局部TRPA1通道Ca²⁺活性氧刺激信号促进脑动脉扩张

活性氧刺激脑动脉内皮细胞TRPA1火花活性

我们通过TIRF显微镜记录亚细胞钙，研究了大脑动脉内皮细胞TRPA1活性对活性氧的反应²⁺代表Ca的信号²⁺通过单个TRPA1通道流入，我们称之为TRPA1火花。为了初步表征TRPA1火花，我们处理了负载Ca的原发性脑动脉内皮细胞²⁺指示染料Fluo-4 AM和TRPA1激动剂AITC。在基础条件下观察到的事件很少，但AITC诱导了火花频率的浓度依赖性增加(图2，A和B、和电影S1). 半最大有效浓度（EC₅₀)火花活化为4.4μM(图2B)，与之前报告的EC类似₅₀用于AITC诱导的脑动脉扩张（EC₅₀，16.4微米）(11). AITC刺激的火花频率的增加不受细胞内储存环丙磺酸消耗的影响(图S5A)但当细胞在钙中浸泡时却不存在²⁺-自由溶液(图S5B)表明这些信号是由钙内流产生的²⁺选择性TRPA1拮抗剂HC-030031(22)阻止AITC诱导的火花频率增加(图2C)证实了亚细胞钙²⁺AITC激活的流入事件是真正的TRPA1火花。单侧分析表明，添加AITC后，TRPA1活性火花位点总数从1.4±0.7个增加到6.1±1.8个(图2D)，表明AITC招募了先前不活跃的TRPA1通道，并且没有增加基底活性位点的频率。此外，这些数据表明，在最大刺激期间，每个细胞只有大约四到八个TRPA1火花点处于活动状态。

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图2

活性氧刺激脑动脉内皮细胞中的TRPA1火花

(A类)脑动脉内皮细胞记录的AITC诱导的TRPA1火花的时间推移图像；比例尺，8μm。(B类)AITC诱导脑动脉内皮细胞TRPA1火花频率的浓度依赖性增加(n个=每浓度5至52个细胞，4个独立细胞隔离）。(C)总结数据显示HC-030031抑制AITC诱导的大脑动脉内皮细胞TRPA1火花频率的增加(n个=10至24个电池，3个独立的电池隔离）*P（P）与基线对照组相比≤0.05。(天)AITC给药前后每个细胞的活性TRPA1火花位点(n个=10个细胞，5只大鼠）。(E类)TRPA1火花的振幅（左）、持续时间（中）和空间扩散（右）直方图(n个=762个总事件，43个独立实验）。(F类)荧光变化的代表性记录(F类/F类₀)在AITC刺激的原发性脑动脉内皮细胞的ROI内。虚线表示一个、两个或三个TRPA1通道的打开。(G公司)NADPH刺激的TRPA1火花的时间图像；比例尺，8μm。(H（H）)NOX底物NADPH诱导TRPA1火花频率的浓度依赖性增加(n个=每浓度9至22个细胞，4个独立细胞隔离）。(我)总结数据表明HC-030031抑制NADPH诱导的TRPA1火花频率增加(n个=每组12至28个细胞，3个独立细胞隔离）*P（P）与基线、对照组相比≤0.05。

我们比较了从大脑动脉内皮细胞和转染TRPA1-GFP（绿色荧光蛋白）融合蛋白的人胚胎肾（HEK）293细胞中记录的TRPA1火花。AITC导致转染HEK细胞中TRPA1火花频率增加，TRPA1阻滞剂HC-030031抑制了该频率，而未转染的HEK细胞不存在该频率(图S6、A和B). 从TRPA1-GFP转染的HEK细胞中记录的TRPA1火花的模式持续时间、发作时间、衰减时间和空间扩散与从脑动脉内皮细胞中记录到的基本相同(表S1). 持续时间直方图表明，最常见的TRPA1火花持续时间小于200 ms，并且符合内皮细胞的单指数函数（τ=408 ms；图2E)转染HEK细胞（τ=210 ms；图S6C). 内皮细胞和HEK细胞记录的TRPA1火花的空间扩散分布也相似，大多数事件的面积小于1μm²(图2E和图S6C).

转染HEK细胞记录的TRPA1火花振幅直方图的多重高斯拟合(图S6C)显示了三个不同的峰值F类/F类₀=1.13、1.26和1.39。这些数据表明，单一TRPA1火花振幅为ΔF类/F类₀=0.13，峰值代表一个、两个或三个单独TRPA1通道的打开，其中出现频率最高的是TRPA1火花(F类/F类₀=1.13）表示打开单个TRPA1通道。在内皮细胞中获得了相同的结果(F类/F类₀=1.13，1.26，1.39），与统一的TRPA1火花振幅Δ一致F类/F类₀在这些自然细胞中=0.13(图2E). 从感兴趣区域（ROI）的荧光强度随时间变化的曲线图中也可以明显看出这一点，其中有三个不同的振幅(图2F和图S6D). 与HEK细胞中的TRPA1火花不同，内皮细胞中记录到的最常见TRPA1闪光的振幅为F类/F类₀= 1.26 (ΔF类/F类₀=0.26），表明在同一活性位点同时打开两个TRPA1通道的频率远高于预期。这些数据表明，与在HEK细胞中表达的克隆TRPA1通道相比，脑动脉内皮细胞中的天然TRPA1渠道表现出更频繁的二元耦合门控。

NOX2和TRPA1的Colocalization(图1H)脑动脉内皮支持NOX-衍生ROS可以调节该组织中TRPA1通道活性的概念。为了验证这个假设，服用NADPH刺激NOX活性(23). 我们发现NOX活性增强以浓度依赖的方式增加了大脑动脉TRPA1火花频率(图2、G和H)TRPA1阻滞剂HC-030031消除了这种反应(图2I). 这些发现表明，NOX衍生的ROS刺激脑动脉内皮细胞中的TRPA1闪光活性，表明TRPA1是该组织中的ROS传感器。

NOX通过激活TRPA1扩张脑动脉产生的ROS

使用加压至生理值（80 mmHg）的完整脑动脉研究ROS诱导的TRPA1火花频率增加对血管直径的影响，以形成自发肌源性张力。我们的数据表明，添加NADPH以增加NOX产生的ROS导致浓度依赖性血管舒张(图3，A和B). 该反应被TRPA1阻滞剂HC-030031废除(图3，A和C)表明NOX-衍生的活性氧通过增加TRPA1火花的频率导致脑动脉扩张。

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图3

NOX通过激活TRPA1扩张脑动脉产生的ROS

(A类)完整受压大脑动脉管腔直径随时间变化的代表性记录。将NADPH引入沐浴液中可诱导血管舒张，而TRPA1阻滞剂HC-030031几乎消除了这种舒张作用。(B类)NADPH诱导的血管舒张依赖于浓度(n个=每种浓度3个血管，3只大鼠）。(C)总结数据表明HC-030031减弱了NADPH诱导的舒张(n个=5条血管，3只大鼠）*P（P）与对照组相比≤0.05。(天和E类)代表性记录（D）和总结数据（E）表明NO合酶抑制剂L-NNA和环氧合酶抑制剂吲哚美辛不影响NADPH诱导的血管舒张(n个=3条血管，3只大鼠）。(F类和G公司)代表性记录（F）和总结数据（G）表明，当IK通道阻滞剂TRAM34存在于管腔中时，NADPH诱导的血管舒张（左）受到抑制（右）(n个=5条血管，3只大鼠）*P（P）与对照组相比≤0.05。(H（H）)平滑肌细胞膜电位的代表性记录(E类_米)在受压的大脑动脉中。光滑的肌肉细胞被NADPH超极化。HC-030031阻断了NADPH诱导的超极化。(我)摘要数据(n个=4条血管，4只大鼠）*P（P）与车辆、控制相比≤0.05#P（P）与车辆NADPH相比≤0.05。

内皮细胞促进动脉扩张的一种机制是通过释放一氧化氮（NO）或前列环素（PGI）等扩散物质₂). 我们发现，阻断NO和PGI不会改变NADPH诱导的脑动脉扩张₂用L合成-N个^G公司-硝基精氨酸（L-NNA）和吲哚美辛(图3、D和E)表明这些途径与反应无关。内皮细胞通过肌内皮缝隙连接直接向血管平滑肌细胞传递内皮细胞膜超极化，从而导致内皮细胞扩张。小电导和中间电导Ca²⁺-激活的K⁺（IK）通道与这种内皮依赖性血管舒张有关，功能性IK通道存在于肌内皮连接处的脑动脉内皮细胞中(11,24). 我们的数据显示，选择性IK通道阻断剂TRAM34的腔内给药几乎消除了NADPH诱导的血管舒张(图3、F和G)提示TRPA1火花通过内皮细胞的IK通道作用于扩张脑动脉。

为了确定TRPA1火花活性的增加是否与平滑肌细胞超极化有关，我们使用细胞内微电极记录了来自完整加压（80 mmHg）脑动脉的动脉肌细胞膜电位。我们发现，NADPH刺激ROS生成使平滑肌细胞膜超极化约-8 mV(图3、H和I). HC-030031阻断TRPA1通道可消除NADPH诱导的膜电位超极化(图3、H和I)证明NOX衍生的ROS通过激活TRPA1使受压脑动脉中的平滑肌细胞超极化。脑动脉平滑肌细胞中不存在TRPA1通道(图1C) (11,25)表明这种反应是由内皮细胞介导的。总之，我们的发现表明Ca²⁺通过内皮中TRPA1通道的内流激活附近的IK通道以启动K⁺流出。随后内皮细胞质膜的超极化作用被传导到下面的平滑肌，使该组织超极化并松弛，从而导致动脉扩张。

ROS衍生的脂质过氧化代谢产物刺激TRPA1火花并扩张脑动脉

NOX衍生的ROS可直接或通过产生脂质过氧化产物刺激内皮细胞TRPA1活性(图4A). 我们发现，NOX抑制剂apocynin减弱了NADPH诱导的TRPA1火花频率增加(图4B)并抑制血管舒张反应NADPH(图4C). 这些发现得到了实验的支持，实验表明，NOX2抑制肽gp91ds-tat减弱了NADPH诱导的TRPA1火花频率增加和NADPH诱发的舒张(26)但不是通过扰乱的对照肽（scr.gp91ds-tat）(图4、B和D). 这些数据证实NADPH通过NOX亚型（可能是NOX2）增加ROS的生成，导致TRPA1火花频率增加和血管舒张。

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图4

ROS衍生的脂质过氧化代谢产物刺激TRPA1火花并扩张脑动脉

(A类)NOX生成的ROS代谢物激活TRPA1的拟议途径和药理干预。(B类)基线时NADPH诱导内皮细胞TRPA1火花频率增加(n个=每组27至60个细胞，5个独立的细胞分离）通过用罗布青素抑制NOX而减弱(n个=每组8至10个细胞，3个独立细胞隔离）和gp91ds-tat(n个=7至9个细胞/组，3个独立的细胞分离），分别与载体和一个干扰肽（scr.gp91ds-tat）相比；H（H）₂O（运行）₂细胞外过氧化氢酶降解(n个=每组9至11个细胞，3个独立细胞隔离）；铁与去铁胺的螯合作用(n个=每组8至12个细胞，3个独立细胞隔离）*P（P）与基线、对照组相比≤0.05。(C到F类)表明罗布青素抑制NADPH诱导的血管舒张作用的代表性痕迹和总结数据(n个=5条血管，3只大鼠）（C），gp91ds-tat(n个=5只血管，3只大鼠）（D），过氧化氢酶(n个=5条血管，3只大鼠）（E）和去铁胺(n个=5条血管，3只大鼠）（F）*P（P）与车辆控制或scr相比≤0.05。gp91ds-标签。

当NOX出现在质膜上时，会产生O₂⁻细胞外空间迅速分解为H₂O（运行）₂通过自发或超氧化物歧化酶催化反应(图4A). 我们调查了H₂O（运行）₂NOX下游通过使用过氧化氢酶参与TRPA1的激活，过氧化氢酶是一种膜不透性酶，可快速降解H₂O（运行）₂过氧化氢酶阻止NADPH诱导的TRPA1火花频率增加(图4B)表明H的胞外生成₂O（运行）₂此响应需要。过氧化氢酶使完整脑动脉收缩时给予NADPH(图4E)，表示H₂O（运行）₂是血管舒张反应所必需的。我们的数据表明，内皮细胞TRPA1火花活性的增加和大脑动脉对NOX产生的ROS的反应性扩张需要细胞外H的生成₂O（运行）₂.

在存在铁（Fe）的情况下²⁺)，H₂O（运行）₂通过芬顿反应降解为OH。OH•高度不稳定，并与质膜中的多不饱和脂肪酸快速反应，产生脂质过氧化产物，如4-HNE。区分H的直接影响₂O（运行）₂在TRPA1活性和OH•产生的副产物方面，我们将铁与去铁胺螯合，以抑制Fenton反应，减少OH•的形成和脂质过氧化(15). 去甲氧胺阻断NADPH诱导的TRPA1火花频率增加(图4B)和减弱NADPH诱导的完整脑动脉扩张(图4F)表明产生OH•和脂质过氧化反应是NOX诱导的TRPA1火花活性增加和脑动脉扩张所必需的。

这些发现与以下可能性一致：由多不饱和脂肪酸（如4-HNE）的ROS依赖性过氧化反应生成的化合物和相关化合物可能作为脑动脉中TRPA1通道的内源性激动剂。这些物质与半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸残基反应，形成稳定的蛋白质加合物，被特定抗体识别(27). 为了确定是否存在脂质过氧化代谢产物，我们用一种与4-HNE修饰蛋白结合的抗体探测了面部完整的脑动脉。这些实验表明，大脑动脉内皮细胞中富含4-HNE修饰蛋白(图5A)免疫标记存在于核周区域和IEL窗内(图5A，箭头，插图），其中还存在NOX2、NOX4和TRPA1通道。共免疫沉淀实验显示脑动脉中TRPA1和4-HNE的相关性(图S4B).

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图5

脂质过氧化产物激活内皮细胞中的TRPA1火花并扩张脑动脉

(A类)大脑动脉安装在面部，免疫标记4-HNE修饰蛋白（红色，顶部）。4-HNE标记存在于核周区域和IEL开窗内（箭头，插图；比例尺，5μm）。在缺乏一级抗体的情况下未检测到免疫标记（底部）；比例尺，10μm。内皮细胞核用DAPI（蓝色）染色，IEL的自体荧光为绿色(n个=3只大鼠）。(B类)4-HNE诱导的TRPA1火花的时间推移图像；比例尺，8μm。(C)4-HNE诱导的TRPA1火花频率增加与浓度有关(n个=每浓度9至11个细胞，3只大鼠）。(天)TRPA1阻滞剂HC-030031消除了4-HNE诱导的TRPA1火花频率增加(n个=19至31个细胞，4只大鼠）*P（P）与基线、对照组相比≤0.05。(E类)4-HNE诱导加压脑动脉血管舒张的典型记录。HC-030031（右）抑制了4-HNE诱导的扩张（左）。(F类)4-HNE诱导脑动脉扩张的浓度响应曲线(n个=每组3至5条血管，5只大鼠）。(G公司)总结数据表明HC-030031消除了4-HNE诱导的扩张(n个=5条血管，4只大鼠）*P（P）与对照组相比≤0.05。

为了验证我们的假设，即脂质过氧化物代谢产物激活内皮细胞中的TRPA1通道，我们检查了内源性给药这些物质对TRPA1火花活动和大脑动脉直径的影响。我们的研究结果表明，外源性给予4-HNE可诱导脑动脉内皮细胞TRPA1闪光频率的浓度依赖性增加（EC₅₀64.8±50.4毫微米）(图5C)被TRPA1抑制剂HC-030031阻断(图5D). 4-HNE公司(图5E)也扩张了完整的大脑动脉。4-HNE诱导的血管舒张是浓度依赖性的，并被HC-030031阻断(图5、F和G). 4-HNE以比引起血管舒张所需浓度低得多的浓度刺激TRPA1火花活性，可能是因为该化合物与隔离血管制剂中的其他细胞反应，降低了内皮的可用性。我们的研究结果表明，脂质过氧化产物4-HNE可以刺激内皮细胞中的TRPA1火花并扩张脑动脉。

的生成eTRPA1公司^−/−老鼠

eTRPA1公司^−/−小鼠是通过杂交小鼠纯合子产生的，以构建loxP侧翼TRPA1 S5/S6跨膜结构域（“floxed TRPA1”；Jackson实验室，008650B.129-TRPA1^{tm2千千瓦>/J})和小鼠半合子Cre重组酶在受体酪氨酸激酶的控制下德（Tie2）启动子/增强子[The Jackson Laboratory，B6.Cg-Tg（Tek-cre）1^Ywa/J公司].德赋予一致性Cre公司在发育和成年期间只在内皮细胞表达。F1子代阳性Cre公司与纯合子漂浮的TRPA1小鼠交配。利用耳部或尾部活检获得的基因组DNA，通过PCR对F2子代进行基因分型，对那些阳性的Cre公司用纯合子分离的TRPA1小鼠与纯合分离的TRPA小鼠杂交。eTRPA1公司^−/−小鼠是有活力和生育能力的。对照组小鼠的TRPA1纯合子为floxed TRPA1，但阴性Cre公司.

RNA分离和RT-PCR

对于大鼠样品，从左冠状动脉主干和间隔动脉、肾叶间动脉、脑动脉、小脑动脉和一至四级肠系膜动脉中提取并纯化总RNA。对于人类样本，总RNA是从人脑动脉或分离的平滑肌细胞中分离出来的，以及从新生儿真皮和人脑微血管内皮细胞中分离出的原代人微血管内皮内皮细胞；人肾小球内皮细胞（4005）和人心脏微血管内皮细胞（6005）的总RNA来自ScienceCell研究实验室。合成第一链cDNA，并使用大鼠特异性引物集进行PCRTRPA1号机组，老鼠电子NOS，人类TRPA1号机组，或人类电子NOS.PCR始终包括无模板阴性对照。卡尔加里大学机构审查委员会批准使用人体组织和细胞。

免疫组织化学

如前所述，对面部准备中的动脉进行免疫组织化学(11). 简单地说，分离动脉，清除结缔组织，并纵向切开。用4%甲醛固定组织，然后用含有1%Triton X-100和2%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液进行渗透和封闭。动脉在4°C下与一级抗体孵育过夜，然后在室温下清洗并与德克萨斯红结合二级抗体孵育2小时。用UltraCruz固定培养基（Santa Cruz Biotechnology，sc-24941）清洗组织并将其固定在载玻片上，该培养基含有DAPI核染色剂。使用FluoView 1000激光扫描共焦显微镜（Olympus）获得荧光图像。

人类TRPA1的蛋白质印迹

在获得田纳西大学健康与科学中心审查委员会的批准并收到书面知情同意书后，根据赫尔辛基宣言的指南获取了人脑样本。颞叶样本取自一名接受肺叶切除术且无高血压或中风病史的青春期男性。立即将脑组织放入冷冻的Dulbecco改良Eagle培养基中进行运输。在手术后1至2小时内，从样本中解剖出人类大脑动脉，并将其置于冰镇生理盐水溶液（PSS）中。然后将动脉转移到冷冻的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中进行溶解，然后添加SDS，将样品在沸水浴中加热3分钟。蛋白质估算后，将样品置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，转移到硝酸纤维素膜上，用5%牛奶封闭，用抗TRPA1抗体孵育过夜。切割同一印迹的下半部分，并独立探测肌动蛋白。用三缓冲盐水–吐温20缓冲液清洗膜，并与二级抗体孵育1小时。使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）对蛋白质进行可视化。

小鼠TRPA1的蛋白质印迹

分离每只小鼠的大脑和小脑动脉，并将其在液氮中冷冻。将50微升含有蛋白酶抑制剂混合物（Calbiochem）的RIPA裂解缓冲液（Pierce）添加到每个动脉样品中，并通过超声波（20×2–s脉冲）和Fisher Scientific Tissuemiser（10 s）在冰上机械破碎使其均质。然后以13000 rpm离心样品10 min，将上清液转移到新试管中。使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定法（Pierce）测定每个样品的蛋白质浓度。将每种蛋白质样品的10纳克添加到SDS样品缓冲液中，并在70°C下加热10分钟。变性后，立即通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后转移到硝化纤维素膜上。室温下，在摇杆上用含0.1%吐温和0.02%叠氮化钠（PBS-TA）的PBS中的5%牛奶、1%BSA封闭膜30分钟，然后在室温下将5%牛奶中的兔抗TRPA1抗体（1:500，Alomone Labs）暴露于摇杆上的1%BSA（PBS-TA）过夜。然后用PBS-T清洗膜3×5 min，并在摇杆上室温下将其暴露于5%牛奶、1%BSA（PBS-T）中的山羊抗兔辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:10000；Invitrogen）中2小时。然后用PBS-T清洗膜5×5 min，在SuperSignal ECL底物（Pierce）中培养1至3 min，并成像。使用ImageJ软件定量蛋白质含量。

协同免疫沉淀

将每只小鼠的大脑和小脑动脉在液氮中快速冷冻。将50微升含有蛋白酶抑制剂混合物（Calbiochem）的IP裂解缓冲液（Pierce）添加到每个动脉样品中，并在冰上使用Fisher Scientific Tissuemicer（10s）匀浆。然后以13000 rpm离心样品10 min，将上清液转移到新试管中。使用BCA蛋白质分析（Pierce）测定每个样品的蛋白质浓度。根据制造商的方案，使用Dynabeads蛋白G免疫沉淀试剂盒（Invitrogen）进行协同免疫沉淀。将50微升Dynabeads添加到试管中，并放置在DynaMag-2磁铁上，以将珠子从溶液中分离出来。去除溶液，将含有2μg兔抗TRPA1抗体（Alomone Labs）或山羊抗NOX2抗体（Santa Cruz Biotechnology）的200μl抗体结合和洗涤缓冲液添加到珠子中。试管在室温下在摇杆上孵育，使抗体结合珠子10分钟。然后将试管置于磁铁上，将珠子抗体复合物与溶液和未结合抗体分离。然后用200μl抗体结合和洗涤缓冲液洗涤珠抗体复合物，并再次从上清液中分离。将10微克蛋白质稀释在100μl免疫沉淀缓冲液中，添加到含有珠抗体复合物的试管中，并在室温下摇杆上培养10分钟。然后将试管放在磁铁上，将上清液转移到干净的试管中供以后使用。然后用200μl洗涤缓冲液将珠状抗体-抗原复合物洗涤三次，再悬浮在100μl洗涤缓冲器中，转移到新的试管中，并放置在磁铁上以去除上清液。将珠状抗体-抗原复合物重新悬浮在20μl洗脱缓冲液、7.5μl 4×SDS样品缓冲液和2.5μl双蒸馏水（ddH）中₂O） ●●●●。将上清液和10μg输入蛋白样品稀释在7.5μl 4×SDS样品缓冲液和ddH中₂O至总体积30μl。将所有三个样品（下拉、上清液和输入）在70°C下加热10分钟。立即将样品用于SDS-PAGE和Western blotting，使用与上述类似的方法，使用抗TRPA1抗体（1:500，Alomone Labs）或抗-4-HNE抗体（1:1000，Abcam）。

脑动脉内皮细胞分离

基底动脉被切成三段。然后将每个节段固定在Silgard块上，纵向切开，将内膜侧向下放置在涂有Matrigel（含1滴补充培养基）的35-mm微孔MatTek培养皿上。组织在37°C、6%CO下培养₂持续4到5小时以允许粘附，然后添加额外的培养基。培养基每2至3天更换一次。1周后，从培养物中取出组织，并允许迁移的内皮细胞增殖。内皮细胞通过其典型的鹅卵石样外观进行鉴定。采用RT-PCR和免疫细胞化学方法确认电子NOS和TRPA1号机组mRNA在分离细胞中的表达。

TRPA1火花录制和分析

TIRF显微镜基本上如前所述(17). 简单地说，TIRFM记录（3-ms曝光时间）是使用一个贯通式TIRF系统采集的，该系统是围绕一个倒置的奥林巴斯IX-70显微镜构建的，该显微镜配备有一个奥林巴斯PlanApo 60×油浸透镜（数字孔径，1.45）和一个Andor iXon电荷耦合设备相机。将生理性Hepes缓冲溶液中的细胞在37°C、6%CO下加载Fluo-4 AM 20分钟₂在黑暗中想象。所有实验均在室温（22°至25°C）下进行。将内皮细胞与含有AITC（30μM）、NADPH（10μM），HC-030031（10μM），apocynin（30μM）、gp91ds-tat（1μM）和scr的Hepes-buffered溶液混合。gp91ds-tat（1μM）、过氧化氢酶（500 U/ml）、去铁胺（100μM）或4-HNE（300 nM）。每次录制1500帧，长度约为30至60秒。

TIRF图像数据使用自定义算法进行处理，该算法作为ImageJ软件的插件（LC_Pro）实现，基本上如前所述(17). 位置(x个,年)然后计算每个事件的振幅、持续时间、攻击时间、衰减时间和空间扩散。荧光计算为ΔF类，峰值荧光之间的差异(F类)以及每个ROI内的局部最小荧光。持续时间定义为50%最大荧光峰值的时间间隔。攻击和衰减时间由50%峰到峰荧光（攻击）或从峰值荧光到50%峰（衰减）的时间间隔确定。空间扩散计算为事件荧光峰值95%时最大最佳拟合椭圆的面积。

隔离容器实验

如前所述进行隔离血管实验(11). 简单地说，在转移到血管室（生活系统）后，用玻璃微移液管对动脉段进行插管，用单丝线固定，用PSS加压至20 mmHg，并用加热（37°C）的充气PSS过度灌注，使其平衡15分钟。使用视频显微镜和边缘检测软件（IonOptix）连续监测内径。通过将加压动脉（20 mmHg）暴露于含60 mM KCl的等张PSS，评估组织的活性。让动脉再平衡15分钟，然后加压至80 mmHg（大鼠）或60 mmHg，使其形成稳定的肌张力。NADPH（10μM）、HC-030031（10μM）、LNNA（300μM。记录gp91ds-tat（1μM）、过氧化氢酶（750 U/ml）、去铁胺（100μM）或4-HNE（10μM）。被动直径是通过过度灌注钙的血管测定的²⁺-游离PSS（不添加Ca²⁺，3 mM EGTA）。肌源性张力百分比计算为80 mmHg时主动和被动直径之差除以被动直径再乘以100。扩张百分比计算为基线检查和治疗之间肌源性张力的变化。

邻近连接分析

使用原位PLA检测试剂盒（Duolink，Olink Biosciences Inc.）研究了TRPA1与NOX2或NOX4在大鼠原代脑动脉内皮细胞或完整的面部大鼠脑动脉中的定殖作用(21)，基本上如前所述(38). 细胞和血管分别在室温下用4%甲醛固定10或20分钟，然后在4°C下固定2小时。用PBS清洗后，分别用冷甲醇（−80°C）或1%Triton X-100渗透细胞或血管，并在含有初级抗体的2%BSA封闭溶液中培养过夜。与一级抗体孵育后，在封闭溶液中清洗细胞或血管，然后用5 ml Duolink原位清洗缓冲液A进行三次10分钟的清洗。用二级抗兔PLUS和抗羊MINUS PLA探针在37°C的加湿室中培养细胞和血管1小时，然后清洗三次（每次5分钟）室温下，在5 ml洗涤缓冲液A中。样品在37°C的结扎连接酶溶液中在加湿室中培养30分钟，然后在室温下用5 ml洗涤缓冲液a洗涤三次（每次2分钟）。最后，将样品在37°C的扩增聚合酶溶液中在加湿室中培养100分钟，然后在5 ml Duolink原位清洗缓冲液B中清洗两次（每次2分钟）。将细胞在1%清洗缓冲液B中进一步清洗1分钟，并使用含有DAPI核染色的Duoliink原位安装培养基进行安装。使用旋转圆盘共焦显微镜（Andor）和100×油浸物镜获得荧光图像。只有当两个PLA探针接近时（<40 nm），才会产生阳性信号（亮红色斑点）。荧光点的激发在543nm处实现，胞浆的自荧光在488nm处被照亮。使用Volocity成像软件（v6.0，Perkin-Elmer Inc.）对图像进行分析。阴性对照实验通过省略初级抗体或PLA探针来进行；在这些条件下未检测到阳性信号。使用Volocity中的自动目标查找协议确定每个细胞的阳性点密度。

平滑肌细胞膜电位

如前所述，在隔离的加压脑动脉中进行平滑肌细胞膜电位记录(11). 简单地说，大脑动脉被隔离并加压至80 mmHg。用玻璃细胞内微电极将平滑肌细胞刺穿外膜（尖端电阻为100至200兆欧）。使用WPI Intra-767放大器记录膜电位(E类_米). 使用IonWizard软件记录放大器的模拟输出（采样频率，20 Hz）。验收标准E类_米记录为：（i）当微电极进入细胞时，电位突然负偏转；（ii）稳定膜电位至少1分钟；以及（iii）电极从细胞中缩回后，电位突然变化至～0 mV。评估NADPH（10μM）和HC-030031（10μM）对平滑肌膜电位的影响。

我们感谢D.Hill-Eubanks对手稿的批判性评论和编辑协助。

基金：这项工作得到了美国心脏协会博士后奖学金（授予M.D.L.）、美国心脏协会科学家发展奖（授予Y.F.11SDG7360050）、美国国家卫生研究院（授予S.E.HL091905、F31HL094145、HL067061、HL110347和HL094378）的支持，加拿大卫生研究所的运营拨款（发给D.G.W.）和蒙福特家庭基金会的蒙福特卓越奖（发给S.E.）。