成抗人TFE的shRNA构建物。TFE3靶序列如下：GCAGCTCCGAAATTCAGGAACT；CGCAGGCGATTCACATAAC；ggaatctcttgatgtgtaca。
细胞增殖和集落形成测定
将细胞以每孔30000个细胞的速度放置在12孔板中，置于2 mL完整培养基中，或以每孔2000个细胞的速率放置在6孔板中于2 mL培养基中。在指定的时间点，对细胞进行胰蛋白酶化并计数。菌落板在4%多聚甲醛中固定7天后，用0.1%结晶紫染色。
氨基酸饥饿和Bafilomycin A1处理
10%AA饥饿是通过在添加10 mM葡萄糖的无AA RMPI中培养细胞进行的，10%AA是相对于RPMI培养基中的水平计算的。AA储备溶液由单个粉末制成。在进行BafA1处理的地方，用150 nM BafA1培养细胞。在菌落形成过程中，通过在无AA培养基中培养细胞18小时，在电镀后第2天进行急性AA饥饿。然后将培养基更换为完整的培养基，进行额外6天的细胞生长。
SDS-PAGE分析
在冰冷裂解缓冲液（150 mM NaCl、20 mM Tris（pH 7.5）、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton X-100、2.5 mM磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸、1 mM钒酸钠和每10 ml一片无EDTA蛋白酶抑制剂[Roche]）中裂解细胞。样品通过离心澄清，并使用BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific）测量蛋白质含量。30 mg蛋白质在9%SDS-PAGE凝胶上溶解并转移到PVDF膜上（宾夕法尼亚州匹兹堡GE Healthcare Life Sciences）。在4°C下与一级抗体孵育过夜之前，在含有5%非脂肪干乳和0.1%吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水（TBS）中封闭膜。然后用TBS-T清洗膜，然后暴露于适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体45分钟，并使用增强化学发光（ECL）检测系统（Thermo Scientific）在柯达X射线胶片上显示。根据制造商程序，使用Thermo Scientific NE-PER核和细胞质分馏试剂盒进行亚细胞分馏。在免疫沉淀实验中，将稳定表达FLAG标记的MiT/TFE蛋白的细胞系中的1–3μg澄清蛋白裂解物捕获在抗FLAG抗体结合蛋白A-琼脂糖珠（M2-FLAG亲和凝胶；Sigma-Aldrich）上。通过SDS-PAGE和western blotting对免疫复合物进行洗涤和分析。免疫球蛋白G抗体作为对照。
代谢物提取
当细胞处于指数生长期时提取样本。用1XPBS清洗井并抽吸。600μL−80°C甲醇：H2向每个孔中添加O（50:50），然后将板置于−80°C下1–1.5小时。当平板在冰上解冻时，通过刮擦将细胞分离，转移到1.5毫升的试管中，并放置在干冰上。样品在4°C下旋转30秒。为了澄清匀浆，样品在20K x克，在4°C下保持7分钟。将澄清的上清液转移到新的1.5mL试管中。向每个样品中添加600μL霍乱（用戊烯稳定），一次一个，然后立即在室温下将样品涡流30秒，然后放在冰上。通过在20K×克，在4°C下持续0.25小时。提取水相（极性）并转移至新鲜的1.5mL试管中。样品通过SpeedVac蒸发，在液氮中快速冷冻，并在−80°下储存以进行进一步处理。
衍生化（所有样本）
通过在SpeedVac中快速旋转蒸发样品，将其加热至室温。样品在37°C下溶于30μl 2%甲氧基胺盐酸盐吡啶（MOX）（Pierce）中1.5小时。通过在60°C下添加45μl N-甲基-N-（叔丁基二甲基硅基）三氟乙酰胺（MBTSTFA）+1%叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMCS；Pierce。
GC-MS/MS分析
按照描述进行GC-MS分析32,33简而言之，在安捷伦6890 GC仪器上进行分析，该仪器包含一个30m DB-35MS毛细管柱，该毛细管柱与安捷伦5975B MS相连。电子碰撞（EI）电离设置为70 eV。每次分析都在扫描模式下进行，记录100–605范围内的质量电荷比光谱米/z对于每个样品，在270°C下注入1μl，使用氦气作为载气，流速为1 ml/min。为了动员代谢物，将GC烘箱温度保持在100°C下3 min，并在3.5°C/min下增加到300°C。样品分析一式三份。代谢物水平归一化为细胞数量和/或蛋白质，并绘制为相对于对照条件的倍数变化。
免疫荧光分析
细胞以100000–300000个细胞/盖玻片的速度被涂布在纤维粘连蛋白涂层玻璃盖玻片上。12–16小时后，用PBS冲洗载玻片一次，并在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，或用−20°C甲醇固定5分钟。用PBS冲洗两次玻片，用0.05%Triton X-100渗透细胞2分钟。用PBS清洗两次后，在室温下将玻片与5%正常山羊血清中的一级抗体孵育1小时，再用PBS冲洗四次，并与山羊产生的二级抗体（在5%正常山羊血清中稀释1:400）在黑暗中在室温下孵育45分钟。使用Vectashield（Vector Laboratories）将载玻片安装在玻璃载玻片上，并在旋转圆盘共焦系统（Perkin Elmer）或蔡司激光扫描显微镜（LSM）710上成像。使用ImageJ和Adobe PhotoshopCS4处理图像。为了量化溶酶体直径，使用ImageJ软件从包含4-6个细胞/场的3-5个场绘制130–290个溶酶体的线条。线像素值根据客观放大率和相机像素大小转换为μm。所提供的数据代表了3-5个重复实验。DQ-BSA实验如前所述进行34简单地说，细胞与DQ-BSA孵育30分钟，然后在无DQ-BSA的培养基中追逐1小时。结果表明，BafA1在100 nM下处理1小时。计算与LAMP2阳性溶酶体共定位的DQ-BSA斑点数。在转染mCherry-GFP-LC3报告子的细胞中进行自体溶酶体成熟度的测量。用siCTRL或siMITF/siTFE3转染细胞，48小时后用mCherry-GFP-LC3转染。24小时后，将细胞固定在4%PFA中，并对自溶体总数（mCherry+/GFP）进行量化−点）与总点/细胞（N>1000个总点，来自N=10个细胞/条件）相比，至少计算了3个独立实验。
组织学和免疫染色
组织样本在4%缓冲甲醛中固定过夜，然后嵌入石蜡中，并由DF/HCC研究病理核心切片（5mm厚）。使用标准方法进行血红素和曙红染色。对于免疫组织化学，未染色的载玻片在55°C下烘烤过夜，在二甲苯中脱蜡（两次处理，每次6分钟），然后在乙醇中依次复水（100%中5分钟，95%中3分钟，75%中3分钟和40%中3分钟），并在0.3%Triton X-100/PBS（PBST）中清洗5分钟，在水中清洗3分钟。为了揭开抗原，标本在2100抗原检索器（Aptum Biologics）中用柠檬酸为基础的1x抗原揭开溶液（H-3300，Vector Laboratories）煮熟，用PBST冲洗三次，在室温下用1%H2O2培养10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，再用PBST洗涤三次，用5%山羊血清在PBST中封闭1h。一级抗体在封闭液中稀释如下：抗TFE3（Cell marque，354R-14）1:100；抗CTSS（Sigma，HPA002988）1:200；抗ATP6V1H（Sigma，HPA023421）1:100；抗ULK2（Sigma，HPA009027）1:100，在4°C下与组织切片孵育过夜。由于缺乏适合IHC的抗体，无法评估患者PDA组织中的MITF和TFEB蛋白水平。市售的用于IHC的MITF抗体对黑色素瘤（MITF-M）同种型是特异性的，或与其他MiT/TFE家族成员发生交叉反应。然后将样本在PBST中清洗三次，每次3分钟，并在室温下用封闭溶液中的生物素化二级抗体（Vector Laboratories）孵育1小时。然后在PBST中清洗试样三次，并用ABC试剂（Vectastain ABC试剂盒#PK-6100）处理30分钟，然后每次清洗三次，每次3分钟。最后，用DAB（二胺联苯胺）底物试剂盒（SK-4100，Vector Laboratories）对载玻片进行过氧化物酶染色3分钟，用水冲洗并用苏木精复染。免疫染色通过组织芯片的半定量分析进行评估，量化染色肿瘤细胞的强度，评分范围为0（无染色）到3（最强强度）。染色的载玻片用OlympusDP72显微镜拍摄。
人体样本
用于IHC和早期传代PDA培养物生成的PDA样品是根据IRB批准的方案02-240和2007P001918获得的。IHC样本来自2001年至2012年间在马萨诸塞州总医院（MGH）切除的患者。MGH（V.D.）的胃肠道肿瘤病理学家证实了PDA的病理诊断。PDA早期传代培养取自腹水标本。活检证实患者患有PDA。
电子显微镜
对于体外研究，使用戊二醛固定剂（2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、0.025%氯化钙，在pH 7.4的0.1M二甲氨基甲酸钠缓冲液中）在室温下轻轻摇晃15分钟，将组织培养标本直接固定在汇合的6孔或10-cm板中，轻轻刮取并造粒500xg，用二甲氨基甲酸缓冲液清洗两次。为了制作细胞块，对细胞进行离心，并将其重新悬浮在温水浴中2%的温水琼脂中，以保持琼脂液体。然后再次离心细胞，使琼脂在冰水浴中变硬。含有离心管尖端的组织被切断，形成一个琼脂块，细胞嵌入其中。该琼脂块随后在徕卡猞猁自动组织处理器中进行常规处理。简言之，组织在四氧化锇中后固定，用乙酸铀酰对En-Bloc染色，在分级乙醇溶液中脱水，用环氧丙烷/环氧乙烷混合物渗透，嵌入纯环氧乙烷中，并在60°C下聚合过夜。切下一个微米的切片，用甲苯胺蓝染色，并用光学显微镜检查。选择具有代表性的区域进行电子显微镜研究，并相应地修剪Epon块。用LKB 8801超薄切片机和金刚石刀切割薄片，用柠檬酸铅染色，并在FEI Morgagni透射电子显微镜下进行检查。图像由AMT数字CCD相机拍摄。
为了分析人体组织，将新鲜活检组织放入Karnovsky的KII溶液（2.5%戊二醛，2.0%多聚甲醛，0.025%氯化钙，0.1M二甲氨基甲酸钠缓冲液，pH 7.4）中，在4°C下固定过夜，并保存在冷缓冲液中。随后，将其在四氧化锇中进行后固定，用乙酸铀酰对En-Bloc进行染色，在分级乙醇溶液中脱水，用环氧丙烷/环氧丙烷混合物渗透，平包在纯环氧丙烷中，并在60°C下聚合过夜。切下一个微米的切片，用甲苯胺蓝染色，并用光学显微镜检查。选择具有代表性的区域进行电子显微镜研究，并相应地修剪Epon块。用LKB 8801超薄切片机和金刚石刀切割薄片，用佐藤铅染色，并在FEI Morgagni透射电子显微镜下进行检查。图像是用AMT（高级显微镜技术）2K数字CCD相机拍摄的。
溶酶体pH值的测量
如前所述，通过对pH敏感的染料俄勒冈州绿514的比率成像，在完整细胞上测定溶酶体pH值35,368988T细胞转染对照siRNA或TFE3 siRNA。实验前一天，将80000个细胞置于低血清和低葡萄糖培养基中的黑色96孔板中。在实验当天，将30μg/ml 70KDa-葡聚糖与俄勒冈州绿514（Dx-OG514，Invitrogen）结合，在全培养基中培养细胞6小时。将细胞漂洗3次以去除多余的染料，并在不含Dx-OG514的培养基中追踪2小时，这导致Dx-OG5124在溶酶体中选择性积累。在Spectramax微孔板阅读器（分子器件）中，在440nm和490nm激发后，在530nm处收集Dx-OG514荧光。将490/440荧光发射比插值到校准曲线中。通过在K+等渗溶液（145 mM KCl、10 mM葡萄糖、1 mM MgCl）中浸泡细胞来建立校准曲线2和20 mM HEPES、MES或醋酸盐），缓冲至pH值3.5至7.0，并含有10μg/ml尼日利亚霉素。490/440的比值被绘制为pH的函数，并拟合到玻尔兹曼S形。所有测量均一式四份。所提供的数据代表了3个重复实验。
定量RT-PCR
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA）提取总细胞RNA，并使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiangen）对2μg总RNA进行逆转录。在MX3005P连续荧光检测器（Stratagene）或Lightcycler 480（Roche）中，使用FastStart Universal SYBR Green（罗氏）进行定量RT-PCR。以18S核糖体RNA序列为对照，采用比较CT法计算cDNA的相对量。引物序列可根据要求提供。如前所述进行MITF同种型特异性PCR37.
染色质免疫沉淀（ChIP）
根据制造商的说明，使用染色质免疫沉淀分析试剂盒（Millipore）进行ChIP实验。简单地说，106表达FLAG-标记MITF或TFE3的细胞用1%甲醛固定10分钟（对于FLAG-MITF实验，细胞在多西环素处理48小时后固定）。用冰镇PBS洗涤细胞两次，并在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的冰镇SDS裂解缓冲液中进行裂解。根据制造商的协议进行染色质提取和DNA超声处理。在M2-FLAG亲和凝胶上从免疫复合物中回收DNA。回收免疫沉淀DNA并进行实时PCR分析。ChIP引物已经过描述38.
异种移植研究
小鼠被安置在无病动物设施中。所有实验均根据马萨诸塞州总医院研究动物护理小组委员会批准的方案2005N000148进行。对于皮下异种移植物，Panc1、8988T或PL18细胞被靶向TFE3（n=2）、MITF（n=2）和GFP（对照发夹，n=1）的慢病毒shRNAs感染，并接受嘌呤霉素选择（2μg/mL）在体外. 1.5 – 2.5 × 106细胞悬浮在Hanks缓冲盐溶液（HBSS）：基质凝胶的1:1混合物中，皮下注射到3-4只雌性NOD的下腹部。每组CB17-Prkdcscid/J小鼠（6-10周龄）（从Jackson Laboratories购买，品系#001303）。每周测量肿瘤的长度和宽度，并根据公式（长度×宽度2)/2. HMS机构动物护理和使用委员会（IACUC）根据04-605号方案批准了所有人类PDA系异种移植实验。在原位小鼠研究中，MITF或GFP在小鼠PanIN原代细胞中稳定表达39另外，多西环素诱导的MITF表达结构也在小鼠PanIN原代细胞中稳定表达。1 × 106将细胞以1:1的基质凝胶：PBS混合物原位注射到SCID小鼠（n=5/组）的胰腺中。植入后2个月对小鼠实施安乐死，采集胰腺并提交组织学检查。没有小鼠被排除在分析之外。实验旨在使用T检验检测肿瘤大小50%的变化，80%的功率和5%的I型误差。
图像分析与统计
使用Image J软件（NIH）进行图像分析，包括密度测定和荧光强度测量。除非另有规定，否则结果的统计分析表示为平均值±标准偏差。使用双尾学生的显著性分析t吨测试。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
TFE3相关蛋白的定量蛋白质组学
在Orbitrap Fusion质谱仪（Thermo Scientific）上使用tandem-mass标签（TMT）试剂对富集的蛋白质进行多重定量蛋白质组学分析。如前所述，用二硫醚（DTT）和用碘乙酰胺烷基化的游离硫醇还原二硫键44然后用三色乙酸沉淀蛋白质，再悬浮在50 mM HEPES（pH 8.5）和1 M尿素中，首先在室温下用内蛋白酶Lys-C（Wako）消化17小时，然后在37°C下用顺序胰蛋白酶（Promega）消化6小时。在Sep-Pak C上脱盐肽18固相萃取（SPE）试剂盒（Waters），使用BCA测定法（Thermo Scientific）测定肽浓度，并用一种可用的TMT-10plex试剂（Thermo Scientific）标记最多50μg的肽45为了实现这一点，将肽干燥并重悬于50μl 200mM HEPES（pH 8.5）和30%乙腈（ACN）中，并将10μg TMT-in试剂在5μl无水ACN中加入溶液中，将溶液在室温（RT）下孵育1小时。然后通过在200 mM HEPES（pH 8.5）中添加6μl 5%（w/v）羟胺来终止反应，并在室温下培养15分钟。通过添加50μl 1%三氟乙酸（TFA）使溶液酸化，并将在一次质谱测量中量化的样品合并，然后在Sep-Pak C上进行脱盐18（SPE）滤芯。然后将肽混合物干燥并重新悬浮在8μl中，其中3个在Orbitrap Fusion质谱仪上通过微柱液相色谱-串联质谱分析，并使用最近引入的多级（MS3）方法提供高度准确的定量44,45.
质谱仪配备了EASY-nLC 1000集成自动采样器和HPLC泵系统。在内径为100μm的微毛细管柱上分离肽，该微毛细管柱内先填充0.5 cm的Magic C4树脂（5μm，100μl，Michrome Bioresources），然后填充0.5 cm Maccel C18树脂（3μm，200º，Nest Group）和29 cm GP-C18树脂（1.8μm，120º，Sepax Technologies）。以300 nl/min的流速在165 min内用8–27%ACN的梯度在0.125%甲酸中洗脱肽。为了鉴定和量化TMT标记的肽，我们采用同步前体选择MS3方法44–46在数据相关模式下。扫描序列开始于采集Orbitrap中采集的完整MS或MS1一个光谱（m/z范围，500-1200；分辨率，60000；AGC目标，5×105; 最大注射时间（100 ms）和在全ms光谱中检测到的十个最强烈的肽离子，然后进行MS2和MS3分析，同时以自动方式优化采集时间（最高速度，5秒）。MS2扫描在线性离子阱中进行，使用以下设置：四极隔离，隔离宽度为0.5Th；碎片法，CID；AGC目标，1×104; 最大注入时间，35ms；归一化碰撞能量，30%）。使用同步前体选择，在每次MS2扫描后为MS3实验选择10个最丰富的片段离子。使用HCD碎片进一步碎片化离子（归一化碰撞能量，50%），并在Orbitrap中获得MS3光谱（分辨率，60000；AGC靶，5×104; 最大注入时间，250 ms）。
对内部生成的基于SEQUEST的47软件平台。使用ReAdW.exe的修改版本将RAW文件转换为mzXML格式。根据包含人类UniProt数据库（2014年4月2日下载）中所有蛋白质序列以及猪胰蛋白酶等已知污染物的蛋白质序列数据库搜索MS2光谱。这个数据库的目标组件后面是一个诱饵组件，它包含相同的蛋白质序列，但顺序颠倒（或颠倒）48MS2光谱与肽序列匹配，两个末端与胰蛋白酶特异性一致，允许两个缺失的胰蛋白酶裂解。前体离子m/z耐受性设置为50 ppm，N-末端和赖氨酸残基（229.162932 Da）上的TMT标记以及半胱氨酸残基上的氨基甲酰化（57.021464 Da）设置为静态修改，蛋氨酸的氧化（15.994915 Da）设为可变修改。使用target-decoy数据库搜索策略48通过使用线性判别分析，根据以下SEQUEST搜索分数和肽序列属性计算出单个判别分数，获得了小于1%的光谱分配错误发现率：质量偏差、XCorr、dCn、胰蛋白酶裂解缺失数和肽长度49使用后验误差直方图计算肽分配正确的概率，并结合分配给蛋白质的所有肽的概率，过滤蛋白质FDR小于1%的数据集。将UniProt数据库中多个蛋白质序列中包含序列的肽分配给具有大多数匹配肽的蛋白质49.
TMT报告离子强度被提取为在所收集的MS3光谱中预测的报告离子强度周围的0.03Th窗口内的最强离子的报告离子强度。只有MS3的平均信噪比大于28个报告离子，且具有隔离特异性44大于0.75的被视为定量。对分配给蛋白质的所有肽的报告离子进行汇总，以确定蛋白质强度。蛋白质TMT强度的两步归一化是通过首先根据为所有蛋白质计算的平均蛋白质强度中值，对每个蛋白质在所有获得的TMT通道上的蛋白质强度进行归一化。为了校正每个样品中肽混合物的轻微混合误差，根据每个TMT通道中的所有蛋白质强度计算归一化强度的中位数，并将蛋白质强度归一化为这些中位数强度的中值。
