介绍
为了生长和分裂，细胞需要持续提供营养物质来支持能量生产和大分子合成(凯恩斯等人，2011年). 尽管哺乳动物细胞被各种生物能量底物包围，但它们优先代谢低分子量的营养物质，如葡萄糖和氨基酸。然而，蛋白质是体液中最丰富的有机成分，其结合氨基酸含量超过了人体血浆中单体氨基酸的数量几个数量级。因此，如果细胞能够获得，细胞外蛋白有可能作为重要的替代营养素发挥作用。
后生动物有机体的细胞受到外部线索的指示，参与营养吸收。生长因子信号通路不仅刺激细胞周期进展，还促进营养吸收和启动合成代谢，从而确保合成大分子的构件的充分可用性，以增加细胞质量(汤普森，2011). 一些生长因子导向的信号通路通过增加代谢物转运蛋白的表达或表面呈现来增强细胞对低分子量营养素的吸收。例如，PI3-激酶/Akt和Ras信号通路都能增强葡萄糖摄取(曼宁和坎特利，2007年;Pylayeva-Gupta等人，2011年;Yun等人，2009年). Ras GTPases还可以通过大胞饮作用（一种进化上保守的非选择性内吞作用形式）触发细胞外大分子的内化(Bar-Sagi和Feramisco，1986年;Mercer和Helenius，2009年). 大胞饮作用使单细胞变形虫真核生物能够依靠细胞外大分子生存，但它是否在后生动物细胞的营养获取中起作用尚不清楚(Amyere等人，2002年). 最近的研究表明，通过促进大胞饮作用，致癌K-Ras信号可以降低增殖癌细胞对外源性谷氨酰胺供应的依赖性(Commisso等人，2013年). 这表明细胞外蛋白的分解代谢可以提供补体底物，使哺乳动物细胞维持线粒体生物能量学并抑制凋亡。
当生长因子调节营养素吸收时，细胞内营养水平可以通知细胞信号状态。哺乳动物雷帕霉素复合物激酶靶点1（mTORC1）是一种中枢调节因子，它将细胞营养水平与生长因子信号传导的输入相协调，以刺激合成代谢和生长(Ma和Blenis，2009年;Shimobayashi和Hall，2014年). mTORC1的活性严格依赖于足够水平的细胞内氨基酸，这些氨基酸诱导mTORC2向溶酶体膜募集(Sancak等人，2010年). 在那里，mTORC1可以被生长因子信号的进一步输入激活。活化的mTORC1磷酸化多个靶点，共同提高生物量的生成。例如，通过S6激酶（S6K）和4E结合蛋白（4E-BP）的磷酸化，mTORC1增加了5′cap依赖性蛋白的翻译(Ma和Blenis，2009年). 相反，通过抑制Unc51样激酶1/2（Ulk1/2），mTORC1抑制自噬，从而阻止细胞物质降解(他和克林斯基，2009年;2010年水岛). 通过这些手段，mTORC1促进细胞生长，以响应提供有利生长信号和充足营养供应的环境。
在这里，我们表明mTORC1抑制哺乳动物细胞利用细胞外蛋白作为氨基酸来源支持增殖的能力。即使在具有组成性激活的大胞饮作用的Ras突变细胞中，mTORC1也能阻止从环境中内化的蛋白质的降解。抑制mTORC1可提高细胞外蛋白的溶酶体分解代谢，并在氨基酸缺乏期间促进细胞增殖在体外以及在血管化不良的肿瘤区域体内通过阻止细胞外蛋白的营养利用，mTORC1活性将细胞生长与游离氨基酸供应联系起来。
结果
Ras诱导的细胞外蛋白质大胞饮作用可在必需氨基酸饥饿过程中维持细胞活力和增殖
我们首先通过确定细胞外蛋白的生理水平是否挽救了在缺乏葡萄糖或不同种类氨基酸的情况下培养的细胞的活力和/或增殖，来询问蛋白质中所含的氨基酸或己糖是否可以支持细胞代谢。为了研究K-Ras信号的激活是否改变了细胞代谢细胞外蛋白的能力，我们比较了含有野生型K-Ras或组成活性K-Ras的永生化小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）G12D系列等位基因。白蛋白是血浆和间质液中的主要蛋白质，其含量在2-5%之间。为了模拟细胞外液中富含蛋白质的成分，培养基中添加了10%的透析胎牛血清±3%的白蛋白。当置于无葡萄糖培养基中时，野生型和K-RasG12D系列MEF停止增殖，无论是否存在3%的白蛋白(). 当细胞遭受非必需氨基酸（NEAA）饥饿时，补充白蛋白可以适度提高细胞的生存能力。当细胞置于缺乏单一NEAA、谷氨酰胺、白蛋白的培养基中时，补充K-RasG12D系列MEF将增加单元格数量，尽管幅度较小。
细胞外蛋白的生理水平为野生型和K-Ras突变细胞提供营养价值（A）野生型和杂合型K-Ras的细胞数G12D系列培养第3天在培养基中培养的MEF为±3%白蛋白，缺乏不同的营养物质，如所示[葡萄糖、非必需氨基酸（NEAA）、谷氨酰胺、必需氨基酸（EAA）、亮氨酸]。虚线表示起始单元格编号。#低于检测极限。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（B）野生型和K-Ras的生长曲线G12D系列无亮氨酸培养基中的MEF为±3%白蛋白。（C）表达肉豆蔻酰化Akt1（myr-Akt1）的野生型MEF在无亮氨酸培养基±3%白蛋白中的生长曲线。
数据表示为平均值±STDEV（n=3）。另请参见图S1.
与上述结果相反，在缺乏所有必需氨基酸（EAAs）的培养基中，添加3%的白蛋白可显著挽救细胞存活(,第1部分). 当缺乏一种单一的EAA，即亮氨酸时（亮氨酸是白蛋白和哺乳动物蛋白质组中最丰富的氨基酸），野生型MEF的生存能力通过补充白蛋白而完全恢复(). K-Ras公司G12D系列MEF能够在含有3%白蛋白的无亮氨酸培养基中持续增殖，细胞数量连续几天增加(). 由于生长细胞必须从外源获得亮氨酸以支持蛋白质合成，这些结果表明K-RasG12D系列MEF可以从细胞外蛋白中获得亮氨酸。然而，我们注意到，与氨基酸补充培养基相比，氨基酸缺乏培养基补充白蛋白只能维持有限的细胞增殖().
除Ras外，PI3-激酶/Akt信号是指示细胞参与营养吸收的第二个关键途径(曼宁和坎特利，2007年). 然而，表达肉豆蔻酰化Akt 1或PTEN shRNA并不能改善细胞对无亮氨酸培养基补充白蛋白的反应(,S1B级). 相反，诱导组成活性K-Ras的表达G12伏或H-RasG12伏在这些条件下支持扩散(图S1C、D)与我们在MEF中观察到的内源性K-Ras相一致G12D系列等位基因。组成性激活的Ras信号在富含蛋白质但氨基酸缺乏的培养基中维持适度增殖的能力与Ras GTPases增强大胞饮作用的共享能力一致。
致癌Ras信号在饥饿期间维持细胞活性的一个机制是增加自噬，从细胞内大分子的分解代谢中恢复营养(Pylayeva Gupta等人，2011年). 为了研究自噬在利用细胞外蛋白作为营养源的细胞生长中的作用，我们确定了对自噬起始激酶Ulk1/2的需求。表达K-Ras的野生型和Ulk1/2双敲除（DKO）MEFG12伏或H-RasG12伏当添加3%白蛋白作为外源氨基酸源时，可在无亮氨酸培养基中维持增殖(图S1E、F). Ulk1/2的缺失并不影响细胞外蛋白依赖性细胞的生长。相反，Ulk1/2 DKO MEF的增殖速度明显高于野生型对照。因此，不仅自噬起始激酶Ulk1/2对于利用细胞外蛋白作为营养物是不必要的，而且Ulk1/2依赖性自噬的丧失实际上提高了Ras突变细胞在这些营养条件下增殖的能力。
接下来，我们询问白蛋白是否支持含有所有EAA减少量的培养基中的细胞增殖。当EAA浓度为全培养基、野生型和K-Ras中浓度的5%时G12D系列随着时间的推移，MEF停止增殖并失去生存能力(). 添加3%白蛋白可提高野生型MEF的存活率，但不支持其增殖。相反，补充白蛋白导致K-Ras增殖显著增加G12D系列MEF公司。由于10%透析血清中提供的蛋白质不足以在EAA饥饿期间促进细胞增殖，我们测定了在这些条件下增殖所需的白蛋白浓度。在低EAA培养基中培养的野生型MEF的生存能力随着白蛋白水平的增加而提高（1–3%）(图S2A). K-Ras公司G12D系列当添加至少1%的白蛋白时，MEF可以维持增殖，并且随着白蛋白浓度增加到3%，MEF的增殖率逐渐增加(). 因此，必须在生理水平上提供白蛋白，以支持细胞在EAAdeficient培养基中的生存和生长。这可能解释了为什么细胞培养中常用的低蛋白培养基配方不足以使MEF在EAA饥饿期间增殖。
EAA饥饿过程中细胞外蛋白质的大量胞饮和溶酶体降解支持Ras突变细胞的生长（A） 野生型和K-Ras的生长曲线G12D系列含EAAs的氨基酸缺乏培养基中的MEF为完全培养基中±3%白蛋白水平的5%。（B）K-Ras生长曲线G12D系列含5%EAAs的氨基酸缺乏培养基中的MEF，补充有指示的白蛋白浓度。（C）K-Ras中白蛋白的摄取和细胞内降解G12D系列MEF，通过荧光标记的BSA和DQ-BSA评估。蛋白酶抑制剂：2μM胃蛋白酶抑制素A，2μM E-64，10μM亮氨酸肽。比例尺=10μm。（D）K-Ras生长曲线G12D系列无亮氨酸培养基中的MEF为±3%白蛋白和蛋白酶抑制剂，如（C）所示。（E）K-Ras的细胞数G12D系列在无亮氨酸培养基±3%白蛋白和25μM EIPA中培养第3天的MEF。虚线表示起始单元格编号。***p<0.001。
数据表示为平均值±STDEV（n=3）。另请参见图S2.
为了描述细胞如何从细胞外蛋白中获得亮氨酸，使用组成荧光白蛋白和使用降解时发出荧光的自猝灭白蛋白（DQ-BSA）的细胞内白蛋白蛋白水解来研究细胞对白蛋白的摄取(Reis等人，1998年). 摄入标签1.5小时后，K-RasG12D系列MEFs显示出由白蛋白和DQBSA标记的多种细胞内结构(). 添加溶酶体蛋白酶抑制剂不会干扰白蛋白的内化，但会导致DQ-BSA荧光的强烈降低。接下来，我们询问在亮氨酸饥饿期间是否需要溶酶体白蛋白降解来支持生长。事实上，溶酶体蛋白酶抑制剂或溶酶体酸化抑制剂氯喹抑制K-Ras的增殖G12D系列含3%白蛋白的无亮氨酸培养基中的MEF(,S2B型). Ras GTPases可通过大胞饮作用促进细胞对大分子的摄取(Bar-Sagi和Feramisco，1986年). 一直以来，K-RasG12D系列MEF的大松果体细胞活性高于野生型对照(图S2C). 为了研究这种内吞途径是否有助于蛋白依赖性生长，用钠处理细胞+/H（H）+交换抑制剂EIPA，阻断大胞饮作用，但不阻断其他内吞途径(West等人，1989年). EIPA处理显著降低了无亮氨酸培养基+3%白蛋白中的细胞增殖，但当向培养基中添加游离亮氨酸时，细胞增殖恢复(). 总之，这些数据表明，在EAA饥饿期间，细胞外蛋白的大松果体摄取和溶酶体降解可以提供营养益处。
细胞外蛋白的分解代谢诱导溶酶体募集和mTORC1的激活
细胞可以通过mTORC1途径感知EAA，该途径将氨基酸水平与生长因子信号的输入结合起来，以促进细胞生长(Ma和Blenis，2009年;Shimobayashi和Hall，2014年). 当细胞置于无EAA培养基中时，mTORC1磷酸化下游靶点的能力受到抑制。为了测试在没有EAA的情况下，细胞外提供的蛋白质的分解代谢是否可以恢复mTORC1活性，将MEF置于EAA饥饿1小时后，使mTORC2失活。然后添加含有EAA或不同浓度白蛋白的新鲜培养基，并通过Western blotting对磷酸化S6K1进行mTORC1再活化评估。补充含有1-3%白蛋白的无EAA培养基导致野生型和K-Ras中S6K1磷酸化的浓度依赖性增加G12D系列MEF被mTOR抑制剂torin 1完全抑制(图S3A). 因此，生理水平的白蛋白可以激活mTORC1通路。尽管是野生型和K-RasG12D系列MEF对EAAs、K-Ras的反应显示出类似的mTORC1激活G12D系列添加3%白蛋白后，MEF显示出较高的mTORC1活性(). 类似地，H-RasG12伏表达增加mTORC1活性以响应白蛋白(图S3B). 相反，通过shRNA-介导的PTEN耗竭提高PI3-激酶/Akt信号转导增加EAA对mTORC1的激活，但不增加白蛋白(图S3C). 这些数据表明，Ras信号通路通过氨基酸敏感分支而非生长因子调节分支增强mTORC1激活，以响应白蛋白刺激。
内化蛋白质的溶酶体降解激活mTORC1通路（A）野生型和K-Ras中mTORC1激活的比较G12D系列MEF，由Western Blotting（WB）分析。MEF无EAA 1 h，然后置于含有EAA或3%白蛋白的培养基中，或新鲜无EAA培养基中4 h。（B）K-Ras中mTORC1激活的时间进程G12D系列EAA饥饿1小时后用3%白蛋白刺激的MEFs，通过WB分析。（C）——（F）WB分析了抑制溶酶体功能或巨噬细胞增多对白蛋白依赖性mTORC1激活的影响。K-Ras公司G12D系列MEF缺乏EAA 1 h，然后放置在含有EAA或3%白蛋白的培养基中，或新鲜的无EAA培养基中3 h。（C）巴非霉素A1，（D）溶酶体蛋白酶抑制剂（10μM胃蛋白酶抑制素A，20μM E-64），（E）EIPA（Na+/H（H）+在饥饿开始时添加交换抑制剂）或（F）IPA-3（PAK1抑制剂）。另请参见图S3.
细胞外提供的EAA通过跨膜转运蛋白迅速被细胞吸收，并在几分钟内激活mTORC1(Nicklin等人，2009年). 为了研究细胞外蛋白激活mTORC1通路的动力学，随着时间的推移，对白蛋白刺激引起的mTORC1re-activate进行跟踪。EAAs的再添加导致mTORC1靶点如S6K1、Grb10和Ulk1以及S6K靶核糖体蛋白S6的快速磷酸化(,S3D系列) (Kang等人，2013年;Nicklin等人，2009年). 相反，作为对白蛋白的反应，这些蛋白的mTORC1依赖性磷酸化仅在2小时后恢复，4小时后达到最大水平。因此，细胞外蛋白激活mTORC2途径的速度比EAA慢，这表明这些营养素参与了不同的细胞过程。
接下来，我们询问细胞外蛋白激活mTORC1是否需要大量胞饮作用和溶酶体蛋白水解。溶酶体酸化抑制剂巴非霉素A1和氯喹不会干扰EAA对mTORC1的激活(,S3E系列). 相反，即使低浓度的抑制剂也会强烈抑制蛋白依赖性mTORC1的激活。同样，蛋白酶抑制剂阻断了mTORC1的激活，以响应白蛋白的刺激(). 为了确定大胞饮症的相关性，包括钠在内的药物性大胞饮抑制剂的作用+/H（H）+交换抑制剂EIPA、Pak1抑制剂IPA-3和肌动蛋白抑制剂茉莉糖苷和细胞松弛素D(Mercer和Helenius，2009年)进行了调查。所有这些抑制剂都通过添加白蛋白而不是通过重新添加EAAs来强烈降低mTORC1的活化(,S3F，G中).
氨基酸通过诱导mTORC1转位到溶酶体膜来向其发送信号，在溶酶体细胞膜中，它可以被生长因子信号的进一步输入激活(Sancak等人，2010年). 为了确定细胞外蛋白是否通过诱导其向溶酶体募集来类似地调节mTORC1，K-RasG12D系列MEF被EAA饥饿1h，用EAA或3%白蛋白喂养，用免疫荧光监测mTOR激酶的亚细胞定位。在EAA缺乏的细胞中，mTOR分布在细胞质中。添加白蛋白后，mTOR定位于溶酶体膜蛋白LAMP2标记的点状结构，类似于重新添加游离EAA时观察到的模式(). 用巴非霉素A1抑制溶酶体蛋白水解可完全阻断mTOR向溶酶体膜的运动，以响应白蛋白而非EAAs().
内化蛋白的溶酶体降解诱导mTOR溶酶体募集（A）通过对mTOR和溶酶体标记LAMP2的免疫荧光分析，通过细胞外蛋白或EAAs进行mTOR溶酶体招募。K-Ras公司G12D系列MEF缺乏EAA 1小时，然后置于含有EAA或3%白蛋白的培养基中，或置于新鲜的无EAA培养基中2小时。（B）抑制溶酶体蛋白水解对K-Ras中细胞外蛋白mTOR溶酶体募集的影响G12D系列MEF按（A）进行处理和分析。EAA饥饿开始时添加200 nM巴非霉素A1。（C）RagA/B敲除对K-Ras溶酶体mTOR募集的影响G12D系列MEF按（A）进行处理和分析。比例尺=10μm。另请参见图S4.
EAAs通过一种需要溶酶体相关Rag GTP酶的机制诱导mTORC1向溶酶体膜的运动(Kim等人，2008年;Sancak等人，2008年). 相反，谷氨酰胺可以在Rag非依赖机制中激活mTORC1(Jewell等人，2015年). 为了研究白蛋白溶酶体蛋白水解对mTORC1的激活是否依赖于Rag GTPases，我们确定了shRNA介导的RagA和RagB敲除的后果。RagA/B的耗尽导致mTOR在整个细胞液中的扩散定位，无论介质中是否含有白蛋白或EAA(). 一直以来，白蛋白和EAA都不能诱导RagA/B敲除细胞中S6K1的mTORC1依赖性磷酸化(图S4). 因此，细胞外蛋白和EAA通过Rag依赖机制激活mTORC1。
mTORC1抑制依赖细胞外蛋白作为营养素的细胞生长
为了研究Ras下游有助于细胞利用细胞外蛋白作为氨基酸来源的信号通路，我们测定了MEK1/2、PI3-激酶、酪氨酸激酶和mTOR抑制剂对K-Ras增殖的影响G12D系列MEF在无亮氨酸培养基+3%白蛋白中。令我们惊讶的是，在添加白蛋白的无亮氨酸培养基中，mTOR抑制并没有延缓细胞增殖。相反，每种mTOR抑制剂，包括mTOR/PI3-激酶双抑制剂，在这些条件下都能促进增殖(左侧面板，图S5A)尽管它们有效地阻断了mTOR信号活动(). 相反，MAP激酶、PI3-激酶或酪氨酸激酶信号的抑制适度降低了无亮氨酸培养基中的细胞增殖(左侧面板）。这些激酶抑制剂在含亮氨酸介质中的作用不同，其中mTOR抑制剂在抑制细胞增殖方面特别有效(右侧面板）。接下来我们研究了mTOR抑制剂对细胞生长的浓度依赖性影响。将torin 1的浓度从50 nM提高到300 nM，可逐步改善无亮氨酸培养基+3%白蛋白中的细胞增殖，这表明当细胞使用白蛋白作为亮氨酸来源时，细胞增殖与mTOR信号活性呈负相关(). 相反，当细胞外提供游离亮氨酸时，细胞增殖显著提高，但随着都灵1剂量的增加而降低(图S5B). 同样，torin 1治疗诱导了几个含有激活Ras突变的癌细胞株在无亮氨酸培养基+3%白蛋白中增殖，而在含亮氨酸培养液中则显著降低了它们的增殖(图S5C). 由于白蛋白提供了所有蛋白质生成氨基酸的混合物，我们还检查了它是否可以在缺乏其他单一EAA（异亮氨酸、赖氨酸或精氨酸）的培养基中支持细胞的存活/生长。事实上，生理水平的白蛋白挽救了细胞的活力，并且圆环蛋白1对mTOR信号的抑制诱导细胞在缺乏这些EAAS的培养基中强劲增殖(图S5D).
mTORC1信号是细胞外蛋白依赖性生长的负调控因子（A）K-Ras的细胞数G12D系列在含亮氨酸或无亮氨酸培养基+3%白蛋白和以下抑制剂中培养第3天的MEFs：MEK1/2（1μM PD0325901，50μM PD98059）、PI3-激酶（25μM LY294002，2μM沃特曼）、酪氨酸激酶（50μM染料木素）、mTOR（50 nM雷帕霉素，250 nM托林1），mTOR/PI3-激酶（0.5μM BEZ235，0.5μM GDC0980）。虚线表示起始单元格编号。（B）K-Ras中mTOR、PI3-激酶和MAP激酶途径的活性G12D系列MEF在无亮氨酸培养基+3%白蛋白中培养1天，WB分析。抑制剂如（A）所示（C）K-Ras生长曲线G12D系列无亮氨酸培养基中的MEF为±3%白蛋白，显示了torin 1的浓度。（D）K-Ras生长曲线G12D系列在无亮氨酸培养基±3%白蛋白中表达针对猛禽、立克次体或对照的shRNA的MEF。（E）K-Ras的亮场图像G12D系列在无亮氨酸培养基±3%白蛋白中培养第4天，MEF表达针对猛禽、立克次体或对照的shRNA。比例尺=50μm。
数据表示为平均值±标准差（n=3）。另请参见图S5.
mTOR激酶存在于两种不同的复合物中：mTORC1，它根据营养和生长因子信号调节生长；mTORC2，它是PI3-激酶信号通路的组成部分(Shimobayashi和Hall，2014年). 为了分析它们在调节蛋白依赖性生长中的作用，在K-Ras中，必需的mTORC1成分Raptor或必需的mTORC2成分Rictor被耗尽G12D系列通过shRNA-介导的击倒获得MEF(图S5E). 无论是否存在3%的白蛋白，在缺乏亮氨酸的情况下，Rictor基因敲除都不会促进细胞增殖(). 相反，猛禽的击倒导致K-Ras的增殖急剧增加G12D系列MEF在补充白蛋白的无亮氨酸培养基中，细胞几乎每天经历一个群体的倍增。因此，mTORC1是依赖细胞外蛋白作为氨基酸来源的细胞生长负调控因子。
mTORC1抑制促进内化白蛋白溶酶体降解
我们推断，从细胞外蛋白中回收亮氨酸构成了无亮氨酸培养基中细胞生长的速率限制步骤。这表明，mTORC1通过限制细胞获得细胞外蛋白的氨基酸含量来抑制细胞外蛋白依赖性生长，可能是通过阻止细胞内吞或溶酶体降解来实现的。为了区分这些可能性，我们首先测试了mTORC1抑制是否增加了细胞外大分子的内化。然而，无论是torin 1还是Raptor基因敲除都没有提高细胞对荧光标记右旋糖酐或白蛋白的摄取，这表明mTORC1信号传导并不抑制细胞外大分子的大量内化(图S6A–C).
接下来我们研究了mTORC1抑制是否影响内化蛋白的溶酶体降解。K-Ras公司G12D系列将MEF置于含有DQ-BSA的培养基中，并标记溶酶体，溶酶体裂解蛋白±torin 1，随着时间的推移跟踪DQ-BSA溶酶体蛋白水解产生的荧光信号。mTOR抑制导致DQ-BSA的荧光去猝灭显著增加，表明其降解增强(). 类似地，通过猛禽击倒抑制mTORC1可增加细胞DQ-BSA荧光(图S6D). 用氯喹或溶酶体蛋白酶抑制剂阻断溶酶体蛋白水解，可消除都灵1处理细胞中DQ-BSA的降解(图S6E). 因此，mTORC1负调控从环境中摄取的蛋白质的溶酶体降解。
mTORC1抑制内化蛋白溶酶体降解（A）K-Ras中溶酶体DQ-BSA降解的时间历程G12D系列存在或不存在250 nM圆环1的MEF。（B）（A）所示细胞的DQ-BSA荧光定量。（C）DQ-BSA在野生型和K-Ras中的溶酶体降解G12D系列在250 nM圆环蛋白1存在或不存在的情况下，摄入DQ-BSA 6小时后的MEF。（D）（C）中所示细胞的DQ-BSA荧光定量。
数据表示为平均值±STDEV（n≥5个视野，每个视野>20个单元格）。*p<0.05，***p<0.001。比例尺=20μm。另请参见图S6.
为了进一步研究Ras和mTORC1信号如何调节内化蛋白的溶酶体蛋白水解，我们比较了mTORC2抑制和K-Ras激活的作用。在野生型MEFs中用鸟嘌呤1抑制mTORC1导致DQ-BSA荧光显著增加(). 类似地，MEF含有构成活性K-RasG12D系列该突变表现出比野生型MEF更高的DQ-BSA降解。将torin 1处理与构成性K-Ras激活相结合具有协同作用，并增加DQ-BSA蛋白水解，几乎是单独处理的四倍。因此，K-Ras增强了细胞吸收和降解细胞外蛋白的能力，而mTORC1则专门限制其溶酶体降解。
mTORC1信号可能阻止内化蛋白降解的一个机制是抑制参与内吞或溶酶体生物发生的基因的表达(Shimobayashi和Hall，2014年). 为了研究mTORC1抑制剂是否通过转录变化的次级效应增强了DQ-BSA降解，我们确定了mTORC 1抑制剂发挥作用的时间范围。预处理K-RasG12D系列MEF中加入torin 1 6 h或16 h并没有增加DQ-BSA降解率(图S6F). 此外，当放线菌素D或雷公藤内酯醇阻断转录时，圆环蛋白1诱导的DQ-BSA荧光增加不受影响(图S6G). 因此，内化蛋白的溶酶体蛋白水解是对mTORC1抑制的直接细胞反应。在营养充足的条件下，mTORC1通过抑制自噬起始激酶Ulk1/2抑制细胞内成分的自噬吞噬和降解(他和克林斯基，2009年;2010年水岛). 由于内吞和自噬都是向溶酶体输送大分子的囊泡运输途径，我们研究了Ulk1/2缺失对DQ-BSA蛋白水解的影响。表达K-Ras的Ulk1/2野生型和DKO MEFG12伏DQ-BSA以相似的速率降解，并且对torin 1处理有反应，DQ-BSA蛋白水解也相应增加(图S6H). 此外，在含有3%白蛋白的无亮氨酸培养基中，托林1增强了Ulk1/2 DKO MEFs的增殖(图S6I). 因此，mTORC1通过不同于其自噬调节的机制抑制细胞外蛋白的溶酶体蛋白水解。
mTORC1信号对细胞增殖具有相反的影响，这取决于细胞的氨基酸来源
虽然在许多不同的系统中已经显示，当细胞外氨基酸丰富时，mTORC1可以促进生长，但上述数据表明，mTORC 1可以抑制依赖细胞外蛋白分解代谢的细胞生长。这使我们研究了mTORC1抑制对K-Ras生长的影响G12D系列培养基中的MEF含有越来越多的EAA，但补充了3%的白蛋白作为EAA的替代来源。当EAA大量存在于细胞外时，Torin 1治疗或Raptor击倒强烈降低细胞增殖(). 然而，对照细胞的增殖随着EAA水平的降低而迅速下降，而用torin 1或表达Raptor shRNA的细胞在EAA浓度的10倍范围内仅表现出轻微的增殖下降。在低EAA浓度下，torin 1处理或Raptor击倒显著提高了细胞增殖。这些结果表明mTORC1信号刺激K-Ras的增殖G12D系列MEF存在于富含氨基酸的培养基中，但当细胞外蛋白成为必需氨基酸的必需来源时，MEF会受到限制。
mTORC1信号对营养丰富和营养不足条件下的细胞增殖具有相反的影响（A）,（B）K-Ras的细胞数G12D系列MEF（A）±250 nM torin 1，（B）表达猛禽或对照shRNA，在含有3%白蛋白和指示量EAA的培养基中培养第3天。（C）对照和雷帕霉素处理的KPC小鼠中胰腺肿瘤细胞的增殖，通过Ki-67的免疫组织化学分析。比例尺=400μm；爆破中的比例尺=50μm。（D）如（C）所示，肿瘤内外区域Ki-67阳性肿瘤细胞的定量。（E）通过三维高分辨率超声对对照组和雷帕霉素治疗的KPC小鼠胰腺肿瘤体积增加进行量化。（F）猛禽KO MEF在含亮氨酸或游离培养基+3%白蛋白中的生长曲线。（G）在含有3%白蛋白和指示数量的EAA的培养基中培养第3天，表达猛禽或对照shRNA的野生型MEF的细胞数量。
（A）、（B）、（F）、（G）中的数据表示为平均值±STDEV（n=3）。虚线表示起始单元格编号。（D）、（E）中的数据表示为平均值±SEM（n=5）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。另请参见图S7.
雷帕霉素促进K-Ras诱导的胰腺肿瘤生长在体内
研究mTORC1抑制是否能促进K-Ras突变细胞的增殖体内，我们使用一种基因工程小鼠模型检测了mTORC1抑制对胰腺导管腺癌（PDA）发展的影响，该小鼠模型表达胰腺特异性突变K-Ras和p53的内源性等位基因(Hingorani等人，2005年). 在人类中，K-Ras在大多数胰腺癌中发生突变；最近，KPC小鼠的肿瘤细胞通过大胞饮作用内化高分子量右旋糖酐，这表明它们具有获取细胞外蛋白的潜力(Commisso等人，2013年). 此外，胰腺癌的肿瘤微环境血管化不良，营养物质高度缺乏(Kamphorst等人，2015年)这就增加了细胞外蛋白在这方面作为一种重要的替代营养源的可能性。
用雷帕霉素治疗具有相似大小肿瘤的KPC小鼠8天，并通过肿瘤组织的Ki-67染色检查细胞增殖。由于mTORC1抑制可在氨基酸饥饿期间促进培养细胞的细胞生长，因此我们检测了雷帕霉素对内皮标记物CD31阴性的肿瘤内部血管减少区域肿瘤细胞增殖的影响。事实上，尽管没有mTORC1下游靶点磷酸化S6，雷帕霉素治疗导致这些肿瘤区域Ki-67阳性细胞数量显著增加(,S7A系列). 相反，雷帕霉素降低了血管化肿瘤外部区域Ki-67阳性细胞的比例，同时伴随着磷酸化S6的减少。这些数据表明胰腺癌细胞对雷帕霉素有反应在里面体内取决于肿瘤所处的微环境&雷帕霉素降低了血管化区域外的细胞增殖，而增强了血管化内部区域的增殖。这些发现支持了mTORC1在营养缺乏期间可以抑制细胞生长的观点。引人注目的是，雷帕霉素治疗显著加速了KPC小鼠的肿瘤生长().
mTORC1信号转导的基因消融可诱导与Ras转化无关的细胞外蛋白依赖性生长
最后，为了确定mTORC1在抑制利用细胞外蛋白作为氨基酸源支持细胞生长中的作用是否仅限于Ras转化细胞，我们研究了mTORC2抑制含有野生型Ras等位基因的细胞的后果。表达猛禽shRNA或经mTOR抑制剂处理的野生型MEF可在添加3%白蛋白的无亮氨酸培养基（S7B–D）中强劲增殖。为了更严格地阻断mTOR信号，Raptor或Rictor从含有条件等位基因的MEF中被基因切除(图S7E) (Cybulski等人，2012年). 与野生型对照相比，猛禽敲除细胞在营养充足的培养基中表现出强烈的细胞增殖下降，但它们可以在无亮氨酸培养基+3%白蛋白中维持增殖(). 相反，Rictor的缺失仅适度降低了含亮氨酸培养基中的细胞增殖，而不会导致缺乏亮氨酸的细胞在补充白蛋白的培养基中生长(图S7F). 表达对照或猛禽shRNA的野生型MEF的增殖也在含有减少数量的EAA和3%白蛋白作为替代EAA来源的培养基中进行了检测。在EAA-fullet条件下猛禽击倒损伤细胞增殖(). 然而，当EAA水平降低时，对照组和猛禽击倒组细胞之间的细胞增殖差异减小，而在低EAA水平下，猛禽击落组细胞的增殖增强。
讨论
mTORC1抑制细胞外蛋白作为营养素的利用
上述结果表明，在哺乳动物细胞中，mTORC1信号抑制了从环境中摄取的蛋白质的溶酶体分解代谢。因此，mTORC1抑制可增强依赖细胞外蛋白作为营养物质的细胞增殖，例如在缺乏EAA的培养细胞或位于血管不良肿瘤区域的胰腺癌细胞中。众所周知，mTORC1通路在富含营养的条件下是细胞生长的有力刺激物，部分是通过增强翻译(Ma和Blenis，2009年;Shimobayashi和Hall，2014年). 然而，mTORC1促进蛋白质净合成的能力严格要求外源氨基酸。本研究表明，mTORC1通过限制细胞外蛋白中氨基酸的回收，将细胞生长与游离氨基酸的细胞外可用性联系起来。这表明，当蛋白质生物合成受到氨基酸获取而非翻译效率的限制时，mTORC1抑制可以促进生长。因此，mTORC1是否刺激或抑制细胞生长可能取决于细胞的氨基酸来源。
先前的研究表明，在缺乏细胞外EAA来源的情况下，抑制mTORC1可以支持细胞存活。当细胞在缺乏细胞外蛋白的情况下失去亮氨酸时，mTORC1随后的失活会导致自噬起始激酶Ulk1/2的去表达，从而触发自噬体的形成吞噬细胞内成分，随后将其输送到溶酶体(他和克林斯基，2009年;2010年水岛). 通过这种机制，自噬在亮氨酸缺乏期间支持细胞存活。然而，细胞内蛋白质的分解代谢不能导致细胞生长和增殖所需的亮氨酸（或其他EAA）的净获得。相反，细胞内蛋白质的自噬降解恢复了足够的EAA，使细胞参与适应性蛋白质合成，以在有限的营养缺乏期内维持细胞生存。本文的研究表明，哺乳动物细胞可以利用细胞外蛋白作为EAA的来源，从而维持细胞的生存能力。如果细胞由于激活Ras突变和/或mTORC1抑制而分解足够数量的细胞外蛋白，它们甚至可以支持净蛋白合成，以增加生物量和增殖。这里的数据表明，Ulk1/2对于Ras突变细胞的细胞外蛋白依赖性生长是不必要的。事实上，Ulk1/2基因缺失在mTORC1抑制后可增强细胞增殖。这表明，mTORC1抑制通过自噬降解细胞内成分可以限制氨基酸生成细胞通过吸收和降解细胞外蛋白而生长的速度。
氨基酸通过诱导mTORC1向溶酶体膜募集来调节其活性(Sancak等人，2010年). 目前的工作表明，内吞蛋白质的溶酶体降解与以单体形式从环境中输入的氨基酸一样，在同一步骤中调节mTORC1途径：这两种营养素都诱导Rag依赖性mTORC2向溶酶体膜募集，这允许其随后通过生长因子信号激活。类似地，通过自噬传递的细胞内蛋白质的溶酶体分解代谢导致mTORC1向该细胞器募集(Yu等人，2010年). 总之，这些数据表明，溶酶体mTORC1活性的调节构成了一种敏感机制，使细胞能够监测通过内吞或自噬传递的蛋白质中回收的氨基酸。相反，mTORC1在溶酶体膜处被激活，可以很好地定位为这些膜运输途径向溶酶体输送货物的调节器。值得注意的是，调节内体转运的蛋白质最近已成为一类新的mTORC1底物(Hsu等人，2011年;Kim等人，2015年;Yu等人，2011年).
mTOR抑制剂用于治疗的意义
目前的结果也可能揭示出mTOR抑制剂作为癌症治疗药物的疗效令人费解的缺乏。在过去几年中，人们一直在努力将mTORC1通路作为癌症治疗的靶点。这些研究的动机是观察到人类肿瘤通常表现出mTORC1活性升高，这通常是因为其上游激活剂PI3-激酶途径发生突变(Manning和Cantley，2007年). 然而，最近的临床试验表明，雷帕霉素类似物（rapalogs）对多种实体瘤的疗效有限。本研究揭示了mTOR抑制剂在癌症治疗中的固有弱点。通过增强细胞外衍生蛋白质的分解代谢，mTOR抑制剂增加了细胞外蛋白质作为替代营养素的使用，以支持生存和维持生长。这在缺乏营养的肿瘤微环境中或在肿瘤细胞必须适应新的代谢生态位的转移过程中可能特别重要。这些发现预测，mTOR抑制剂的促生长作用与癌细胞通过内吞途径（如Ras-directed macroponcysis）摄取足够胞外蛋白的能力有关。一贯地，用雷帕霉素治疗KPC小鼠会增加位于血管不良肿瘤区域的胰腺癌细胞的增殖，并加速肿瘤的净生长。这可能解释了mTOR抑制剂在治疗Ras信号激活突变的多种肿瘤类型时的失败，例如胰腺癌，其中K-Ras是主要的致癌基因(Javle等人，2010年)或神经纤维瘤病，这是由Ras抑制因子NF1突变引起的。
目前对rapalogs有限成功的一个解释是，它们可以减轻PI3-激酶/Akt信号的反馈抑制。这导致了活性位点mTOR抑制剂的开发，其通过靶向mTOR激酶抑制mTORC1和Akt激活剂mTORC2，以及双mTOR/PI3-激酶抑制剂。目前正在研究这些抑制剂在癌症治疗中的功效，但上述数据表明，在培养细胞中，不同类别的mTOR抑制剂在促进细胞外蛋白的营养利用方面存在警告。然而，我们的研究表明，将mTOR抑制剂与阻止细胞外蛋白摄取或溶酶体降解的抑制剂结合的替代方法可以取得更大的疗效。在评估mTORC1信号在肿瘤发生中的作用时，也值得考虑癌症基因组测序工作的见解。相对而言，很少有癌症显示mTOR激酶或直接通路调节因子的突变，从而导致组成通路激活。相反，上游PI3-激酶/Akt通路的突变在人类癌症中普遍存在(曼宁和坎特利，2007年). 可以想象，这使癌细胞在富含营养的条件下增加mTORC1活性，同时不解除氨基酸对其的调节，从而使肿瘤细胞适应营养剥夺。
细胞外大分子胞饮作用作为真核细胞营养物质获取策略
目前的工作表明，哺乳动物细胞可以利用细胞外蛋白作为EAA的来源来维持生存和增殖。这些数据支持并扩展了最近的研究，表明Ras定向蛋白大胞饮作用可以减轻转化细胞对细胞外谷氨酰胺供应的依赖性(Commisso等人，2013年). Ras诱导的细胞外蛋白大胞饮作用以前被认为可以维持单细胞阿米巴真核生物的生长，例如盘状网柄菌(Amyere等人，2002年). 综上所述，这些发现表明，大胞饮作用是真核细胞中一种古老的营养获取策略。有趣的是，后生动物细胞中的大量胞饮作用受生长因子信号的控制，而大量胞饮诱导是各种哺乳动物细胞对血清刺激的直接反应(Amyere等人，2002年;Mercer和Helenius，2009年). 这表明，生长因子可以指示细胞不仅摄取葡萄糖和氨基酸等低分子量营养物质，还摄取细胞外大分子。然而，生长因子信号和氨基酸的协同输入导致mTORC1激活，这限制了从环境中内化的蛋白质的分解代谢。因此，mTORC1启动利用游离氨基酸的合成代谢细胞代谢，同时防止细胞外衍生蛋白质的降解。只要有单体氨基酸，这种机制就可以防止体液中蛋白质的无效周转。
细胞培养和营养饥饿实验
细胞培养实验在37°C和5%CO下进行2在DMEM/F12中，用10%透析的FBS（分子量截止值10000；Gemini Biosystems）、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺。
对于增殖测定，将MEFs置于完全培养基中，5小时后短暂漂洗，然后在饥饿培养基中培养，如图所示。对于EAA滴定实验，按照1x MEM氨基酸溶液（M5550，Sigma）的指示百分比补充EAA。肿瘤细胞系在饥饿前在完全培养基中培养1天。使用Multisizer 4 Coulter Coulter计数器（Beckman）测定粘附细胞的数量，通过台盼蓝排除法评估，粘附细胞存活率>95%（数据未显示）。
对于mTOR激活和定位实验，细胞被冲洗，然后在EAA饥饿培养基（除谷氨酰胺外，DMEM/F12缺乏所有氨基酸）中培养1小时，然后放置在补充有EAA（1x MEM氨基酸溶液）、白蛋白（3%，如果没有另行说明）的培养基中或指定时间段内新鲜无EAA饥饿培养基。
小鼠菌株和雷帕霉素治疗
KPC小鼠模型(LSL-K-Ras公司G12D系列/+;LSL-Trp53172H兰特/+;Pdx-1-Cre公司)已在前面描述过(Hingorani等人，2005年). KPC小鼠出现晚期和转移性PDA，外显率为100%，重现了人类PDA的组织病理学和临床特征。小鼠被安置在12小时光照/12小时黑暗周期中。所有程序均按照CSHL动物护理和使用委员会的规定进行。
通过超声波（Vevo软件，Visualsonics）测定，已建立肿瘤大小相当（直径7-9 mm，n=5）的KPC小鼠每天口服5 mg/kg Rapamune（辉瑞）或生理盐水（溶媒对照），持续8天。最后一次给药是在终点前4小时。根据治疗第4天和第7天拍摄的三维超声图像测量肿瘤体积。
统计分析
使用双尾非配对计算P值t吨-用Mann-Whitney非参数法测试培养细胞的增殖和荧光显微镜实验t吨-小鼠肿瘤分析试验。
