BAG3通过翻译而非转录机制调节MAP1LC3B总蛋白水平

通过溶酶体或蛋白酶体途径降解LC3B不受BAG3的影响

LC3B是一种高度动态的蛋白质，它与货物一起被自溶体和蛋白酶体降解。^23,24为了分析BAG3对溶酶体降解LC3B的影响，用NH处理HeLa细胞₄Cl.这种化合物增加酸性细胞器的pH值并抑制溶酶体降解。LC3B减少由BAG3型用NH处理细胞时保持敲除₄氯离子(图2A). NH₄Cl处理结果与BAF获得的数据一致(图1A)它还阻止溶酶体降解。此外，用溶酶体特异性标记探针LysoTracker Green孵育显示BAG3型击倒细胞(图2B). NH中该标签减少₄氯⁻处理过的HeLa细胞（图S4A），表明LysoTracker Green对酸性细胞器具有特异性。这些数据表明，通过溶酶体途径降解LC3B不受BAG3水平的影响。

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图2。

BAG3对LC3B溶酶体和蛋白酶体降解的影响。HeLa细胞转染对照（siControl）或BAG3型（siBAG3型)siRNA。（A） 用NH处理转基因细胞₄过去24小时内的Cl（5 mM）。蛋白质水平用western blot分析。显示了经ACTB归一化的总LC3B（LC3B-I加LC3B-II）的代表性图像和量化。（B） 将转基因细胞与LysoTracker Green（50 nM）孵育，并通过流式细胞术评估荧光。显示了荧光的平均值。（C） 在过去24小时内，用MG132（2µM）处理转染细胞。蛋白质水平用western blot分析。显示了经ACTB归一化的总LC3（LC3B-I加LC3B-II）的代表性图像和量化。UBB（泛素B）显示为MG132的对照。（D） siRNA转染的细胞在24小时后用GFPµ质粒新转染。用流式细胞仪检测荧光。荧光细胞的百分比显示在代表性图像中。还显示了GFPµ荧光的定量。数据表示为至少3个独立实验的平均值±SEM。使用ANOVA和/或Student计算统计显著性t吨测试**，P（P）<0.01与。siControl；^###,P（P）<0.001与。全日空航空公司₄Cl或MG132-处理的对照品。

此外，我们探讨了LC3B总水平的降低是否BAG3型敲除是由于其蛋白酶体降解增加。蛋白酶体抑制剂MG132的治疗并没有逆转由BAG3型击倒(图2C). 这些结果表明BAG3型敲除并不会通过增加蛋白酶体降解来降低LC3B蛋白的总水平。相反，先前有人认为BAG3影响蛋白酶体活性。¹³因此，我们研究了细胞内蛋白酶体的活性BAG3型击倒HeLa细胞。BAG3型敲除降低绿色荧光蛋白µ（GFPµ）荧光，这是蛋白酶体活性的报告，²⁵表明GFPµ降解增加(图2D). 这些数据表明BAG3型敲除增加蛋白酶体活性。为了验证GFPμ被蛋白酶体降解，用MG132培养细胞。正如预期的那样，蛋白酶体的抑制阻止了GFPµ荧光的降低（图S4B）。

LC3B公司基因转录不受BAG3调节

在排除BAG3影响LC3降解的想法后，我们研究了BAG3是否调节LC3B公司基因转录。放线菌素D的转录抑制并没有减少LC3B蛋白总水平的增加，LC3B蛋白质总水平的升高是由BAG3型(图3A). 为了检查放线菌素D是否有效降低mRNA转录，我们进行了2次对照试验。在第一个实验中，我们评估了放线菌素D处理是否降低了几种mRNA的水平，包括LC3B、BAG3、SQSTM1/p62（隔离体1），热休克蛋白A9/mtHSP75（热休克70 kDa蛋白9[mortalin]）和TRAP1/HSP90L型（TNF受体相关蛋白1）（图S5A）。在第二次分析中，我们使用点击化学（Click Chemistry）来评估全局RNA转录，使用炔修饰核苷EU（5-乙炔基尿苷）与叠氮衍生荧光团偶联（图S5B）。为了确定BAG3是否控制LC3B公司，我们评估了LC3B公司(地图1LC3B)以及相关基因家族。图3B说明了这一点BAG3型过度表达并没有改变任何LC3B公司-相关的mRNA。什么时候？BAG3型被si击倒BAG3、LC3B(地图1LC3B)mRNA水平也没有变化（图S5C），但观察到与地图1LC3AmRNA。这可能是对缺乏地图1LC3B什么时候BAG3型被击倒。这些结果表明，BAG3通过既不涉及LC3B降解也不涉及其转录的机制调节LC3B蛋白水平。

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图3。

BAG3对LC3B公司转录。（A） HeLa细胞转染对照（pControl）或BAG3型（第页BAG3型)质粒。分别添加放线菌素D（3µg/mL）和BAF（10 nM）6 h和5 h，并通过western blot分析蛋白质水平。显示了经ACTB归一化的总LC3B（LC3B-I加LC3B-II）的代表性图像和量化。（B） HeLa细胞转染对照组（pControl）或BAG3型（第页BAG3型)质粒。在24小时时分离总RNA。LC3B公司-相关家族mRNA通过RT-qPCR定量。数据表示为相对于pControl的变化倍数，并对应于至少3个独立实验的平均值±SEM。使用方差分析和/或Student计算统计学显著性t吨测试*，P（P）<0.05与。各自控制；^#,P（P）<0.05与。放线菌素D分别对照；ns：与pControl相比无显著性差异。

BAG3控制LC3B公司信使核糖核酸

然后，我们调查了BAG3是否控制LC3B公司mRNA翻译。据我们所知，没有报告描述LC3B公司在基础或压力条件下进行翻译。环己酰亚胺处理阻止了BAG3型过度表达。当BAF存在时，观察到同样的效果(图4A). 作为环己酰亚胺使用的对照，我们测试了环己酰酮治疗是否有效降低了TP53/p53（肿瘤蛋白p53）（一种短半衰期蛋白）的水平（图S6A）；以及使用Click化学和蛋氨酸炔类似物L-高丙炔甘氨酸（HPG）的总蛋白翻译水平（图S6B）。亚砷酸钠增加了翻译机制被隔离的应激颗粒的数量，也用于抑制mRNA翻译。²⁶与环己酰亚胺一样，亚砷酸钠处理阻止了由BAG3型过度表达(图4B). 正如预期的那样，亚砷酸钠增加了使用G3BP1抗体（GTPase-activating protein[SH3 domain]binding protein 1）检测到的应激颗粒数量（图S6C）。尽管已经描述过环己酰亚胺和亚砷酸钠可以诱导细胞死亡，但在我们的条件下，没有任何治疗增加坏死（图S6D）或凋亡（图S6E）。确认BAG3对LC3B公司翻译，我们评估了LC3B公司mRNA。脉搏[³⁵S] 用蛋氨酸/半胱氨酸标记新合成的蛋白质，然后免疫沉淀LC3B。BAG3型敲除降低了新合成的LC3B-I蛋白(图4C). 综上所述，我们的结果表明BAG3控制了LC3B公司mRNA翻译。

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图4。

BAG3对LC3B公司翻译。HeLa细胞转染对照组（pControl）或BAG3型（p）BAG3型)质粒。蛋白质水平用western blot分析。经ACTB归一化的总LC3B（LC3B-I加LC3B-II）的代表性图像和量化显示为（A）在最后6 h和5 h内分别添加了环己酰亚胺（10µg/mL）和BAF（10 nM）。（B） 在最后6 h和5 h内分别添加亚砷酸钠（0.2 mM）和BAF（10 nM）。（C） HeLa细胞转染对照（siControl）或BAG3型（siBAG3型)siRNA，然后保持在无蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中。A类[³⁵S] 加入蛋氨酸/半胱氨酸脉冲30min，从细胞裂解液中免疫沉淀LC3B。显示了LC3B免疫沉淀的放射自显影和western blot的典型图像。数据表示为至少3个独立实验的平均值±SEM。使用ANOVA检验计算统计显著性。*，P（P）<0.05与。p控制。

siRNAs和质粒的转染

对于瞬态BAG3型敲除后，根据制造商的说明，使用100 nM以下siRNA在Optimem培养基（ThermoFisher Scientific，31985–088）中转染细胞，其中含有寡效胺（Thermo Fisher科学，12252–011）：BAG3型1:5′-CUGAUGAUGCGAGAGUAUU[dT][dT]-3′；硅BAG3型2:5′-GCAAAGAGGGGUGGAUUCUAA[dT][dT]-3′。转染后48小时评估蛋白质水平。诱发瞬态BAG3型过度表达，根据制造商的说明，在含有Lipofectamine 2000（ThermoFisher Scientific，11668–019）的Optimem培养基中转染细胞，使用1µg/mL以下质粒：pBAG3型，ppxxp-袋子和p袋子Δ. 转染后24小时或48小时评估蛋白质水平。

稳定击倒细胞的产生

根据制造商的说明，使用以下质粒在Optimem培养基中用Lipofectamine 2000转染HEK293T细胞：pMD2VSV。G、 pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pLKO.1 shRNABAG3型（第页BAG3型1：5′GAAGGCAAGAAGACTGACAA-3′；第页BAG3型2:5′CCTGGACACATCCCAATTCAAT-3′）。48小时后，收集含有慢病毒颗粒的条件培养基，用0.45μm孔径过滤器过滤，并添加到HeLa细胞中。病毒转导48小时后，HeLa细胞BAG3型在含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基中选择（Gibco，Life Technologies，A11138-02）。

蛋白质印迹

用蛋白酶（Roche Diagnostics，04693132001）在裂解缓冲液（100 mM Tris，300 mM NaCl，1%NP40[AMRESCO，J619]，pH 8.0）中裂解细胞。和磷酸酶（罗氏诊断，04906845001）抑制剂。使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质（20µg），并转移到硝化纤维素膜上。用以下抗体检测印迹：抗BAG3（Abcam，47124）、抗LC3B（Cell Signaling Technology，2775）、抗ATG12（Cell信号技术，2010）、抗ATM7（Cell信令技术，8558）和抗ATG3（Cell信令技术，3415）、抗-ATG4B（Sigma-Aldrich，A2981）、抗ACTB，抗UBB（圣克鲁斯生物技术，sc-8017）、抗TP53（圣克鲁兹生物技术，sc-98）、抗MTOR（细胞信号技术，2983）、抗磷酸化-MTOR（细胞信号传递技术，2971）、抗AMPK（细胞信号发送技术，2532）和抗磷酸化-AMPK（细胞信号传输技术，2535）。

免疫荧光分析

细胞固定在多聚甲醛（4%w/v）中，在Triton X-100中渗透（0.01%w/v；Merck Millipore，108643），并在BSA中封闭（5%w/v，Winkler LTDA，BM-0150）。然后用一级抗体在4°C下培养过夜，并用Alexa Fluor抗体（分子探针，生命技术，A-31558和A-21048）进行检测。共焦显微镜使用配备63X物镜的LSM 5显微镜（德国耶拿蔡司）进行。

RNA分离和实时PCR

使用试剂盒（Macherey–Nagel GmbH&Co，740955.10）从细胞中提取总RNA。使用RNA合成cDNA，并使用Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix（Agilent Technologies，600828）在iCycler PCR Thermocycler（德国慕尼黑Bio-Rad）上进行RT-qPCR。SYBR绿色实时PCR的人类自噬引物库模板包含88个针对自噬基因的引物集和8个看家基因引物集，用于分析自噬相关基因表达（Biomol Gmbh，HATPL-I）的序列，这些序列尚未上市。使用Biorad iQ5软件（Bio-Rad）实时测量DNA产物的扩增。

LC3的标签[³⁵S] -蛋氨酸/半胱氨酸

细胞在5 mL无蛋氨酸和半胱氨酸培养基中培养60 min（补充25 mM HEPES、pH 7.4、1 mM丙酮酸、2 mM谷氨酰胺和10%胎牛血清）。250μCi的[³⁵S] 添加蛋氨酸/半胱氨酸（PerkinElmer Inc.，NEG772），培养细胞30分钟。将细胞溶解，并用20µL琼脂糖蛋白g（Santa Cruz Biotechnology，sc-500778）和2µg抗LC3B（德克萨斯大学西南医学中心J.A.Hill博士慷慨捐赠）培养400µg细胞。将免疫沉淀物在12%SDS-PAGE凝胶中分离，并转移到硝酸纤维素膜上。在−80°C下，将膜暴露于CLXposure膜（ThermoFisher Scientific，34089）至少24小时。

线粒体定量

用200 nM MitoTracker Green（ThermoFisher Scientific，M-7514）标记HeLa细胞线粒体30分钟。清洗后，使用FACScan系统（美国新泽西州Becton Dickinson）通过流式细胞仪对细胞进行分析。线粒体追踪绿色荧光强度被用作线粒体数量的标记。