染色质在真核细胞核内以非随机方式分布。具有不同功能的染色质结构域位于不同的亚区，转录沉默的异染色质通常存在于细胞核外围或靠近核仁处。有人建议，这些核小室建立一个特殊的微环境，以丰富沉默所需的因子，并向其招募异染色质，从而促进抑制状态的建立、繁殖和维持(2012年Taddei和Gasser). 在酵母和哺乳动物中进行的人工系留实验支持了这一观点，在这种实验中，转录活性位点被隔离到核外围时会受到抑制（有关综述，请参阅Towbin等人，2013年). 然而，导致受抑制染色质外周隔离的内源性机制仍不清楚。
在后生动物中，内核膜（INM）下面是与明确定义的染色体区域相互作用的核膜。这些膜相关结构域富含受抑制的染色质，其外围关联与组蛋白H3（H3K9）的Lys9甲基化有关，组蛋白H3K9Lys9是受抑制染色质的保守标记(Amendola和van Steensel 2014). 核纹层本身是一个中间丝网，由a型和B型层压板组成，与INM的整体蛋白相互作用。一些研究表明，层粘连蛋白影响异染色质的核周定位和抑制（有关综述，请参阅Towbin等人，2013年;Amendola和van Steensel 2014). 一个引人注目的例子是夜间活动动物的视杆感光细胞的倒置核结构。这些细胞既不表达层粘连蛋白A/C，也不表达层黏连蛋白B受体（LBR），这导致异染色质的中央定位，然而当LBR在外周表达时，这种倒置的结构可以完全恢复(Solovei等人，2013年). 然而，尽管存在保守的外周异染色质，单细胞生物完全缺乏层粘连蛋白。此外，除层粘连蛋白外的各种外周蛋白与受抑制的染色质相互作用，表明确实存在额外的栓系途径(Hirano等人，2012年;Poleshko等人，2013年;Towbin等人2013;Zuleger等人，2013年;Amendola和van Steensel 2014). 在层粘连相关蛋白（lamin-associated proteins，LAP）中，有几个含有LEM（LAP2–Emerin–MAN1）结构域，一个从酵母到人类都保守的40-氨基酸螺旋-延伸-螺旋（HEH）基序(Brachner和Foisner 2011). LEM结构域与后生动物特异性屏障-自整合因子（BAF）结合，BAF是序列依赖性DNA结合蛋白。有人提出，它们与LEM域蛋白的相互作用可能有助于基因阻遏(Margalit等人，2007年;Barton等人，2015年)但BAF蛋白是否与异染色质特异结合尚不清楚。据报道，LAP与组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）直接相互作用，并调节其向核外周的募集(Somech等人，2005年;Demmerle等人，2012年). 因此，LAP可能使用不同的机制，通过染色质栓系或抑制因子的招募，它们可以促进异染色质沉默。然而，后生动物中的大量INM蛋白及其潜在冗余(Brachner和Foisner 2011)这使得研究它们在基因阻遏中的功能需求变得具有挑战性。
在裂变酵母中葡萄裂殖酵母，只有三种与LAPs同源的INM蛋白存在：Lem2、Man1和Ima1(Mans等人，2004年). 而Ima1与Samp1（NET5）同源(Gudise等人，2011年;Zuleger等人，2013年)、Lem2和Man1属于LEM蛋白质的II组(Brachner和Foisner 2011年). 该组成员包含（1）与后生动物LEM结构域N端同源的HEH基序和（2）C端区域的DNA-结合翼螺旋MSC（MAN1–Src1 C端）结构域，由两个跨膜结构域分隔。这些高度保守的结构域投射到核质中，在那里它们可能与染色体调节因子相互作用。最近的一项研究表明，Lem2和Man1有助于核结构的完整性和裂变酵母中端粒的锚定(Gonzalez等人，2012年). 此外，Lem2的同源物与端粒区域相关酿酒酵母（Heh1/Src1）和秀丽隐杆线虫（LEM-2）(Grund等人，2008年;Ikegami等人，2010年)Heh1的缺失导致端粒的核周定位缺陷和芽殖酵母中沉默的rDNA位点(Mekhail等人，2008年;Chan等人，2011年). 然而，Lem2在异染色质沉默中的作用尚不明确。因此，尽管酵母既没有核纤层也没有BAF同源物，但LAPs的基本功能似乎是保守的S.pombe公司一个理想的模型来研究异染色质定位和沉默之间的关系，在一个不太复杂的系统。
S.pombe公司在着丝粒周围、端粒和无声交配型基因座具有大的核周异色结构域，跨度达40kb(垫子). 而三个着丝粒与垫子位于纺锤体极体（SPB）附近的位点和簇，相当于哺乳动物的中心体，端粒位于核膜的对面，这一方向称为Rabl构型。异染色质结构域由二甲基化的H3K9标记，该结构域由Clr4沉积，Clr4是S.pombe公司这种抑制性组蛋白修饰被HP1蛋白识别，作为招募其他沉默因子的平台，如SHREC，一种由类似Snf2的核小体重塑器和类似哺乳动物NuRD复合体的HDAC亚单位组成的抑制复合物(格雷瓦尔2010;Allshire和Ekwall 2015). HP1平台内这些因素的结合和分布受到复杂的监管。SHREC的招募通过HP1蛋白的磷酸化进行积极调节，磷酸化抵消JmjC蛋白Epe1的结合，Epe1是一种与组蛋白去甲基化酶类似的抗沉默因子(Shimada等人，2009年). 该途径与保守的泛素连接酶Cul4-Ddb1对Epe1的泛素依赖性降解平行抄送2从异染色质体内去除Epe1(Braun等人2011). 在裂变酵母中，RNAi机制也有助于异染色质的建立和维持(格雷瓦尔2010;Allshire和Ekwall 2015). siRNAs由内切酶Dicer（Dcr1）、含精氨酸复合物RITS（RNA-induced transcription silenting）和RNA-dependent RNA聚合酶复合物（RDRC）的异色重复转录物生成。重要的是，通过与假定的跨膜蛋白Dsh1的相互作用，Dcr1和RDRC在核膜上的组装对于RNAi介导的沉默至关重要(Kawakami等人，2012年).
在这里，我们表明核膜蛋白Lem2控制异染色质沉默和定位S.pombe公司Lem2调节所有异色区域的沉默，但其贡献部分被其他通路的冗余所掩盖。通过开发一种高灵敏度的SGA（合成遗传阵列）方法，该方法基于沉默报告子分析揭示冗余，我们确定了与Lem2协同沉默的多个因子，例如RNAi机制和着丝粒聚集因子Csi1。除了沉默之外，Lem2还与这些因素合作，以确保异染色质在核外周的正确定位。为了深入了解分子机制，我们分离了Lem2的结构域。我们发现Lem2的N末端部分包含保守的LEM结构域，它介导与着丝粒的结合及其正确定位。出乎意料的是，所有异色结构域的端粒定位和沉默都完全依赖于MSC结构域。我们进一步证明，Lem2的沉默与端粒SHREC的作用是上位性的，而它与JmjC蛋白Epe1的抗沉默功能相反。我们得出结论，Lem2在异染色质沉默中的主要作用是维持SHREC和Epe1之间的适当平衡。因此，我们的研究揭示并从功能上剖析了控制异染色质定位和Lem2沉默的主要途径S.pombe公司这揭示了对这些高度保守的LEM蛋白的新观点，并表明后生动物同源物也在异染色质沉默中发挥积极作用。
结果
INM蛋白Lem2介导沉默染色质的抑制
为了确定控制异染色质的新因子，我们对周着丝粒沉默缺陷的突变体进行了全基因组筛查。我们越过了S.pombe公司含有沉默报告菌株的单倍体缺失文库尿酸4+着丝粒1最内层重复区左侧的基因(imr1L:：ura4+) (A；Ekwall等人，1999年). 通过评估含有药物5-FOA（5′-氟代甲酸）的培养基上的生长情况，可以监测该沉默基因座的抑制状态，该药物通过以下基因产物转化为有毒代谢物：尿酸4+在具有干扰沉默的各种突变体中（将在其他地方描述），我们鉴定了Lem2（也称为Heh1），一种INM的LEM结构域蛋白。
Lem2对转录基因沉默有全局性作用。(A类)S.pombe公司异色结构域（橙色阴影），其插入位点为尿酸4+RT-qPCR和染色质免疫沉淀（ChIP）分析的报告子和引物位置（红色条）。(B类)沉默报告基因分析。五倍系列稀释野生型（WT）细胞和两个独立的敲除菌株(ko-1型和ko-2型)第页，共页柠檬2+; 这个氯丁橡胶4Δ应变作为阳性对照。（N/S）非选择性。(C类,E类)RT-qPCR分析。所示为标准化后相对于野生型的转录水平行为1+.tlh1型+和热释光时间2+分别位于第1和第2染色体的左臂和右臂，但具有100%的同源性。(D类)沉默报告者分析，如B类对于所有定量实验，数据表示为平均值±SEMn个独立实验；星号表示P（P）< 0.05 (*),P（P）< 0.01 (**),P（P）<0.001（***），以及P（P）<0.0001（****）来自双尾学生t吨-测试分析。
我们确认了柠檬2通过中断柠檬2+位于imr1L:：ura4+记者紧张。与缺乏唯一的H3K9甲基转移酶Clr4的细胞相比，缺乏Lem2会导致5-FOA存在时的中度生长缺陷(B） 这取决于报告基因的表达，并通过异位表达柠檬2+（补充图S1A、B）。的增长柠檬2Δ细胞在噻菌灵的存在下也会受损（补充图S1C），这与着丝粒周围异染色质的缺陷导致染色体不稳定和对这种微管稳定药物的超敏反应这一事实一致。RT-qPCR定量分析显示第2列Δ细胞报告基因表达增加两倍(C） ●●●●。研究还发现mat3:：ura4+报告者，内源性异色位点(森德格,第1页，共2页+)，着丝粒1的中央核心区(碳纳米管1)和亚砾岩长末端重复（LTR；高达100倍）(C类；补充图S1D）。相反，我们检测到各种常染色位点（包括管家基因和低表达基因）的表达没有变化（补充图S1E），这表明Lem2的抑制功能是沉默染色质特有的。
在酿酒酵母、Lem2和核膜蛋白Nur1形成一种称为CLIP的物理复合物，参与rDNA位点的核周定位(Mekhail等人，2008年). 我们删除了相应的S.pombe公司基因，杯子154+（此处我们称之为努尔1+)并研究了其对沉默的要求。独立努尔1Δ隔离物显示出细微但可再现的沉默缺陷（补充图S2A）。值得注意的是nur1Δlem2Δ双突变体表现出上位性表型，类似于单突变体的表型努尔1Δ（补充图S2A、B）。总之，这些发现表明Lem2和Nur1都参与异色沉默，并在同一途径中共同作用。
中中度沉默缺陷的一个可能原因柠檬2Δ细胞在异染色质形成中可能与其他因素部分冗余。据报道，两种INM蛋白Man1和Ima1在确保核膜完整性方面与Lem2具有重叠的功能(Hiraoka等人，2011年). 此外，Man1与亚砾岩区域相关(Steglich等人，2012年)这可能表明端粒沉默的作用。然而，与Lem2相反，我们发现Man1或Ima1的缺失并不影响异染色质的抑制(D、 E）。此外，我们没有检测到这些突变体与lem2Δ。相反，沉默在双突变体中部分恢复(E） 我们注意到lnp1型+，人类的同源物LUNAPARK公司这涉及到膜组织（补充图S2C）。基因组位点的重复lnp1型+已报告禁止柠檬2-相关表型（Y Hiraoka，pers.comm.），这可以解释这些双突变体沉默缺陷的部分抑制。总之，尽管Lem2、Man1和Ima1在其他途径中可能具有重叠作用(Hiraoka等人，2011年)，异色沉默仅由Lem2介导。
合成基因交互作用物的全基因组分离柠檬2+
为了测试Lem2在沉默中的作用是否被其他因素的冗余掩盖，我们通过SGA分析确定了全基因组的遗传相互作用。为了使这种方法对异染色质功能更加敏感和特异，我们提出了监测沉默缺陷而不是多效性表型的方法。为此，我们穿过了着丝粒周围imr1L:：ura4+删除的报告菌株柠檬2+单倍体缺失文库。然后，我们通过测定5-FOA和非选择性培养基上菌落大小的比率来测量双突变体中的沉默缺陷，并计算每个突变体对的遗传相互作用得分ε(A；补充图S3A）。为了区分特定于柠檬2+，我们检测了另外两个已知异染色质因子的突变体作为查询菌株：Clr2，阻遏物复合体SHREC的一个亚单位(Sugiyama等人，2007年)和磷酸化HP1蛋白的酪蛋白激酶II的催化亚单位Ckb1(Shimada等人，2009年). 此外，我们还包括努尔1+由于其上位功能柠檬2+这预示着与沉默相关的基因交互作用应该在这两个基因之间共享。
第2列+在转录沉默中与多种因素发生遗传相互作用。(A类)说明SGA方法的方案，以及随后的沉默报告者分析和遗传相互作用分数（ε值）的测定。有关更多信息，请参阅文本和补充图S3。(B类)筛选后选定的遗传互作数据（2918个中的211个）（另请参见补充图S3）。(顶部面板）遗传相互作用剖面的相关矩阵。(底部面板）通过层次聚类分析的交互作用得分（ε值）。（蓝色）负ε值（合成交互作用）；（黄色）正ε值（上位或抑制相互作用）。(C类)基因本体（GO）分析，用于单个集群中识别的基因的生物过程。(D类)不同查询菌株的平均复制品之间遗传相互作用得分的成对比较。灰色和黑色的符号分别表示所有（2918）和选定（211）的遗传相互作用。彩色符号显示了双突变体的遗传交互对，这些突变体丰富了GO术语，如C类. The插入图表位于顶部和在正确的每幅图的图显示了所有遗传交互作用的正态分布（2918），用红线将平均值划分为±1标准偏差（SD）。
从总共22个筛选和2918个突变体中，我们根据报告者分析的功能读数确定了约64000个遗传相互作用。我们应用了一个临界值来选择查询菌株的稳健遗传交互，结果产生了211个突变体(B类；补充图S3B）。相互作用剖面的相关系数分析表明柠檬2Δ与努尔1Δ (R（右）20.39），但不同于第2类Δ (R（右）2（共0.09页）(B[顶部]，D）。然后，我们对ε值进行了层次聚类，以确定具有相似遗传相互作用特征的群体(B、 底部）。两个簇（I和II）包含许多合成相互作用，这些相互作用在柠檬2Δ和努尔1Δ，但不在第2类Δ和ckb1号机组Δ. 这些簇因基因本体（GO）生物学过程术语“染色体组织”和“RNA代谢”而丰富(C） ●●●●。有趣的是，这一组的许多因素都有共同之处，它们与核外围有关（例如，与SPB有关），这很容易让人联想到Lem2。其中包括微管相关蛋白Alp14和Mto1，我们之前在沉默因子的独立筛选中发现了这两种蛋白(Braun等人，2011年)和Csi1，一个参与着丝粒聚集的核因子(Hou等人，2012年). 值得注意的是，我们还发现lnp1型+作为一种合成的相互作用体，这与我们关于部分抑制柠檬2Δ，当lnp1型+转录水平增加（补充图S2C）。我们确认了合成消声缺陷lnp1Δ以及通过报告者分析和RT-qPCR实验选择的其他候选物（补充图S4）。另一个具有合成相互作用的簇（IV）第2列Δ和努尔1Δ显示GO富集“染色质沉默”。一贯地，这组中的许多突变体具有上位性第2类Δ和ckb1号机组Δ; 例如，SHREC复合体和RNAi机械的成员。总之，这种异染色质特异性SGA方法揭示了Lem2在沉默中的功能冗余，并确定了几个关键因素，如SPB相互作用蛋白和异染色素复合物，它们与Lem2一起协调着丝粒周围沉默。此外，Lem2和Nur1之间的大量重叠强化了这一观点，即这两个因素都是控制沉默的同一网络的一部分。
Lem2与核外周异色沉默的多种途径协同作用
SGA分析揭示了几个定位于核膜并与Lem2在着丝粒周围沉默中协同作用的冗余因子。为了更好地理解Lem2的这种协同作用，我们决定关注两个与异染色质定位相关的外围因素：Csi1和Dsh1（作为RNAi机制的代表）。Csi1与SPB结合并介导着丝粒聚集(Hou等人，2012年). Dsh1是一种推测的INM蛋白，介导RNAi机制的外周组装(Kawakami等人，2012年)，有助于端粒聚集(霍尔等人，2003年). 我们删除了相应的ORFdsh1号机组+野生型和柠檬2Δ细胞，因为我们的大规模SGA研究不包括缺失突变。然后我们检测了着丝粒周围的内源性异色转录物分布式电源重复和亚砾岩第1页，共2页+RT-qPCR在单、双突变体中的定位(A） ●●●●。而单次删除csi1公司+在着丝粒和端粒显示正常转录水平，我们发现在csiΔlem2Δ双突变体，尤其适用于第1页，共2页+.在单曲中dsh1号机组Δ突变，我们观察到cen-dg公司转录本已经被强烈地去表达，这符合Dsh1在着丝粒周围沉默中的要求(Kawakami等人，2012年). 然而，我们发现森德格转录本在dsh1Δlem2Δ双突变水平与缺乏唯一组蛋白H3K9甲基转移酶Clr4的细胞相似。合成表型表明Lem2作用于不同于RNAi的途径，我们一致发现Chp1（含精RITS复合物的亚单位）的染色质结合不受柠檬2Δ（补充图S5A）。我们进一步观察到在dsh1Δlem2Δ突变体第1页，共2页+转录本，暗示其他通路参与端粒沉默(A） ●●●●。由于RNAi与端粒相关蛋白Taz1重复作用(格雷瓦尔2010)，我们测试了Lem2的协作函数。我们发现塔兹1+在里面柠檬2Δ细胞确实会导致合成端粒沉默缺陷。(B） ●●●●。令人惊讶的是，删除所有三个因素会进一步降低第1页，共2页+总的来说，这些发现表明Lem2在核外围与多条平行通路协调异色沉默。
Lem2在异染色质沉默中与各种途径协同作用。(A类,B类)异色转录水平的RT-qPCR，分析如下C、(C类,D类)H3K9me2水平的ChIP-qPCR分析。ChIP数据已规范化为电流互感器1+与野生型细胞中每个异色结构域的最大富集度有关(岑1,电话1L、和电话2L). 数据表示为平均值±SEMn个独立实验；星号表示P（P）<0.05（*）和P（P）<0.01（**）来自双尾学生t吨-测试分析。
与端粒协同缺陷相反taz1Δdsh1Δlem2Δ三重突变，我们在着丝粒周围观察到部分抑制（补充图S5B）。我们对森德格中的成绩单柠檬2缺失转录因子Atf1的Δ细胞（补充图S5C），该转录因子对交配型基因座的沉默具有特异性(格雷瓦尔2010). 因此，阻断端粒特异性或交配型特异性通路，可以在着丝粒周围以相互作用的方式恢复沉默。这一发现使得沉默缺陷在柠檬2Δ突变体是由广泛改变的转录引起的非特异性突变体，尽管我们注意到缺乏Lem2的双突变体和三突变体通常表现出多效性表型，如生长缓慢和小菌落（数据未显示）。此外，由于我们没有发现这些双突变体中各种常染色质基因的表达发生改变（补充图S5D），因此我们得出结论，Lem2在基因抑制中的协同作用仅限于沉默染色质。
H3K9me是异染色质结构的组成部分，对转录沉默至关重要。在庞贝乳杆菌，沉默染色质的普遍标记是二甲基化的H3K9（补充图S6A；Zofall和Grewal 2006;Al-Sady等人，2013年). 缺乏Lem2的细胞仅显示着丝粒周围H3K9me2的适度减少(C、 顶部），但与csi1公司Δ（补充图S6B）。相反，保持着丝粒周围H3K9me2需要RNAi(格雷瓦尔2010)并且在dsh1号机组Δ突变体(C、 底部）。尽管如此，dsh1号机组Δ细胞并非完全没有这个标记柠檬2+导致H3K9me2进一步降低至野生型水平的5%–10%(C、 底部）。这一发现表明Lem2和RNAi也对近着丝粒H3K9me2起合成作用。然而，对于亚群的大多数部分，H3K9me2在单个或组合突变体中没有降低到野生型水平以下lem2Δ，dsh1Δ和塔兹1Δ (D类；补充图S6C）。总之，围绕着丝粒和端粒似乎对维持Lm2的H3K9me有不同的要求。这些发现进一步表明，维持高水平的H3K9me通常不足以维持端粒处受抑制的转录。
Lem2与Csi1和Dsh1在异染色质定位中合作
在酵母中，间期异染色质采用所谓的Rabl构型，其中着丝粒在外围靠近SPB，而端粒位于SPB的对面。考虑到Lem2和着丝粒聚类因子Csi1在沉默中的部分冗余，我们询问两者在着丝粒定位中是否也具有重叠功能。为了确定着丝粒和SPB的相对定位，我们使用GFP标记的Mis6（一种内着丝粒蛋白）和mCherry-tagged Sad1（一种与SPB相关的SUN域蛋白）。活细胞成像证实了融合蛋白的正确表达，在野生型细胞中，融合蛋白形成一个单一的簇，代表与SBP共定位的三个着丝粒(A） ●●●●。缺乏Csi1的细胞通常显示两个Mis6-GFP病灶(Hou等人，2012年)，但我们发现有三个病灶的细胞数量在csi1Δlem2Δ双突变体（在csi1公司Δ电池）(A、 B类；补充图S7A）。此外，在双突变体中，着丝粒与SPB的共定位受到显著干扰，导致SPB邻近的Mis6-GFP信号与mCherry-Sad1病灶完全分离的细胞数量显著增加（分别为18%和10%）csi1Δlem2Δ与0.7%和1.5%相比csi1Δ，分别）(A；补充图S4B）。这种共定位表型在lem2Δdsh1Δ单元（补充图S7B）。值得注意的是，通过表达核膜标记（mCherry-Cut11），我们证实了csi1Δlem2Δ细胞确实脱离了核外围（补充图S7C）。
Lem2与Csi1和Dsh1在着丝粒和端粒定位方面合作。(A类)Mis6-GFP（着丝粒）和Sad1-mCherry（SPB）双色活细胞成像的代表性图片。虚线描绘了单元格边界。(B类)具有不同数量Mis6病灶的细胞的量化。显示的是人口的百分比n个一个代表性实验的细胞。(C类)细胞定量显示Mis6-GFP和Sad1-mCherry不同程度的共定位。对于每个细胞，靠近SPB的最接近Mis6-GFP病灶被分类为重叠、接近或与SPB完全分离。显示的是n个代表性实验的单元格，表示每种定位类型。(D类)带代表性图片的共焦平面内Taz1-GFP（端粒）的区域指定（I–III）和分布（如正确的). mCherry-Cut11显示了核膜。(E类)Taz1-GFP相对于核周边分布的定量。图中所示为以下人群每个核区的端粒百分比n个细胞由两个独立的实验组合而成。星号表示P（P）<0.05（*）和P（P）χ中<0.0001（****）2测试分析。
Lem2也有助于端粒锚定(Gonzalez等人，2012年). 因此，我们测试了Lem2与RNAi组装因子Dsh1在定位中是否合作，因为它们在沉默中存在冗余。为了确定核周锚定的频率，我们通过共焦显微镜分析了端粒相关蛋白Taz1（GFP标记）相对于核膜蛋白Cut11（mCherry-tagged）的位置。对于量化，我们使用了前面描述的方法(Hediger等人，2004年)每个光学部分被划分为三个面积相等的区域，分别对应于核外围（区域I）、相邻区域（区域II）和核内部（区域III）(D） ●●●●。虽然端粒的随机分布会导致所有三个区域之间的均匀定位，但在野生型细胞中，Taz1-GFP主要存在于区域I（80%）中，但很少存在于区域II（15%）或区域III（6%）中(E） ●●●●。Dsh1的缺失几乎不会影响Taz1-GFP的分布，而Lem2的缺失会导致更频繁的离域，这与最近的报告一致(Gonzalez等人，2012年). 有趣的是，缺乏Dsh1和Lem2的细胞表现出加重的表型（27%对16%柠檬2III区Δ；P（P）<0.05），导致端粒几乎随机分布(E） ●●●●。这一发现表明，Lem2和Dsh1不仅在端粒沉默方面合作，而且在锚定方面也合作。
Lem2通过其含LEM的N末端结构域与染色质结合
异染色质沉默和定位之间的显著相关性促使我们研究Lem2是否通过异染色素的外周系留介导这些功能。研究不同Lem2结构域的功能（见上文；A） ，我们生成了缺乏其中一个核质结构域（Lem2ΔN，不含LEM结构域；Lem2ΔC，不含MSC结构域）的膜结合版本以及仅包含可溶性部分（N端和C端）的片段(A） ●●●●。这些片段是在补充第2列全长Lem2的Δ表型（补充图S1B）。通过C末端GFP融合和活细胞成像，我们首先验证了片段的正确表达。含有跨膜结构域的片段主要位于核膜，而没有跨膜结构区的片段主要是核质(B） ●●●●。此外，我们确认C端GFP标签不会干扰Lem2的沉默功能（补充图S8A）。然后我们用全长Lem2-GFP进行染色质免疫沉淀（ChIP），并探测着丝粒1以及电话1L和电话2L。特别是，我们发现Lem2-GFP在着丝粒1富集超过10kb，表明它直接与染色质相互作用(C类；补充图S8B）。Lem2-GFP的分布严格限制在中心核心碳纳米管1结构域（参与动粒附着），但不包括在着丝粒周围（与H3K9me相关）。这种染色质富集也见于缺少C末端（Lem2ΔC-GFP）的片段，但不见于缺少N末端（Lem2ΔN-GFP）或仅包含Lem2的可溶性N末端或C末端结构域的片段(C类；补充图S8C）。此外，没有一个构造在亚砾岩区域内显示出显著富集。总之，这些发现表明Lem2与着丝粒染色质相互作用，并且包含保守LEM结构域的N末端部分是必需的，足以进行结合。
Lem2通过其N-末端结构域与着丝粒结合。(A类)说明Lem2及其各个域的拓扑的方案。展示在下面是本研究中使用的Lem2（GFP-tagged）的截断版本。（NE）核膜；（TMD）跨膜结构域。(B类)Lem2-GFP片段的活细胞成像。（绿色）Lem2-GFP片段；（红色）Sad1-m樱桃；（控制）空矢量。Sad1-mCherry被用作SPB标记，以指示Lem2-GFP片段的相对位置。其中一个的个人图像z（z）-显示切片（对于某些单元格，SPB超出平面，因此不可见）。(C类)ChIP-qPCR实验显示Lem2-GFP片段的结合图谱。这个左侧Y-轴表示Lem2-GFP相对于行为1+、和右侧Y-轴表示相对于野生型细胞中每个域的最大值的H3K9me2水平（来自C、 D）。数据显示为三个独立实验的平均值±SEM。
不同Lem2结构域介导着丝粒定位和端粒锚定
Lem2通过其N末端与着丝粒染色质的特异性结合使我们测试了这一部分是否对将着丝粒连接到SPB也至关重要。因此，我们对表达于csi1Δlem2Δ细胞以及Mis6-GFP和Sad1-mCherry。全长Lem2的表达补充了Mis6-GFP的共定位缺陷，达到了csi1公司Δ单个突变体(A） ●●●●。值得注意的是，Lem2ΔC而非Lem2△N的表达导致了对该表型的类似拯救，这表明N末端结构域确实对着丝粒附着到SPB至关重要。我们还测试了着丝粒聚集的要求。与全长Lem2相比，截短的两个版本都不能补充表型(B） 这意味着这两个域都有助于着丝粒聚集。
Lem2通过其不同的结构域介导异染色质的定位和沉默。(A类)着丝粒SPB共定位缺陷的补充csi1Δlem2表达Lem2不同片段的Δ细胞。（e/v）空矢量。MSC是指C末端核质结构域。所示为两个独立实验的汇集数据。(B类)着丝粒聚集缺陷的互补csi1公司Δ柠檬2Δ单元。所示为两个独立实验的汇集数据。(C类)Taz1-GFP定位缺陷的补充柠檬2Δ单元。给出了一个具有代表性的实验。在A类–C类，星号表示P（P）<0.01（**）和P（P）< 0.0001 (****) (χ2测试）。定量分析如所述注意，在互补实验中，细胞在EMM培养基中生长以保持表达质粒，这部分抑制了聚集和离域缺陷。(D类)沉默缺陷的补充柠檬2通过沉默5-FOA的报告者分析得出Δ细胞。在EMM-Leu平板上生长的指示菌株的五倍连续稀释液，添加（未诱导）或不添加硫胺（以诱导Lem2片段的表达）。(E类)沉默缺陷的补充lem2Δdsh1Δ细胞。星号表示P（P）< 0.01 (**),P（P）<0.001（***），以及P（P）<0.0001（****）来自双尾学生t吨-三个独立实验的测试分析。
我们进一步研究了端粒募集的需求，并用柠檬2Δ细胞共存Taz1-GFP和mCherry-Cut11。出乎意料的是，我们发现端粒锚定并不依赖于N端部分，而是需要C端MSC结构域(C） ●●●●。因此，虽然N末端部分是正确定位和结合着丝粒染色质所必需的，但C末端部分是必需的，足以调节端粒的正确定位。
Lem2通过其C末端MSC结构域控制异染色质沉默
接下来我们研究了Lem2的哪个结构域是转录沉默所必需的。使用近着丝粒imr1L:：ura4+报告者沉默试验，我们发现，与端粒锚定类似，Lem2ΔN的表达仍然完全补充了柠檬25-FOA上的Δ(D） ●●●●。相反，缺乏MSC结构域或跨膜结构域的片段没有发现互补性。这些发现表明，MSC结构域对于促进Lem2在异色沉默中的作用是必要和充分的，但仅当存在于核膜时。
为了以更定量的方式确认沉默缺陷的互补性，我们通过RT-qPCR检测了dsh1Δlem2Δ双突变体，由于表型加重，更适合定量抑制分析(A） ●●●●。与沉默报告试验一致，我们发现全长Lem2和Lem2ΔN的表达抑制了尿酸4+报告基因和各种内源性异色基因座，而缺乏MSC结构域的Lem2ΔC和可溶性片段没有观察到互补(E） ●●●●。值得注意的是，尽管Lem2ΔC的表达水平低于Lem2△N，但Lem2ΔC片段的表达水平与全长Lem2相同（补充图S9A，B）。此外，Lem2ΔC和全长Lem2定位于核膜并与染色质在类似水平上结合(B、 C）。这排除了Lem2ΔC的表达水平限制抑制柠檬2Δ消声缺陷。基于这些发现，我们得出结论，Lem2的沉默仅由MSC结构域介导。
Lem2沉默涉及Snf2/HDAC阻遏物复合物SHREC
人MAN1的MSC结构域通过保守的带正电残基延伸在体外与DNA结合(Caputo等人，2006年). 在裂变酵母中，Lem2中不存在这种带正电荷的基序（补充图S8D），并且与体内染色质的结合不需要其MSC结构域(C） ●●●●。因此，我们研究了MSC结构域的沉默是否可能涉及异染色质因子的补充。最突出的候选者是据报道被哺乳动物LAP招募到外围的HDAC(Amendola和van Steensel 2014). 使用候选方法，我们将重点放在Snf2/HDAC阻遏物复合物SHREC上，该复合物含有II类HDAC Clr3(Sugiyama等人，2007年). SHREC与抗沉默蛋白Epe1起拮抗作用，并与之竞争与HP1的结合，当SHREC的结合受损时，导致Epe1的染色质募集增加(A；Zofall和Grewal 2006;Shimada等人，2009年). 使用先前描述的Clr1（SHREC的亚单位）和Epe1的表位标记版本(Braun等人，2011年)，我们使用ChIP来评估它们与异染色质的关联是否受到Lem2的影响。值得注意的是，我们发现Clr1和Epe1之间的比率在柠檬2Δ细胞，导致Clr1-Flag减少了近50%，同时Epe1-Flag增加了15%-25%中心-分布式电源重复和第1页，共2页+位点(B） ●●●●。这些数据表明，Lem2促进SHREC与HP1的结合，进而阻止Epe1的结合。
Lem2通过SHREC途径发挥作用并对抗Epe1的抗沉默功能，从而促进端粒沉默。(A类)说明Epe1、SHREC、CK2和Mst2之间的功能关系的方案。带实线和虚线的箭头分别表示直接交互和功能交互。带圆圈的“P”表示CK2磷酸化HP1。(B类)Clr1-Flag的ChIP-qPCR分析(左边)和Epe1-Flag(中间的)在森德格和第1页，共2页+野生型和柠檬2Δ单元。显示了相对于未标记控件的丰富性。(赖特)基于Epe1-Flag和Clr1-Flags平均富集度的Epe1:Clr1比率。(C类,D类)RT-qPCR分析第1页，共2页+所示突变体中的mRNA。所示为标准化后相对于野生型的转录水平行为1+数据表示为平均值±SEMn个独立实验；星号表示P（P）<0.05（*），P（P）< 0.01 (**),P（P）<0.001（***），以及P（P）<0.0001（****）来自双尾学生t吨-测试分析。(E类)Lem2在着丝粒系留和异染色质沉默中的作用模型。
如果Lem2在SHREC与异染色质结合中的作用对其沉默功能至关重要，那么这两个因素都应该起认知作用。我们首先关注端粒沉默，其中Lem2起着主导作用。事实上，我们发现柠檬2+和clr1级+显示的转录水平第1页，共2页+几乎等于双突变体(C） ●●●●。Clr3（SHREC的催化HDAC亚单位）也存在这种上位相互作用，但III类HDAC Sir2不存在这种上位交互作用(C） ●●●●。引人注目的是，删除环境保护计划1+完全抑制端粒沉默缺陷第2列Δ (D） ●●●●。在MYST组蛋白乙酰转移酶Mst2缺失的情况下，也可以看到端粒沉默缺陷的部分抑制(D） ，表明它还抵消了Lem2和SHREC的功能。我们以类似的方式观察到一种上位行为clr1级Δ和抑制表型环境保护计划1缺失Nur1的细胞Δ，Lem2的假定伙伴(C、 D）。当Epe1缺失时，在沉默中绕过Lem2和Nur1的要求类似于抑制异染色质缺陷clr3Δepe1Δ电池(Zofall和Grewal 2006). 然而，尽管SHREC的有效结合需要CK2对HP1蛋白进行磷酸化(Shimada等人，2009年)，我们没有观察到柠檬2Δ和ckb1号机组Δ (C） 暗示Lem2不参与SHREC的CK2依赖性募集。总的来说，我们的研究结果表明Lem2与SHREC在端粒的作用途径相同，并且在SHREC和Epe1之间保持了正确的平衡。
在着丝粒周围，我们发现了一个更复杂的情况：clr1Δlem2Δ（和clr1Δnur1Δ）细胞具有认知行为clr3Δlem2Δ突变体显示的是森德格抄本（补充图S10A）。这些发现与我们的SGA筛查的结果一致，在SGA筛查中，我们还观察到了l的合成缺陷电磁阀2Δ和三氯乙烷Δ（和SHREC复合体的其他成员），但不是clr1级Δ (B） ●●●●。这表明Clr3可以独立于Lem2发挥作用，并且可能存在不同的SHREC亚复合物，这取决于染色质环境。此外，我们发现柠檬2Δ不通过删除进行抑制环境保护计划1+或毫秒2+（补充图S10B）。尽管如此，删除环境保护计划1+自身会导致近着丝粒处的沉默缺陷(Braun等人，2011年)干扰siRNA的稳健生成(Trewick等人，2007年)这可能解释了缺乏抑制的原因。因此，这些非线性路径使得将Lem2分配给离散函数变得更具挑战性，还需要进一步的工作来剖析异染色质域的沉默机制。
讨论
核周染色质在核膜上与多种蛋白质发生物理相互作用，但其与基因表达的相关性仍不清楚。在这里，我们证明了LEM域蛋白Lem2介导异染色质沉默和定位S.pombe公司通过与冗余路径合作。这些途径中的多重缺陷导致协同沉默缺陷，这些缺陷与着丝粒和端粒的严重离域相关，表明抑制与核定位之间存在联系。此外，我们发现Lem2通过其包含LEM结构域的N末端与着丝粒染色质相互作用。自从LEM蛋白被广泛认为与异染色质栓系有关(Brachner和Foisner 2011;Barton等人，2015年)一个似是而非的模型是，Lem2的沉默是通过将这些染色质结构域通过其LEM结构域连接到核外围来介导的。然而，我们提供了几条实验证据来反驳这种简单的机制。解决这个问题的关键是分离Lem2的结构域并在体内测试其功能需求。这揭示了Lem2更复杂的作用，Lem2具有多个可归因于其结构域的离散函数。在这里，我们讨论了这些功能对染色质定位和沉默的影响，特别是关于不同异染色质结构域。
Lem2通过其LEM和MSC域调节不同的系留和沉默功能
Lem2特异性地与中央着丝粒区域结合，其包含LEM结构域的N末端部分足以进行这种结合(C） ●●●●。该染色质区域参与动粒的形成，我们一致发现Lem2N末端对于着丝粒与SPB的共定位也至关重要(A） ●●●●。因此，我们认为Lem2的LEM结构域介导染色质结合，并且至少对于着丝粒染色质来说，也与外围相连。虽然尚未在酵母中鉴定出BAF同源物，但Lem2可以通过其LEM结构域与类似的染色质结合蛋白结合或直接与DNA结合。
与之形成鲜明对比的是，Lem2的结合剖面中不包括侧翼着丝粒周围区域（包含H3K9me2）和亚中心；鉴于其在沉默和端粒锚定中的作用，这是意料之外的。此外，我们测试的受抑制区域都不需要LEM结构域来沉默(E） ●●●●。相反，我们发现MSC域对于沉默是必要且充分的，而沉默显然是与LEM介导的系留分离的（参见中的模型E） ●●●●。尽管如此，MSC结构域的功能严格依赖于其在核膜上的存在，强化了核外围对沉默至关重要的概念。由于MSC结构域显然不参与染色质结合，我们怀疑它促进了对沉默至关重要的因子的核周募集。这样的场景会让人想起《芽殖酵母和蠕虫：在酿酒酵母，端粒的核周附着介导SIR蛋白的聚集和局部隔离，从而促进沉默染色质的建立(Taddei等人，2009年)，而在秀丽线虫甲基转移酶SET-25的外周结合确保了H3K9me3的建立，这是完全抑制核周染色质所必需的(Towbin等人，2012年).
虽然栓系已从机械上与静音分离(Taddei等人，2004年;Gonzalez-Sandoval等人，2015年)，两者都发生在外围，可能仍会相互加强。事实上，募集机制所利用的信号通常是异染色质形成过程中建立的表观遗传标记（芽殖酵母中的脱乙酰组蛋白和蠕虫中的H3K9me）(Towbin等人，2013年). 然而，Lem2的LEM结构域的着丝粒募集不同于那些系留机制，因为它独立于异染色质发生：它不需要MSC结构域和RNAi/Dsh1沉默(; 补充图S7B）或H3K9me的存在，这在中心着丝粒区域大多不存在(C） ●●●●。这些发现与之前的观察一致，即H3K9me或RNAi途径的缺失不会导致着丝粒和端粒从外周分离(Ekwall等人，1996年;霍尔等人，2003年). 然而，值得注意的是，着丝粒定位缺陷的外显率庞贝乳杆菌即使在lem2Δcsi1Δ双突变体(B） 这意味着存在额外的系绳路径。有趣的是，RITS复合物通过Chp1与H3K9me结合而与染色质结合，而通过Dsh1被招募到核膜。因此，可以想象，这种物理联系有助于着丝粒的募集，尽管这种多余的功能会被Lem2和Csi1掩盖。总之，当其他系留机制S.pombe公司可以在功能上与异染色质偶联，LEM介导的着丝粒募集和MSC依赖性沉默是独立的机制，尽管它们是由相同的蛋白介导的。唯一的例外是，我们发现这两种功能在功能上相互协作的是着丝粒聚类，这需要两个域(B） ●●●●。
端粒募集与着丝粒定位有很大不同，因为它不依赖于LEM结构域，并且不能与沉默分离，因为这两种功能都需要MSC结构域。与Lem2在端粒募集中合作的其他途径，即RNAi机制(E） 和Taz1–Rap1–Bqt3/Bqt4锚固路径(Chikashige等人，2009年)-也与端粒沉默有关。我们推测Lem2的锚定和沉默可能涉及相同的机制。由于Lem2促进SHREC与异染色质的结合，其成分（例如Clr3）也可能直接或通过组蛋白或其他因子的脱乙酰化介导端粒锚定。有趣的是，Clr3影响两簇应激诱导基因的表达和外周定位，其中一簇与端粒非常接近(Alfredsson-Timmins等人，2009年). 此外，SIR复合物在出芽酵母的组蛋白脱乙酰化和端粒锚定中发挥双重作用(Taddei等人，2004年). 总之，这些例子表明，将基因抑制与端粒锚定结合的一种策略可能是向核外周招募多功能HDAC复合物。
冗余和竞争性沉默途径
Lem2的缺失会适度影响标记有H3K9me的所有主要异染色质结构域的转录沉默；然而，它也有助于抑制着丝粒碳纳米管1域和几个LTR(). 这些基因座大多缺乏H3K9me2，我们一致发现这些区域的沉默更依赖于Lem2而不是Clr4。因此，Lem2在主要异色区域的沉默似乎被冗余路径掩盖（见下文），而在这些路径不太活跃或不活跃的地方（例如，在LTR），其影响更为明显。总的来说，这些数据表明Lem2是异染色质沉默的全球调节器S.pombe公司可以独立于H3K9me2发挥作用。
Lem2的同调函数酿酒酵母和秀丽线虫也与基因抑制有关,尽管异染色质沉默的全球作用尚未被描述(Grund等人，2008年;Ikegami等人，2010年;Chan等人2011;Mattout等人，2011年). 由于其他因素的进一步冗余，可能会错过这个角色。使用高度敏感的SGA方法，我们鉴定了大量具有合成沉默缺陷的突变体，并结合柠檬2Δ (). 我们发现的各种基因编码与核膜/ER膜或细胞骨架相关的蛋白质（例如，Csi1、Lnp1、Alp14和Mto1）。它们如何导致异染色质沉默尚不清楚。虽然其中一些定位于SPB（即靠近着丝粒），但它们也影响其他异染色质域（例如端粒）。这可能表明这些突变体也会导致二次沉默缺陷（例如，通过核膜的异常形态），这可能会影响其他参与染色质结合的INM蛋白的活性或稳定性。
除了这些膜/细胞骨架因子外，我们还确定了几种已知的异染色质沉默因子；例如RNAi机制的成员。使用精确的定量方法，我们确定了Lem2、RNAi因子Dsh1和端粒相关蛋白Taz1如何在着丝粒周围和端粒沉默中合作（补充图S5E）。在近着丝粒，Lem2和Dsh1对H3K9me依赖性沉默的最大阻遏作用负责，即使RNAi途径占优势。相反，端粒的完全抑制至少需要一个额外的途径，即Taz1，然而我们发现Lem2在冗余途径中起着主导作用。值得注意的是，抑制端粒特异性（Taz1）或交配型特异性（Atf1）沉默途径可以在着丝粒周围以相反的方式恢复沉默。这一观察结果与之前的观点一致，即不同的异染色质结构域竞争有限的可溶性沉默因子库（HP1S.pombe公司和SIR蛋白酿酒酵母) (Taddei等人，2009年;Tadeo等人，2013年). 这些结果揭示了异染色质沉默中合作的部分冗余通路网络。因此，整合多条通路并将其限制在核外周可能是一种细胞策略，以获得特异性并降低异位部位异染色质启动的风险。此外，这种独特的沉默途径网络可以提供更多的复杂性，并有助于调节沉默以响应环境提示。
Lem2介导的沉默机制
虽然Lem2促进SHREC与异染色质的结合，但其丢失会导致JmjC蛋白Epe1的结合增加。值得注意的是，Lem2和SHREC在端粒处共享相同的沉默途径，删除Epe1可以绕过它们的必要性(;Zofall和Grewal 2006). 因此，我们得出结论，Lem2的一个主要功能是协调SHREC和抗阻因子Epe1之间的平衡(E） ●●●●。在这方面，Lem2类似于CK2，因为它通过HP1蛋白的磷酸化促进SHREC的募集(Shimada等人，2009年). 然而，我们发现这两种途径彼此独立工作，这意味着Lem2在SHREC向异染色质的募集中影响不同的步骤。事实上，我们没有通过共免疫沉淀实验（数据未显示）检测到Lem2和Clr3之间的物理交互作用，这表明Lem2间接促进SHREC结合。然而，我们不能排除Lem2和SHREC瞬时相互作用的可能性。
在着丝粒，Lem2和SHREC之间的关系更为复杂，因为SHREC的单个亚单位（即。，clr1级Δ和三氯乙烷Δ）与柠檬2Δ（补充图S10）。此外，Epe1似乎具有双重作用，因为它对抗异染色质(Braun等人，2011年)也促进了siRNAs的生成(Trewick等人，2007年)，解释了为什么不能简单地通过删除Epe1来绕过Lem2抑制着丝粒周围转录物的必要性。因此，近着丝粒处交织路径的复杂性使得为Lem2指定离散函数更加困难。尽管如此，Lem2的缺失导致着丝粒周围H3K9me2的减少，特别是当与dsh1号机组Δ(B） 表明Lem2影响该抑制标记的建立或维持。Epe1与组蛋白去甲基化酶具有同源性，并且据报道影响H3K9me在异位异色结构域的稳定性(Audergon等人，2015年;Ragunathan等人，2015年). 因此，可以想象Lem2主要通过调节Epe1来控制H3K9me和着丝粒周围的沉默。最后，值得注意的是，Lem2也有助于抑制缺乏H3K9me（以及HP1/Epe1）的染色质区域。因此，其在沉默中的作用可能不仅限于H3K9me和SHREC募集，还可能影响其他沉默途径。
结束语
核膜蛋白质已进入理解沉默和被抑制染色质外围位置之间的功能关系的焦点，特别是在发育和细胞分化方面(Meister等人，2010年;Zuleger等人，2013年). 后生动物INM蛋白的大量存在以及由此产生的这些功能网络的复杂性使其成为一项具有挑战性的任务；因此，在冗余度较小的模型生物中研究它们的分子机制可能是有利的。值得注意的是，虽然在S.pombe，只有Lem2似乎参与异染色质沉默，这使我们能够剖析LEM域介导的系留和MSC域介导沉默的功能。鉴于在整个进化过程中，这组INM蛋白中LEM和MSC结构域的保守存在，这种机制可能代表异染色质阻遏的普遍模式。
材料和方法
酵母菌株、质粒和技术
使用标准培养基和基因组工程方法。补充表S1列出了本研究中使用的菌株。对于表达结构的克隆，全长柠檬2+或的碎片柠檬2+通过PCR扩增并克隆到BamHI–PacI位点pREP41x/81x或SalI–BamHI现场pREP81x-EGFP-标签（补充表S2）。使用浓度为5µg/mL的硫胺抑制nmt1（纳米1）发起人(pREP41x/81x). 含有1 g/L 5′-氟代甲酸的5-FOA培养基。如果没有其他指示，则使用EMM培养基沉默报告生长分析。对于用Lem2表达的RT-qPCR实验pREP41x/81x质粒、细胞最初在EMM-Leu中生长，然后在收获前转移到富培养基（YES）中四到五代。
SGA分析
SGA进行了大规模交叉，如前所述(Verrier等人，2015年)使用Bioneer单倍体缺失突变库（3.0版）和imr1L（NcoI）：：ura4携带马力MX标记2 kb上游供选择。关于SGA数据的分析和上位性计算，请参见补充图S2。
定量ChIP和RT-qPCR分析
ChIP实验基本上按照所述进行(Braun等人，2011年)除了一个{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q800R1”，“term_id”：“82132485”，“term_text”：“QA00R1”}}Q800R1型分别使用声波仪（QSonica）和Dynabeads蛋白G（Life Technologies）进行染色质剪切（30分钟，30秒开/关周期，90%振幅）和免疫沉淀。增加ChIP灵敏度(B） 如前所述，通过后续处理10 mM己二酸二甲酯和1.5%甲醛进行交联(Braun等人，2011年). 用2-5µg抗体（抗-GFP[由慕尼黑大学A.Ladurner提供]、抗Flag[Sigma，F3165]、抗H3K9me2[Abcam，ab1220]和抗-H3K9m3[Millipore，07-442]）从对应于12–30 OD的裂解液中免疫沉淀Lem2-GFP、Epe1-Flag、Clr1-Flags和抗-H3 K9me3600个单元格。如前所述进行RT-qPCR实验(Braun等人，2011年).
使用Fast SYBR Green Master mix（Life Technologies）和7500 Fast real-time PCR系统（Applied Biosystems）通过qPCR定量免疫沉淀DNA和cDNA。补充表S3和S4中列出了底漆.对于独立实验的平均值和标准偏差的计算，行为1+-标准化数据集根据每个实验的突变样本库的平均值进行标准化。然后将这些结果显示为相对于野生型的平均值（设置为1）。
实时细胞成像
通过蔡司Alpha Plan/Apo 100×/1.46 oil DIC M27物镜（适用于B和补充图S4A、B，使用蔡司平面/Apo 63×/1.4油浸物镜）。以0.4µm的焦距获得光学截面图像。对于距离测量，使用ImageJ软件。
