衰老小鼠肝脏的综合转录景观
，
， ， ， ，和 瑞安·R·怀特
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
阿尔伯特·爱因斯坦医学院，迈克尔·F·普莱斯遗传与转化研究中心，1301 Morris Park Ave，Bronx，NY 10461 USA
布兰登·米尔霍兰德
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
希拉·麦克雷
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
林明艳（Mingyan Lin）
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
郑德友
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院神经科学系
简·维吉
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
美国纽约州布朗克斯市莫里斯公园大道1301号迈克尔·普莱斯遗传和转化研究中心阿尔伯特·爱因斯坦医学院，邮编：10461
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院遗传学系
美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院神经科学系
美国纽约州布朗克斯市莫里斯公园大道1301号迈克尔·普莱斯遗传和转化研究中心阿尔伯特·爱因斯坦医学院，邮编：10461
通讯作者。 2015年5月27日收到；2015年10月10日接受。
摘要
背景
哺乳动物的衰老是一个高度复杂的过程，目前还缺乏对其完整机制的理解。帮助理解衰老背后的分子变化的一种方法是通过对转录组的综合分析，转录组是年龄相关表型多样性的主要决定因素。以前的研究依赖于微阵列分析来检测衰老生物体不同组织中的基因表达谱。然而，研究表明，基于微阵列的转录谱分析不太准确，也不能完全捕获全球转录组的某些复杂性。
方法
这里，通过对老龄小鼠肝脏的定向全转录组RNA测序，我们确定了由典型蛋白编码转录物、转录亚型和非编码RNA转录物（包括假基因、，长非编码RNA和小RNA物种。
结果
结果显示，小鼠肝脏转录组的每个组成部分都发生了广泛的年龄相关变化，个体间变异显著增加。蛋白质编码mRNA和亚型的功能注释表明免疫反应、细胞激活、代谢过程和RNA修饰发生了广泛变化。有趣的是，多种lncRNAs(梅格3，里安（Rian），米尔格)来自深蓝色-Dio3在衰老肝脏中发现microRNA基因座上调，将该基因座归类为衰老肝脏中可能的调控热点基因座。此外，将改变的非编码RNA和蛋白编码转录物整合到年龄相关变化的相互作用网络中，揭示了炎症、细胞增殖和代谢是小鼠肝脏中主要的衰老表型。
结论
我们的分析首次全面剖析了衰老小鼠肝脏中的转录景观。
电子辅助材料
本文的在线版本（doi:10.1186/s12864-015-2061-8）包含对授权用户可用的补充材料。
关键词：基因表达，衰老，RNA-seq，转录组，非编码RNA，变异，肝脏
背景
哺乳动物的衰老是一个复杂的生物学过程，至今仍知之甚少。为了加深我们对年龄相关性器官和组织退化背后不同相互作用过程的理解，对基因表达变化的系统研究是一个合理的起点。基因表达的全球变化是多种物种衰老的“标志”[1，2]并已成功用于证明延缓衰老的干预措施的具体效果，如限制热量摄入[三]. 过去，微阵列分析被广泛用于研究多个组织中与年龄相关的差异，但由于各种原因，这些分析最终证明不足以完全了解衰老转录组。首先，微阵列分析依赖于完全注释的基因，自从ENCODE项目发布以来，我们现在知道不断发现新的未注释转录物[4]. 第二，微阵列分析通常受到过度噪声的影响，这可以解释小鼠肝脏基因表达随年龄变化的不同公布结果之间的微小重叠[5]. 例如，虽然一份报告提到了小鼠肝脏老化期间基因表达的最小年龄相关变化[6]，其他人观察到了相当多的此类变化，尽管各研究之间差异很大[5，7——9]. 最后，由于差异剪接或非mRNA物种（如非编码RNA）的变化，微阵列分析通常无法检测到亚型水平的改变。这对非编码RNA尤其重要，因为到目前为止，这类转录物的作用通常被理解为涉及微调基因调控模式，例如细胞代谢[10]. 在这一水平上放松管制的增加可能解释许多观察到的衰老表型，其中涉及细微而非剧烈的变化。RNA测序的最新进展为研究基因表达的变异提供了一个合适的替代方案，解决了所有这些问题。
虽然基因表达谱的变化被用作衰老的生物标志物，有时甚至用作生物衰老率的预测因子[8]研究衰老转录组的最终目的是以组织特异性的方式阐明定义与年龄相关的退行性过程及其引发的反应的途径。为此，有必要收集非mRNA、基因调控RNA背景下的mRNA表达数据。事实上，如前所述，除了约占基因组3%的典型蛋白编码mRNAs外，许多ncRNAs的关键作用现在已经被公认。NcRNA是一个宽泛的总括术语，包括假基因，或那些已失去蛋白质编码潜力但有时仍能转录的基因[11]，长非编码RNA（lncRNAs），通常长度大于200个核苷酸，已证明其具有从转录抑制到沉默的广泛功能[12]和小ncRNA（长度<200个核苷酸），主要包括调节性微小RNA（miRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）和转移RNA（tRNA）。虽然这最后一类中的物种很小，但它们可能对细胞功能有很大影响，调节诸如基因沉默、剪接和翻译等过程[13]. ncRNAs在衰老中的作用尚不清楚，这基本上限制了在RNA景观中生成组织特异性改变的综合功能网络的尝试。
在这里，我们使用了一种能够捕获小鼠肝脏整个转录组的RNA测序方法，这与其他哺乳动物在衰老大脑中所使用的方法类似[14，15]. 具体而言，我们分析了年轻成年（4个月）和老年（28个月）小鼠肝脏，并确定了显著改变的转录物，不仅是标准编码转录物，而且还有新的ncRNA转录物和亚型变体。一些改变的ncRNAs，其中许多来自深蓝色-二极管3基因座是一个与发育和多能性有关的印迹结构域，在这里被确定为小鼠肝脏衰老中的ncRNA基因调控热点，是年龄相关有丝分裂潜能丧失的潜在调节器。年龄相关的差异表达转录物，包括亚型和ncRNAs，首先被编译成假定的功能通路，然后用于构建年龄相关的相互作用网络。这些与年龄相关的变化网络揭示了三种主要的新兴表型：炎症、增殖稳态和脂质代谢变化。
结果
测序指标和转录组基因组覆盖率
为了直接分析衰老小鼠肝脏的总转录组，我们从三只成年幼鼠（4个月）和三只成年雄性小鼠（28个月）肝脏中分离出总RNA，并进行定向全转录组测序[16]. 对于每个库，我们平均生成约3000万个配对基因读取，其中82-90%可以映射到NCBI Build 37/mm9参考基因组（附加文件1：表S1）。使用一个独特的注释参考数据库来描述对齐阅读，该数据库结合了所有转录本的五个不同的已知数据库：ENSEMBL、GENBANK/NCBI、REFSEQ、VEGA/HAVANA和MGI。通过采用这种方法，我们能够利用所有已知的数据库预测，并编译这些预测，以便在衰老过程中发现新的转录物[17]. 因此，我们不仅能够分析人工策划的基因集，如VEGA/HAVANA注释，还能够分析小鼠基因组中只有计算预测注释的部分，如ENSEMBL中发现的部分，共有47510个转录注释（相比之下，目前的微阵列芯片约35000个）。
首先，我们测定了活跃转录的基因组的百分比。在我们47510个转录本的独特注释数据库中，平均59.5%的注释转录本在所有动物的肝脏中表达，包括年轻和老年，定义为每个转录本>1个计数，以解释低丰度转录本。在这些转录物中，约70%是蛋白质编码基因（图)，来自假基因的转录物约占16%，其余约7.5%代表ncRNAs，如lncRNAs、snoRNA、snRNAs和miRNAs。大约3%的这些ncRNAs仍未分类（图)。这些结果证实了其他人对人类基因组的发现[18].
衰老小鼠肝脏的整体表达分析。一我们独特的注释集47510个注释转录本中，年轻和老年肝脏中表达的全球表达转录子亚种的百分比。b条表中列出了所有老肝、所有幼肝或老肝和幼肝中至少一个唯一读数所涵盖的基因组碱基数量。在使用GRCm38构建进行分析时使用的小鼠基因组总大小参考是单倍体基因组的2293712140个碱基。c（c）差异转录表达绘图日志2FoldChange（Old/Young）与平均基因离散值。红点表示FDR<0.1的所有1264个显著差异表达转录本。旧(n个 = 3） ，年轻(n个 = 3).d日前100个差异表达转录本的热图表示P（P）-值，使用无监督的层次聚类生成
鉴于一些长期存在的假设，即正常情况下不在分化组织中表达的基因的抑制在老年时会放松[19]，我们比较了年轻和老年肝脏的转录组基因组覆盖率。值得注意的是，要从一个数据集中完全捕获完整的转录组，可能需要超过10亿的RNA-seq读取，而不是我们所有六只动物加起来的大约1.5亿。然而，我们计算了每种动物，无论是年轻的还是年老的，至少一次读取所覆盖的唯一碱基的数量，并将其除以单倍体小鼠基因组中约28亿bp的碱基总数[18]. 结果表明，年轻和老年小鼠肝脏之间没有显著差异（图)。因此，我们没有观察到老年时基因抑制有任何明显的主要放松，尽管不能排除一些次要影响。事实上，当我们合并每个年龄组的三个单独肝脏样本时，基因组覆盖率翻了一番，即年轻组和老年组的基因组覆盖率分别从约4.8%和约5.3%增加到9.6%和10.8%，这表明我们远没有在一只动物中捕获所有转录碱基。当结合所有动物的数据时，无论是幼年还是老年，覆盖率都没有翻倍，只增加到17.0%，这表明开始出现一些饱和（图)。尽管如此，仍然令人惊讶的是，高达17%的小鼠肝脏基因组能够被转录。
衰老的特点是肝脏转录组中个体差异增加
基因表达的变异增加被认为是生物体发生与年龄相关的细胞退化的一种机制[20，21]. 虽然我们只有三只年幼动物和三只年老动物的RNA-seq数据，但每只动物都获得了2000多万个可绘制的读数。理论上，由于每个动物的转录组覆盖率都很高，我们应该能够准确地检测到动物之间的变异。
为了比较年轻和老年时动物之间的差异，我们生成了一个多维标度图（MDS），其中显示了前25000个表达转录物的差异（图)。MDS分析表明，幼年动物聚集在一起，而老年个体在每个生物复制之间有明显的高度差异。此外，我们使用无监督的欧几里德矩阵图分析每个样本，以观察单个年轻肝脏和老年肝脏之间的差异（图)。我们发现，年轻人和老年人仍然单独根据差异划分为各自的类别。此外，我们发现年轻肝与年轻肝的距离值更接近1，而老年肝与老年肝的距离更远，这意味着老年肝转录组比年轻肝转录组的个体差异更大。
以随机变化为特征的老化曲线。一使用多维标度分析绘制的前25000份转录本的方差；年年轻，O（运行）旧的，n个生物复制。b条热图显示年轻和老复制样本之间的欧几里德距离矩阵，该距离矩阵是根据计数值的方差计算得出的，其中数值接近1的变量较小。c、 d日计算的均方变异系数（CV2)对于基因(b条)和异构体(d日)绘制为年轻和老年肝脏样本归一化计数表达的函数。e（电子）每种转录本类型的标准化个人计数数据的百分比。黑色条表示平均值±标准偏差
分析每种转录物之间的差异时，主要是基因和亚型（图，)我们发现，变异高度依赖于转录表达水平；也就是说，如前所述，低表达基因和亚型往往比高表达基因和异构体具有更高的变异系数[22]. 然而，我们仍然发现，无论表达水平如何，老年肝脏的变异系数都较高。此外，我们发现，与年轻人相比，老年人肝脏中每一类转录本的总归一化计数百分比通常更具变异性（图)。这些发现表明，老年小鼠的肝脏转录组始终比年轻小鼠的肝脏转录组更具变异性，这种个体间变异的增加部分归因于在特定转录类型水平上观察到的随机变异。
年轻和老年小鼠肝脏RNA物种的差异表达
在分析单个转录本之前，我们首先评估了表达水平的全球变化数据。由于年龄相关的表达差异的大小无法预测，可能很小[23]，我们避免为折叠变化设置任意的截止值，从而使我们能够检测到所有可能的具有统计意义的表达变化。我们总共发现1264个转录本在小鼠肝脏中随年龄差异表达。其中，974个转录物在衰老过程中显著上调（FDR<0.1），而290个转录物显著下调（FDR<0.1）（图; 其他文件2：表S2）。在总转录本中，我们共发现1102个显著差异表达蛋白编码（mRNAs）基因（FDR<0.1；其他文件2：表S2）。这包括863个上调基因和239个下调基因。这一发现证实了先前的微阵列研究表明，总的来说，衰老肝脏中上调的基因多于下调的基因[5]. 正如可以预测的那样，当前100个蛋白编码转录物进行无监督的层次聚类时，老年和年轻小鼠被分成各自的队列（图).
为了验证从我们的RNA-seq数据集获得的结果，我们使用基于探针的阵列进行了qPCR验证。我们特别选择了13个转录本，这些转录本在计数数量、折叠变化差异以及之前与衰老或衰老相关的对照基因方面存在差异。我们分析了老化肝脏中上调的转录物赖氨酸6a，百万像素12，Cxcl9公司，千兆比特2，第7页，种族2，Fgfr3级，Ctss公司、和Terc公司（ncRNA），而经验证的下调转录物Mt1（百万吨），E2f7型，Hspa1b，和整洁1（ncRNA）。我们通过绘制对数的线性回归图，直接将这些qPCR结果与RNA-seq结果进行比较2每个成绩单的FoldChange（Old/Young）值（附加文件7：图S1A）。结果显示皮尔逊相关系数为0.95，证实我们的RNA-seq结果准确可靠。
最近，研究旨在区分表达的mRNA亚型，因为mRNA加工可能随着年龄的变化而改变[15，24，25]. 因此，我们测试了通过读取比对和使用Cufflinks/Cuffdiff包是否可以检测到小鼠肝脏中异构体表达的变化[26]使用ENSEMBL注释数据库。我们总共发现了105种差异表达的同种型（附加文件三：表S3）。其中，73种亚型在衰老肝脏中显著上调（FDR<0.1），32种亚型显著下调（FDR<0.1）。有趣的是，我们发现四号染色体上的亚型转换丰富，在105个显著亚型中发现了38个。此外，在Chr.4qB3上跨越2.19 Mb的大MUP（主要尿蛋白）基因座是38种亚型中33种亚型的特异基因座。这些结果表明，mRNA亚型转换在肝脏衰老期间并不罕见，MUP位点是主要热点。
几项研究表明，ncRNA在衰老和细胞衰老中的变化具有潜在的功能意义[14，27——29]，大多数病例涉及miRNA。利用我们独特的注释参考数据库，我们试图确定小鼠肝脏中随年龄显著差异表达的所有ncRNA（即假基因、lncRNA、snoRNA、snRNAs和miRNAs）。我们总共发现162个ncRNAs显著差异表达（FDR<0.1；其他文件2：表S2）。其中，56个假基因、23个lncRNAs、1个miRNA、9个snRNAs，1个snoRNA、1个端粒酶RNA组分（TERC）和20个未分类的ncRNAs随年龄特异性上调。下调的有31个假基因、7个lncRNA、1个miRNA、3个snRNA和9个未分类的ncRNA。与我们之前关于全球表达变化的结果一致，一般来说，随着年龄的增长，更多的ncRNAs被显著上调，而不是下调。值得注意的是，由于在Illumina平台上对文库进行100 bp读取长度的测序时遇到固有的大小限制，我们仅发现两个显著差异表达的miRNAs（18-22mers）。为了验证这些新的ncRNA发现，我们对选择的13个ncRNA转录物进行了qPCR，包括类型、折叠变化和计数。对于那些随年龄增长而上调的患者，我们选择分析Mup-ps4型，里安（Rian），Mup-ps19型，2410018L13瑞克，A230056P14瑞克、和德鲁2而经验证的下调ncRNAsGm20577公司，格米16551，Gm2788公司，Gm5911公司，Gm5844型，米尔17hg、和Gm19316型在两个年轻人中(n个 = 3） 和旧的(n个 = 3） 小鼠肝脏。再次，我们将RNA-seq结果与qPCR结果进行了比较，发现ncRNA表达与皮尔逊相关系数大于0.94相关（附加文件7：图S1B），证实在我们老化的肝脏中发现的新的ncRNAs确实存在差异表达。
功能注释
为了将老年小鼠肝脏中的转录景观转化为功能结果，我们首先关注观察到的变化的mRNA成分，并使用DAVID（注释、可视化和综合发现数据库）[30]和GOrilla[31]，对显著上调和下调的转录本进行单独的功能注释分析。总计，340个基因本体（GO）注释显著上调（FDR<0.01）（附加文件4：表S4），而只有51个被下调（附加文件5：表S5）。然后我们使用了REVIGO，它利用语义相似度来解析GO注释，以删除多余的术语并可视化丰富的术语簇[32]. 衰老肝脏中显著上调的GO注释在免疫系统过程、免疫反应、应激反应、细胞激活、细胞因子生成调节和细胞死亡方面高度丰富（图)。GO注释随着年龄的增长而显著下调，富含脂质代谢、氧化还原过程、单羧酸代谢、脂肪酸代谢、类固醇生物合成和RNA修饰（图)。总之，这些发现表明，正如先前报道的那样，衰老的肝脏因免疫反应和炎症的增加以及代谢注释的减少而高度富集[5，23]同时也揭示了新的簇，如细胞因子产生的调节和RNA修饰。
衰老小鼠肝脏差异表达基因的GO术语富集。浓缩分析可视化为生物过程GO术语的MDS图(一)上调和(b条)在老龄小鼠肝脏中下调。根据空间（x，y）中语义相似性矩阵生成图。紧密相连的圆圈群表示关系更密切的术语。圆圈颜色和大小表示日志10
P（P）-价值
我们还对显著差异表达的亚型进行了基因本体分析（表)再次上调或下调。在这里，我们发现，上调亚型的相应基因导致免疫系统功能的八个过程高度丰富，最显著的是免疫反应（GO:0006955），而下调亚型分析的基因给出了一个重要的生物过程，即氧化还原（GO:0055114）。因此，亚型途径分析与基因本体分析证实了我们的发现。
表1
| GO术语 | 基因计数 |
P（P）-价值 | FDR值 |
|---|
| 上调监管 |
| 免疫应答 | 7 | 1.7 × 10−4
| 4.7 × 10−2
|
| 抗原加工和通过MHC II类表达外源性肽抗原 | 三 | 3.8 × 10−4
| 5.3 × 10−2
|
| 抗原处理和肽抗原通过MHC II类表达 | 三 | 3.8 × 10−4
| 5.3 × 10−2
|
| 抗原加工和通过MHC II类呈现肽或多糖抗原 | 三 | 5.5 × 10−4
| 5.1×10−2
|
| 氧化还原 | 7 | 1.1 × 10−3
| 6.3 × 10−2
|
| 抗原加工和外源性抗原的提呈 | 三 | 1.2 × 10−3
| 5.5 × 10−2
|
| 抗原加工和呈递肽抗原 | 三 | 1.9 × 10−3
| 3.3 × 10−2
|
| 监管下调 |
| 氧化还原 | 7 | 3.1 × 10−4
| 5.5 × 10−2
|
我们还发现许多差异表达的ncRNA可能在衰老的分子机制中发挥作用。第一个是整洁1，一种在我们的数据集中下调的lncRNA，它与核旁啄形成有关[33]以及mRNA的核保留[34]. 损失整洁1这很可能是我们之前描述的转录噪声增加的一种解释，也可能是核组织结构减少的原因。我们还观察到私人1，一种由第53页[35].私人1是一个同步基因座的一部分，该基因座是多种癌症的一个已知热点，也是七个带注释的miRNAs的宿主[36]已经证明减少了Myc公司引人注目的是，Myc公司在我们的数据集中下调约1.93倍(P（P） = 0.0036，FDR=0.127），尽管它几乎没有错过我们的截止值FDR<0.1。
最后，我们分析了我们的ncRNA数据集，以了解基因组内可能的空间关系。事实上，我们在小鼠Chr.12qF1上观察到三种ncRNAs，均在衰老肝脏中上调（附加文件8：图S2），它们彼此相邻。这些ncRNAs，梅格3，Rian（梅格8）、和Mirg公司是一组独特的lncRNA，已被鉴定为印迹位点的一部分Dlk1-二极管3并由母体等位基因表达[37]. 这些lncRNAs通过直接结合和招募多梳抑制复合物2（Prc2），通过基因表达合作积极调节细胞增殖[38]，就像情况一样梅格3和里安（Rian），或通过预测的微小RNA介导的细胞周期因子调节，例如Myc公司和第53页[37]，就像情况一样米尔格我们还发现了两种显著上调的新型lncRNA，希腊12602和格米12648，侧翼Cdkn2a公司(第16页墨水4a和第19页阿尔夫)小鼠Chr.4q基因座。虽然对这些特殊的笔录知之甚少，吉米12602直接位于下游（~150 kb）格米12648上游（约4.5 Mb）Cdkn2a公司这使得我们很容易推测这些lncRNAs可能对该位点施加一些调控，可能有助于衰老表型。总之，这些发现指出了一系列与年龄相关的ncRNAs是衰老途径和网络的调节器。
交互网络分析
我们的RNA-seq数据集的准确性和广度增加，使我们能够在老化肝脏中生成基因功能变化网络，超过使用DAVID或GOrilla观察到的网络。利用灵巧路径分析（IPA），我们从差异表达的蛋白编码基因和ncRNAs中生成了功能变化的相互作用网络。这导致了多重重叠的老化网络，从中我们可以区分三种主要的分子表型：炎症、增殖内稳态和脂质代谢（图，和).
癌症和炎症反应的年龄相关互动网络。每个基因根据表达的方向性进行着色；红色=上调，绿色=下调。每个基因下面的数字代表该特定基因的倍数变化（顶部）和FDR值（底部）。橙色线=预测激活，蓝色线=预测抑制，黄色线=预测不一致，灰色线=无预测效果
细胞增殖和细胞死亡的年龄相关相互作用网络。每个基因根据表达的方向性进行着色；红色=上调，绿色=下调。每个基因下面的数字代表该特定基因的倍数变化（顶部）和FDR值（底部）。橙色线=预测激活，蓝色线=预测抑制，黄色线=预测不一致，灰色线=无预测效果
脂质合成和脂质氧化的年龄相关相互作用网络。每个基因根据表达的方向性进行着色；红色=上调，绿色=下调。每个基因下面的数字代表该特定基因的折叠变化（顶部）和FDR值（底部）。橙色线=预测激活，蓝色线=预测抑制，黄色线=预测不一致，灰色线=无预测效果
在肝脏老化的多重网络中，最突出的交互网络是炎症和癌症（图)。这并不奇怪，因为这可能已经从基因本体分析中得出，并且之前也有报道[5，16]. 这与衰老细胞分泌的炎性细胞因子能够促进周围细胞的增生的观察结果一致[39，40]. 我们和其他人之前观察到老化肝脏中衰老细胞的增加[16，41，42]，它可以通过这些分泌的细胞因子促进癌症的增龄。相反，也有研究表明，浸润免疫细胞可以清除癌前衰老的肝细胞[43]因此，促进癌症发生的细胞分泌的相同分泌表型也可以阻碍肝脏肿瘤的发生。
IPA分析中出现的另一个显著的年龄相关网络是细胞增殖和细胞死亡网络。这表明了与年龄相关的增殖内稳态的丧失，这与一些报告一致，这些报告表明，衰老损害了肝脏再生的速度，而不是其再生能力[44]. 这两个连接但对立的网络（图)将显示在衰老中非常重要的基因联系在一起，例如Cdkn1a型，伊尔6R，百万像素12，排名前2a，Pdgfc公司，喇嘛3、和E2f1型[45——47]. 考虑到肝脏仍然是一个有丝分裂活跃的组织，这种相互作用强调了维持其正常再生功能所需的复杂相互作用。细胞增殖障碍引起的衰老表型是细胞衰老加剧。然而，IPA本身并不包含细胞衰老的正式途径，这本质上是一种应激反应，并根据衰老触发因素而变化，即基因毒性应激诱导、致癌基因诱导或复制诱导衰老。值得注意的是，参与癌症网络的许多基因也与细胞网络的增殖有关，这是可以预料的，因为癌症是细胞不受控制的增殖。
与年龄相关的变化的第三个主要相互作用网络，即脂质合成和脂质氧化之间的相互作用（图)，富含在衰老过程中下调的基因。显然，这个网络中最丰富的酶家族是细胞色素P450家族(Cyp8b1型，Cyp1b1周期，Cyp4a14细胞，Cyp26a1细胞)。虽然有证据表明人类和啮齿类动物的肝脏药物清除率降低，但这是由P450活性降低引起的可能性是有争议的[44]. 由于这些途径不能合作而产生的一种表型结果可能是肝脏中最常见的病理结果之一脂褐素积累的增加[48]. 这种表型可以反映出无法消除细胞废物。随着年龄的增长，肝脏代谢活性下降，随后脂褐素增加，部分原因可能是伴侣介导的自噬减少[49].
由于与ncRNA的相互作用相比，蛋白质与蛋白质之间的相互作用得到了很好的研究，通过同时分析蛋白质编码和ncRNA，由此分析产生的最强大的网络将只包含蛋白质与蛋白质的相互作用，基本上失去了较弱、研究较少的ncRNA相互作用。因此，我们选择仅分析具有年龄改变表达的ncRNA，以创建与年龄相关的ncRNA相互作用网络。随后，我们查看了我们的ncRNA相互作用网络中列出的蛋白质和基因，并筛选了那些仅在我们的数据集中差异表达的蛋白质和基因组。
通过这种方法只获得了四个相互作用网络，其中三个网络中只有一个ncRNA与另一个蛋白质或基因相互作用，与之前的ncRNA网络分析类似[29]. 只有一个网络在IPA数据库中有多个已知交互；因此，我们将重点放在这个网络上，该网络包括五个与其他蛋白质和/或基因具有已知相互作用的ncRNAs。通过结合ncRNAs和已知的随年龄变化的相互作用蛋白编码基因，并再次使用IPA进行分析，我们能够创建一个与年龄相关的ncRNA-蛋白编码相互作用网络。)参与了IFNG公司-介导的促炎症反应。有趣的是，这个网络将我们的新ncRNAs与某些基因联系起来，例如第53页，第7页，Ctss公司、和核因子κB所有这些之前都与哺乳动物的衰老有关[23，50，51]，并且他们与年龄相关的改变可能导致最常见的衰老表型炎症。
NcRNA与INFG介导的促炎症网络相关。NcRNA网络分析揭示了非规范转录参与的功能作用INFG公司-介导的促炎症反应。彩色节点表示数据集中转录表达的方向性；红色?=?上调监管，绿色?=?下调，白色?=?无明显变化。每个基因下面的数字代表对数2FoldChange（折叠更改）(顶部)和FDR值(底部)特定基因的
讨论
随着年龄的增长，肝脏的功能和病理变化已经得到了广泛的研究，但随着时间的推移，肝脏的生理功能下降的程度仍然存在争议[52，53]. 因此，在分子水平上全面评估变化至关重要，这至少可以部分解决这个问题。下一代测序技术为研究衰老的分子基础提供了前所未有的可能性。在研究基因表达（通常被认为是任何组织特异性表型中与年龄相关的关键变化的最直接反映）时，RNA测序的出现现在允许对老化转录组进行全面描述。正如我们在这里展示的小鼠肝脏，与之前应用的微阵列相比，实验细节显著增加。此前，基于微阵列的研究显示，衰老过程中差异改变的基因数量差异很大[8，9]有时根本没有[6]，我们的RNA-seq数据集显示，共有1102个蛋白编码转录物在年轻和老年小鼠的肝脏间差异表达，另外还有105个差异表达亚型和162个差异表达ncRNAs。由于迄今为止注释的此类RNA数量有限，后者无疑被低估了。尽管局限于两个极端年龄水平和一个小鼠品系，但我们目前的研究范围突出了衰老哺乳动物转录组变化的复杂性。事实上，如果考虑到多个年龄层之间可能存在的菌株差异和变异，这种复杂性可能会更高。然而，在可视化衰老转录组方面，这种前所未有的细节不仅使我们能够揭示表型随年龄变化的主要基因网络，还可以检验一些关于转录保真度丧失可能是衰老最终原因的非常基本的假设。
肝脏老化转录组的一个明显特征是个体变异增加。以前已经使用不同的方法提供了随机成分在基因表达随年龄变化中重要性的证据[20，54]但我们的研究是第一个直接证据，证明个体动物的转录组会因衰老过程而发生显著差异，而不仅仅是个体基因之间的差异。事实上，正如我们所示，衰老伴随着随机变异或转录噪声的增加，这在所有RNA类别中都很明显。我们发现，一般来说，年龄较大的动物无论转录长度如何，变异系数都较高，这证实了年龄相关的变异是全基因组的。然而，我们确实观察到，与高度丰富的转录物相比，低表达的转录物，无论年龄大小，都具有更高的变异系数。这可能是由于小RNA物种固有的不稳定性，因为较长的高表达转录物往往更稳定，不易代谢，这可能是因为高阶结构或因为更多的蛋白质能够结合转录物并保护其免受内源性核糖核酸酶的影响[55，56]. 在这方面，令人惊讶的是，我们发现RNA修饰是一种在我们的数据集中下调的富集途径，这可能是老化转录组倾向于具有更高变异性的原因。此外整洁1可能导致3′UTR中含有反向Alu重复序列的mRNA之间的变异[34]. 因此，不能排除特定途径最终控制衰老转录组随机变化的可能性，可能是系统反应的一部分。
基因表达的一个长期假设是，随着生物体年龄的增长，基因组失去了有效调节基因的能力，导致基因表达的整体放松或降低[19]. 我们的数据并没有证实这种基因转录控制缺失的普遍发生，因为我们没有观察到从幼年到老年动物转录组的基因组覆盖率急剧增加。然而，为了明确排除这一假设，可能需要进行非常深入的排序，即超过10亿次读取[18]. 或者，关于基因表达降低的报告仅限于选定的少数组织，因此观察结果可能是组织或细胞类型特异性的函数。
试图全面描述老年人转录环境的一个主要挑战是将改变的mRNA表达水平与改变的ncRNAs联系起来，最近，ncRNA被强调为转录组和衰老过程中的关键调节成分[14，57]. 我们的结果显示，我们发现大约13%的转录物随着年龄变化而改变，是ncRNAs的转录物。尽管这些ncRNA中的许多以前已经被报道和研究过，例如lncRNA梅格3，里安（Rian）、和整洁1，据我们所知，这些都与衰老无关。此外，值得注意的是深蓝色-Dio3小鼠中的基因座对应于其基因组中miRNAs的最大热点。有趣的是，之前的一份报告显示，起源于该集群的八种miRNA在老年骨骼肌中下调[29]. 再加上我们的发现lncRNAs(Meg3、Rian、Mirg)由于该基因座在衰老肝脏中上调，我们可以将该基因座定义为衰老中的细胞型特异性调节热点。该基因座是否在衰老过程中起主要调节作用尚待阐明，但可以通过测试靶向的多个蛋白质和/或通路是否在衰老组织中实际受到影响来研究。除了已知的ncRNAs外，我们还发现了新的lncRNA转录物随年龄差异表达，例如那些位于Cdkn2a公司轨迹。鉴于Cdkn2a公司这些侧翼lncRNAs可能为调控细胞周期提供假定的靶点。随着该领域的扩展，对每种新型ncRNA的功能表征，更多关于此类ncRNA在衰老中的作用的证据将变得更加明显。总之，我们的研究结果首次证明了ncRNA也可以塑造衰老小鼠肝脏的景观。
最后，我们在本研究中提供的老化肝脏转录组的综合观点使我们能够确定与肝脏老化相关的主要功能网络。在这方面，我们的结果揭示了三组主要的相互作用网络：炎症和癌症、增殖稳态和脂质代谢。最突出的一个是炎症反应，这也得到了多种新的ncRNAs对肝脏衰老的支持INFG公司-介导的促炎症反应。长期以来，炎症加剧与衰老有关[58]我们和其他人之前已经提供了证据，证明这是小鼠的主要促衰老表型[59]. 衰老小鼠肝脏中第二组改变的基因功能网络涉及相互连接的细胞增殖和死亡网络。退行性细胞丢失和再生之间平衡的系统性失调与有关老年动物和老年人肝脏再生受损的报告一致。最后，第三个主要变化网络似乎以脂质合成和脂质氧化为中心，指向细胞内损伤聚集物增加，最显著的是脂褐素。然而，我们的数据也表明细胞色素P450家族水平的改变，这种失调可能是衰老肝脏药物代谢下降的原因[53].
结论
综上所述，我们目前的工作和其他人以前的工作[14，15]，展示了RNA测序在深度上如何解决哺乳动物衰老的分子基础的基本问题。我们发现，衰老不太可能伴随着组织特异性基因表达谱的显著丢失；我们没有发现基因表达降低或转录的基因组比例随机增加的证据。然而，我们的数据揭示了基因表达模式的广泛变化，这些变化受随机变化的影响，个体变异显著增加。我们还证明，RNA-seq准确性的提高使我们能够在转录水平上更好地捕获主要衰老表型，从而揭示衰老及其相关疾病后遗症的重要分子机制。
方法
动物和组织收集
所有涉及动物的程序都得到了阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。三只4个月龄和28个月龄的雄性Balb/C小鼠来自美国国家老龄研究院。处死小鼠，并立即将采集的肝脏样本速冻。本研究中使用的所有小鼠都被确定为无肿瘤，并且在处死时也没有其他明显的宏观病理学迹象。
转录组测序
定向RNA测序文库和原始测序数据之前由我们生成[16].
分析和统计
根据新剪接的默认设置，使用GSNAP v2013-01-23，使用NCBI Build 37/mm9参考基因组，对齐通过过滤器序列[60]. 然后对照自定义注释数据库参考对齐，该数据库结合了ENSEMBL（版本71）、GENBANK/NCBI（版本196）；REFSEQ（版本60）、VEGA/HAVANA（版本51）；和MGI（GRCm38）。可根据要求提供自定义注释数据库。然后，使用基于Python的HTSeq对唯一对齐的读取进行量化，以实现配对读取（用于基于片段的量化），并使用交叉标准模型，随后使用R中的DESeq包进行分析[61]. 对于异构体分析，使用Cufflinks/CuffDiff软件包对Ensembl数据库的配对输入设置进行校准读取量化，然后使用R中的CummeRbund进行分析[26]. 对于所有分析P（P）-值<0.05被认为是显著的P（P）-使用Benjamini-Hochberg校正对数值进行调整，其中截止FDR值<0.1被认为是显著的。
基因本体与网络分析
GO分析使用GOTERM_BP_FAT的DAVID分析软件进行，使用EASE得分<0.05，基因集计数至少为两个，功能通路被视为显著[30]或GOrilla，其中每个注释中需要考虑四个基因，并且q值截止值<0.01[31]. 使用REVIGO可视化基因本体丰富，相似性截止值设置为0.7[32]. 对于网络分析，使用Ingenuity Pathway analysis（Ingenuith®Systems，网址：www.intenuity.com)。IPA还用于生成ncRNAs基因集网络交互的图形。在UCSC基因组浏览器中执行数据可视化[62].
定量PCR
使用SuperScript III第一链合成试剂盒（Invitrogen），使用50 ng随机六聚体将年轻和老年小鼠肝脏的总RNA转化为cDNA。qPCR使用40 ng cDNA，使用ABI StepOne Plus系统进行TaqMan®（ABI）或SYBR®绿色（ABI。有关使用的Taqman引物分析和自定义非编码引物分析的完整列表，请参阅附加文件6：表S6。所有计算均使用ΔΔCT方法进行，TaqMan分析归一化为真核18s rRNA，SYBR分析归一化为GAPDH，所有生物复制值代表技术三倍的平均值。使用线性回归计算对数的皮尔逊相关系数2RNA-seq和qPCR之间的foldchange值。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款AG17242和格伦医学研究基金会的支持。我们要感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的表观基因组学核心和计算基因组学核心提供的测序和计算建议。我们也要感谢铃木雅子博士和苏优新博士提出的有益意见和建议。
其他文件
附加文件1：表S1。（45K，xlsx）每个年轻和老年肝脏样本的测序和比对指标。（XLSX 44 kb）
附加文件2：表S2。（288K，xlsx）表达水平、折叠变化和生物型在年轻和老年肝脏中的每种转录本都有显著差异。（XLSX 287 kb）
附加文件3：表S3。（73K，xlsx）年轻人和老年人肝脏的主要差异表达亚型列表。（XLSX 73 kb）
附加文件4：表S4。（198K，xlsx）用于绘制图的上调差异表达基因的前GO项列表.（XLSX 198 kb）
附加文件5：表S5。（61K，xlsx）用于绘制图的下调差异表达基因的前GO项列表.（XLSX 60 kb）
附加文件6：表S6。（53K，xlsx）RNAseq验证中使用的引物集列表。定制的ncRNA引物配有正向和反向引物，而TaqMan分析ID用于所有其他引物。（XLSX 52 kb）
附加文件7：图S1。（123K，pdf格式）RNAseq验证。（a） 使用TaqMan引物/探针集对13个归一化为真核生物18s rRNA的选定转录物进行qPCR验证。（b） 13个差异表达非编码RNA的qPCR验证GAPDH公司mRNA使用定制的引物对每个新的ncRNA进行标记。对于这两者，RNA-seq和qPCR值均绘制为平均值（Old，n个 = 三；年轻，n个 = 3） 日志2FoldChange（Old/Young）值，其中红线表示线性回归的斜率和皮尔逊相关系数的平方(第页)。插图是等效对应值的条形图。（PDF 122 kb）
附加文件8：图S2。（64K，pdf格式）代表子集(梅格3，里安（Rian）和Mirg公司)母体表达和印迹的ncRNA位点，深蓝色-Dio3，位于UCSC基因组浏览器中的第12号染色体上，覆盖来自RNA-seq数据集的对齐读取。蓝色=意义配对-end，红色=反义配对-end；比例=100 kb。（PDF 64 kb）
脚注
相互竞争的利益
作者声明没有利益冲突。
作者的贡献
构思并设计了实验：RW和JV。执行实验：RW、BM、ML、SM和DZ。分析数据：RW和JV。撰写手稿：RW和JV。所有作者阅读并批准了最终手稿。
工具书类
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