铁下垂作为p53介导的肿瘤抑制活性

摘要

p53肿瘤抑制途径的失活是大多数人类癌症形成的关键事件^1–5传统上，p53的肿瘤抑制活性被认为反映了其在细胞应激下诱导细胞周期阻滞、凋亡和/或衰老的能力。然而，最近的研究表明，p53的其他非常规活性对其抑癌功能也至关重要^4–8p53蛋白作为一种DNA结合转录因子，选择性调节某些p53转录靶基因的表达，从而实现其多种细胞结果。应激诱导的p53蛋白激活主要通过翻译后修饰实现⁹，我们最近对表达乙酰化缺陷p53突变体的小鼠的研究表明，乙酰化对p53介导的细胞周期停滞、凋亡和衰老有不同的调节作用¹⁰值得注意的是，突变型p53^3公里多肽虽然对三种传统的p53功能有缺陷，但仍保留其肿瘤抑制功能和调节代谢靶点表达的能力¹⁰表明p53介导的代谢调节在抑制肿瘤形成中起着关键作用体内.

的标识SLC7A11型作为p53靶点

为了阐明p53介导的代谢调节的确切作用，我们试图通过生成用于微阵列分析的四环素控制（tet-on）p53诱导细胞系来识别新的p53靶基因。使用Partek软件对阵列数据进行了检查，并确定了诱导细胞和非诱导细胞之间差异表达的基因(扩展数据表1).SLC7A11型编码胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白的一种成分^11–13，被鉴定为一个新的p53靶基因。而四环素治疗对SLC7A11型亲代H1299细胞中的表达SLC7A11型在tet-on p53诱导系中观察到mRNA表达(扩展数据图1a)western blot分析显示，p53激活严重降低了SLC7A11蛋白水平(图1a). 人类的5′侧翼区域SLC7A11型染色体4q28-31上的基因(^参考13)包含一个与一致的p53结合序列匹配的位点(图1b)在高纯度重组全长人类野生型p53与含有该位点的放射性标记寡核苷酸探针孵育后，通过电泳迁移率变化分析（EMSA）很容易鉴定出p53–DNA复合物(图1c). 此外，这种p53–DNA复合物在p53特异性抗体的存在下发生超转移，并且由于与未标记探针的竞争而显著减少。此外，对人骨肉瘤U2OS细胞（表达野生型p53）的染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，内源性p53多肽占据了骨肉瘤的启动子区SLC7A11型基因(图1d). 此外，当p53被nutlin-3激活时，SLC7A11的蛋白水平显著降低¹⁴或者DNA受损(图1e和扩展数据图1b). 相反，在p53敲除条件下，SLC7A11下调被完全消除(图1e). 在表达野生型p53的其他人类癌细胞系（H460和MCF-7）中也观察到类似的结果，而在p53缺失的细胞（H1299和SAOS-2）中没有检测到明显的作用(扩展数据图1c–e). 总之，这些数据表明SLC7A11型该基因是p53介导的转录抑制的靶点。

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图1

的标识SLC7A11型作为p53的靶点

一用多西环素处理的p53稳定系tet-on细胞的Western blot和RT-PCR。VIN，vinculin（车辆识别号）。b条，p53在人身上的结合位置和序列示意图SLC7A11型基因。将确定的p53结合序列与一致序列进行比较（R，A/G；W，A/T；Y，C/T；红色的核苷酸C和G对p53结合至关重要）。TSS，转录起始位点。面对的箭头表示在中生成探针的引物c（c）和PCRd日.c（c），使用指定的部件进行EMSA。双加号表示，与单加号相比，添加了更多竞争性冷探针（200倍于放射性标记热探针的100倍）。d日对U2OS细胞进行ChIP检测。e（电子）用nutlin处理p53基因敲除的U2OS细胞，并进行western blot分析。所有数据均代表三个独立实验。

p53对SLC7A11表达的调节^3公里

我们之前的研究表明p53^3公里保持调节代谢目标的能力¹⁰测试p53的作用^3公里为了调节SLC7A11的表达，我们建立了一个tet-on H1299细胞系，其中p53^3公里四环素可诱导表达。与我们之前的研究一致¹⁰，p53^3公里能够激活TIGAR和MDM2的表达，但不能激活p21（也称为CDKN1A）或PUMA（也称为BBC3）的表达。值得注意的是，在p53后的不同时间点，SLC7A11水平显著降低^3公里诱导(图2a). 染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示p53^3公里蛋白质能够结合SLC7A11型基因(图2b). 为了在更多生理环境下证实这一发现，我们检测了SLC7A11型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）转录物来源于第53页^+/+,第53页^{3公里/3公里}和第53页^−/−老鼠。定量逆转录聚合酶链反应（RT–qPCR）分析显示SLC7A11型表达显著增加（～4倍）第53页^−/−与野生型MEF相关的单元格(图2c和扩展数据图1f). 然而，SLC7A11型转录水平在第53页^{3公里/3公里}细胞，表明p53^3公里可以抑制SLC7A11型以类似于野生型p53的方式表达。此外，ChIP分析显示小鼠p53被招募到小鼠第7a11页野生型和p53中RE3位点对应引物的启动子区域^3公里MEF，但不在p53-全部MEF中(扩展数据图1g，h). 这些数据表明乙酰化缺陷突变型p53^3公里保留其调节SLC7A11表达的能力体内.

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图2

第53页^3公里在调节中SLC7A11型和胱氨酸摄取活性

一，Tet-on p53^3公里用强力霉素处理稳定的细胞，然后进行western blots和RT-PCR。b条，对野生型p53（p53^重量)和p53^3公里稳定细胞系上的tet。c（c），信使RNA水平为第7a11页通过RT-PCR和Hprt（小时）作为内生控制。d日，测定p53中胱氨酸摄取活性（c.p.m.，每分钟计数）^3公里稳定的细胞系。显示了两次技术复制的平均值±s.d。e（电子）在每个基因型的三个单独胚胎的MEF中测量胱氨酸摄取水平（c.p.m.）。所有数据独立重复三次，并显示代表。

胱氨酸摄取和铁下垂的调节

SLC7A11是质膜转运蛋白（<trans data-src="x">x个</trans><trans data-src="c">c（c）</trans><trans data-src="−">−</trans>系统）调节Na⁺-细胞外胱氨酸与细胞内谷氨酸的相互作用^11–13为了了解p53介导的SLC7A11表达抑制的功能后果，我们首先检查了p53激活对细胞摄取我-[¹⁴C] -胱氨酸。事实上，tet-on p53的胱氨酸摄取水平^3公里-四环素治疗后诱导细胞减少(图2d). 为了在更生理的环境中研究这种影响，我们还检查了第53页^+/+,第53页^{3公里/3公里}和第53页^−/−MEF公司。如所示图2e，胱氨酸摄取在第53页^−/−MEF水平比第53页^+/+MEF，验证了p53缺失促进细胞摄取胱氨酸。然而，我们没有检测到胱氨酸摄取在第53页^{3公里/3公里}MEF细胞，提示p53^3公里保留抑制胱氨酸摄取的能力体内.

值得注意的是，最近的研究表明，SLC7A11的表达对铁下垂也至关重要，铁下垂是一种涉及代谢功能障碍的铁依赖性非凋亡细胞死亡¹⁵为此，我们通过用铁凋亡诱导剂橡皮素治疗早期传代MEF来检测p53是否影响细胞对铁凋亡的敏感性。虽然橡皮素在两种细胞中都诱导了高水平的细胞死亡（>48%）第53页^+/+和第53页^{3公里/3公里}MEF，在p53-null细胞中仅观察到低水平（～20%）(图3a和扩展数据图2a). 此外，在动力学分析中，很容易在两者中检测到细胞死亡第53页^+/+和第53页^{3公里/3公里}治疗后6小时出现MEF(图3b). 虽然在p53-null细胞中也检测到一小部分细胞死亡，但对p53-nll细胞与第53页^+/+或第53页^{3公里/3公里}暴露于不同浓度的橡皮素后，MEF在不同时间点非常明显(图3b和扩展数据图2b). 通过对经橡皮素处理的细胞进行透射电镜观察，我们观察到线粒体萎缩，膜密度增加，但没有明显的DNA断裂（III和IV，图3c)，TNF-α处理后凋亡细胞的特征形态学特征(扩展数据图2c). Western blot分析表明，橡皮素诱导的细胞死亡也未能诱导PARP1裂解和caspase 3激活，TUNEL分析证实了铁下垂中DNA片段缺失(扩展数据图2d–f).

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图3

p53在细胞凋亡中的作用

一，经4μM擦除处理8h的MEF代表性相控图像（放大倍率，×10）。b条，4μM橡皮素在24小时内诱导细胞死亡的动力学。显示了两个重复实验的平均值±标准差。PI，碘化丙啶。c（c），用二甲基亚砜（DMSO）或erastin处理野生型MEFs，并进行透射电子显微镜检查。箭头，原子核；箭头，线粒体。d日用橡皮素和特异性细胞死亡抑制剂处理MEF 8 h，并测定细胞死亡百分比（两个技术复制品的误差条，s.d.）。3-MA，3-甲基腺苷。所有数据均代表三个独立实验。

为了证实橡皮素诱导的细胞死亡模式，我们用铁抑制素-1（ferr-1）处理细胞，ferr-1是一种特异性铁下垂抑制剂¹⁵值得注意的是，ferr-1完全挽救了这两种细胞的死亡第53页^+/+和第53页^{3公里/3公里}MEF公司(图3d). 相反，其他形式的细胞死亡抑制剂，包括自噬（3-甲基腺苷）、凋亡（Z-VAD-FMK）和坏死性凋亡（坏死抑制素-1），未能抑制橡皮素诱导的细胞死亡(图3d和扩展数据图2g)尽管它们具有抑制自噬、坏死和凋亡的能力，但在相同的MEF中(扩展数据图3a–e). 此外，一些额外的铁沉降抑制剂¹⁵也被证明能有效阻断p53介导的细胞凋亡第53页^{3公里/3公里}MEF公司(扩展数据图3f). 总之，这些数据表明p53^3公里保留调节细胞摄取胱氨酸和促进铁下垂的能力。

SLC7A11在细胞凋亡和肿瘤抑制中的作用

先前的研究表明SLC7A11型在几种人类癌症中观察到过度表达^16–18在对20对人类肿瘤与邻近正常组织进行分析后，我们观察到SLC7A11型约70%的人类癌症样本（8/10结肠肿瘤样本、3/5肝脏肿瘤样本和3/5肾脏肿瘤样本）过度表达(扩展数据图4a–c). 为了进一步评估其在肿瘤发生中的作用，我们使用共焦显微镜在这些组织切片上对SLC7A11进行了免疫荧光染色分析。如所示图4a膜标记物（ATP1A1）（绿色）和SLC7A11（红色）均主要定位于质膜上。更重要的是，尽管ATP1A1（绿色）在正常和癌组织中的水平相似，但与邻近的正常细胞相比，恶性细胞中的SLC7A11水平（红色）明显更高（另见扩展数据图4d). 尽管SLC7A11型所有p53突变肿瘤中的水平都升高，SLC7A11型表达野生型p53的肿瘤也发生上调(扩展数据图4e)这表明其他因素也可能影响人类癌症中SLC7A11的表达。

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图4

p53介导的细胞凋亡的调控SLC7A11型

一，配对结肠癌和邻近正常组织SLC7A11的代表性免疫荧光染色。H&E、苏木精和伊红（放大倍数，×20）。左上角的数字是来自一名结肠癌患者的正常/癌症组织对的特定组织识别号。b条，Tet-on p53^3公里用过表达SLC7A11的对照或质粒转染细胞，然后按指示进行处理。显示了两个技术复制的细胞死亡定量（平均值±标准差）。c（c），tet-on p53的西方bot分析^3公里有或无SLC7A11过度表达的细胞。VIN，vinculin（车辆识别号）。d日，来自tet-on p53的异种移植瘤^3公里中显示的单元格c（c）.e（电子），确定肿瘤重量（误差条，来自四个肿瘤的s.d.）。独立实验重复了三次，并显示了具有代表性的数据。

为了探讨p53介导的SLC7A11和铁凋亡在人类癌细胞中的作用，我们首先检测了橡皮素对tet-on p53的影响^3公里-可诱导H1299细胞。正如预期的那样，在缺乏p53的情况下，这些细胞对擦除素介导的铁下垂具有很强的抵抗力^3公里感应(图4b和扩展数据图5a); 相反，在四环素诱导p53后，观察到高水平的细胞死亡（>80%）^3公里在橡皮素的存在下。再次，p53诱导的铁凋亡活性^3公里在ferr-1的存在下被抑制(扩展数据图5b). 值得注意的是，SLC7A11过度表达将这些细胞从p53中拯救出来^3公里-依赖性铁下垂(图4b)也废除了p53^3公里-菌落形成的介导性减少(扩展数据图5c–e). 这些数据表明，SLC7A11在人类肿瘤样本中过度表达，异位表达SLC7A1可以抑制p53诱导的铁凋亡^3公里在人类癌细胞中。

为了验证p53介导的对SLC7A11表达的影响在调节肿瘤抑制活性中的作用，而不依赖于细胞生长停滞、凋亡和衰老，我们测试了SLC7A1过度表达是否影响p53诱导的肿瘤生长抑制^3公里在异种移植瘤模型中。根据p53^3公里四环素诱导的表达(图4c)p53-null H1299细胞的生长显著降低(图4d，III vs.I）在异种移植瘤生长试验中；然而，p53的抑瘤作用^3公里在SLC7A11过度表达的情况下基本上被废除(图4d，IV与III，另见图4e). 这些数据表明，SLC7A11的表达对p53诱导的肿瘤生长抑制活性至关重要^3公里.

p53在胚胎发育中的代谢调控

几项研究表明，p53在细胞凋亡、细胞生长停滞和衰老中的典型活性是在第53页^+/+百万平方米^−/−小鼠胚胎，在发育的E3.5–E5.5天死亡^19–24为了评估p53的非规范性活动是否与该表型有关，第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/−对小鼠进行杂交，并对其后代进行基因分型。考虑到p53^3公里突变体未能诱导p53介导的细胞周期阻滞、凋亡或衰老¹⁰，我们惊讶地发现第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−这些杂交后代中的幼崽(扩展数据图6a、b). 因此，通过定时杂交获得的胚胎第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/−对小鼠进行了检查。到E7.5天，第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎p53染色显著升高，但发育结构基本正常(图5a)，表明p53^3公里突变引发了胚胎发育的实质性拯救。正如预期，尽管p53高^3公里表达式，第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎没有显示出凋亡水平的增加，正如没有裂解caspase-3染色所示(图5a)和负TUNEL信号(扩展数据图6c、d). Ki67和BrdU染色的水平也表明第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎(图5a和扩展数据图6d). 进一步分析证实了p53的高水平^3公里蛋白，缺乏裂解的胱天蛋白酶-3，并且缺乏p21或PUMA的诱导第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎(扩展数据图6e，f). 此外，我们没有检测到任何细胞对衰老相关β-半乳糖苷酶活性呈阳性染色第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎(扩展数据图6g–i)表明这些胚胎中没有衰老细胞。

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图5

p53介导的胚胎发育代谢调控

一对E7.5胚胎进行代表性苏木精和伊红（H&E）和免疫组织化学染色，显示基因型（放大倍率，×20）。b条，信使RNA表达水平第7a11页在具有指定基因型的E9.5胚胎中（误差条，s.d。；n个=3用于第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/+和n个=所有其他基因型为5）。c（c），用二甲基亚砜或ferr-1处理的E14.5胚胎的代表性形态（放大倍数，×1.5）。d日，信使RNA表达水平第2部分确定方法与b条所有数据均独立重复至少三次，并显示代表性数据。

然而，第7a11页mRNA表达在第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎(图5b)到E11.5天第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎变得非常明显(扩展数据图7a). 探讨p53介导的铁粒细胞凋亡是否与胚胎发育缺陷有关第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎，我们在E5.5天将铁下垂抑制剂ferr-1注入腹腔，并在E14.5天收集胚胎。如所示图5c，铁-1-处理第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎在E14.5（II）天表现出明显的器官发生，例如眼睛形成和肢体分化，而在未经治疗的时候第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎被大量切除（我也看到扩展数据图7b). 康复者的身体尺寸（从头部到尾部）第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−经过ferr-1治疗后，胚胎也显著增大，眼睛结构也显著改善(扩展数据图7c、d). 最近的一项研究确定PTGS2的上调是脱铁性贫血的潜在分子标记²⁵。如所示图5d,第2部分在第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎；相反，第2部分中的级别未受影响第53页^−/−百万平方米^−/−胚胎，表明第2部分上调第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎依赖p53。综上所述，这些数据表明，p53介导的代谢调节和铁中毒细胞死亡的作用对观察到的胚胎发育缺陷起着关键作用第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎。

ROS反应中p53介导的铁下垂

为了在更生理的环境中评估铁下垂的调节，我们检测了p53是否^3公里-ROS应激反应涉及介导的铁中毒细胞死亡。ROS处理方法已在前面描述^26,27。如所示图6a，两个p53均未观察到明显的细胞死亡^3公里诱导或单独ROS治疗。然而，值得注意的是，p53的结合^3公里诱导和ROS处理诱导了大量细胞死亡，并被ferr-1特异性抑制(图6a和扩展数据图8a)或SLC7A11过度表达(图6b). 这些数据表明p53的激活^3公里在ROS应激下导致细胞铁质降解死亡，与细胞周期阻滞、衰老和凋亡无关。

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图6

p53介导的ROS脱铁反应

一，Tet-on p53^3公里用强力霉素和ROS以及特异性细胞死亡抑制剂处理细胞24小时。Nec-1、坏死抑制素-1（放大倍数×10）。b条，Tet-on p53^3公里用过表达SLC7A11的对照或质粒转染细胞，然后用强力霉素和活性氧处理16小时。显示了两个技术复制品的细胞死亡定量（平均值±标准日）。c（c）图像采集时，用nutlin和ROS处理p53敲除的U2OS细胞24小时。d日、由野生型或第7a11页-BAC转基因小鼠。VIN，长春花。e（电子）用ROS或橡皮素处理来自指定基因型的MEF 8小时，显示了两个技术复制品的细胞死亡定量（平均值±标准差）。所有实验均独立进行了三次，并显示了具有代表性的数据。

最近的研究表明，野生型p53蛋白可以被nutlin-3在人类肿瘤中激活(^参考14). 在大多数人类癌细胞中，nutlin-3介导的p53激活可诱导可逆的细胞周期阻滞，但不会导致细胞死亡^28,29这可能会限制其在癌症治疗中的疗效。因此，我们检测了Mdm2抑制是否可以调节p53介导的人类癌细胞中的铁凋亡。正如预期的那样，nutlin-3对U2OS细胞的治疗诱导了高水平的p53表达，但没有引起细胞死亡，而ROS单独治疗也未能引起细胞死亡反应，因为ROS没有诱导强烈的p53激活(图6c和扩展数据图8b、c). 然而，在与nutlin和ROS联合治疗时观察到大量细胞死亡(图6c). 细胞死亡反应是p53依赖性的，因为它在内源性p53被敲除后被废除(图6c和扩展数据图8c)细胞死亡再次被铁凋亡抑制剂ferr-1挽救(扩展数据图8d). 有趣的是，尽管DNA损伤剂如足叶乙甙和阿霉素也能在U2OS细胞中诱导高水平的细胞死亡，但铁-1处理不能抑制DNA损伤诱导的细胞死亡(扩展数据图8e，f)表明p53介导的铁下垂是由ROS特异性诱导的，而不是由DNA损伤诱导的。

最后，为了评估SLC7A11在更多生理条件下对铁下垂的调节，我们构建了过度表达SLC7A1的BAC转基因小鼠(第7a11页细菌人工染色体，第7a11页-巴克）(扩展数据图9). 虽然第7a11页-BAC小鼠需要进一步分析，我们从这两种小鼠中导出了MEF第7a11页-BAC小鼠及其对照鼠。如所示图6d，SLC7A11蛋白水平在第7a11页-BACMEF相对于控制MEF。值得注意的是，ROS或橡皮素治疗在野生型MEF中诱导了高水平的铁下垂，但在第7a11页-BAC小额金融机构(图6e). 总的来说，这些数据表明p53介导的铁中毒是由ROS特异性诱导的，SLC7A11的水平对p53介介导的铁中毒反应至关重要。

讨论

虽然人们普遍认为p53介导的细胞周期阻滞、凋亡和衰老都是肿瘤抑制的主要机制，但越来越多的证据表明，p53的其他活性，如代谢调节，也对肿瘤抑制至关重要¹⁰虽然已经确定了一些p53的代谢靶点，如TIGAR、GLS2和SCO2^30–37目前尚不清楚p53的代谢功能如何影响其抑瘤活性。这里我们显示，通过转录抑制SLC7A11型p53是胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白的一种成分，它抑制胱氨酸类物质的摄取，并使细胞对非凋亡形式的细胞死亡铁下垂敏感。此外，p53基因^3公里突变体在p53依赖性细胞周期阻滞、凋亡和衰老方面存在缺陷，它保留了抑制SLC7A11表达的能力，从而调节胱氨酸代谢和铁中毒细胞死亡。使用第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−突变小鼠，我们进一步表明p53功能的这一方面对胚胎发育和与丧失百万平方米铁下垂与代谢功能障碍相关，代谢功能障碍导致细胞溶质和脂质活性氧的产生，而不依赖线粒体^15,25.通过压制SLC7A11型转录，p53激活降低胱氨酸的摄取，从而限制细胞内谷胱甘肽（GSH）的产生，GSH是主要的细胞抗氧化剂。因此，ROS诱导的p53活化细胞的铁下垂敏感性显著增加。值得注意的是，SLC7A11在许多类型的人类癌症中过度表达，并且SLC7A1的水平对铁中毒反应的敏感性至关重要。通过使用p53^3公里在异种移植瘤模型中发生突变，我们表明SLC7A11的高水平表达导致p53诱导的肿瘤生长抑制活性显著减弱^3公里与细胞周期阻滞、凋亡和衰老无关。

我们的数据表明p53介导的转录抑制SLC7A11型对ROS诱导的铁下垂至关重要。尽管如此，额外的p53靶基因可能有助于这种新的p53反应。未来的研究需要阐明p53的其他代谢靶点在调节铁凋亡中的作用。有趣的是，以前的研究表明，p53通过上调代谢靶点（如TIGAR（也称为C12或f5）和GLS2）来改善氧化应激，这些代谢靶点可降低细胞内ROS水平^30–37然而，我们发现高水平的活性氧可以触发p53介导的铁凋亡(图6)，与观察到的脱铁性贫血的特征是致命的铁依赖性脂质ROS积累一致^15,25虽然许多研究表明活性氧在新陈代谢和致瘤基因中都存在，但细胞对活性氧反应的机制尚不清楚。然而，p53对细胞活性氧水平的不同影响表明了一个有趣的模型。作为对低或基础活性氧水平的反应，p53可能阻止细胞积累致命的活性氧水平，同时也允许中度氧化损伤的存活和修复。然而，为了应对较高或不适当的活性氧水平（如癌细胞中的活性氧），p53可能反而通过铁下垂促进无法出售的癌细胞的清除。这个模型让人联想到p53对细胞对DNA损伤的不同反应^1–6在这种情况下，p53激活促进细胞存活和基因毒性损伤的修复（通过促进细胞周期检查点和DNA修复的靶基因），以应对低水平的DNA损伤；然而，严重的DNA损伤后，p53介导的高水平凋亡细胞死亡会永久清除受损细胞。总之，我们的研究结果表明，p53介导的对胱氨酸代谢、ROS反应和脱铁细胞死亡的影响代表了一种新的肿瘤抑制机制。

方法

扩展数据

扩展数据图1

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SLC7A11型p53下调小鼠p53表达及p53结合位点的鉴定第7a11页基因

一，信使RNA水平SLC7A11型在用强力霉素（0.1μg ml）处理的tet-on野生型p53稳定细胞系和亲代H1299细胞中⁻¹).b条，用阿霉素（0.2μg ml）处理U2OS细胞⁻¹)mRNA定量。c（c）用阿霉素（0.2μg ml）处理骨肉瘤细胞系U2OS（p53野生型）和SAOS-2（p53无效）细胞⁻¹)测定mRNA水平。d日用阿霉素（0.2μg ml）处理肺癌细胞系H1299（p53缺失）和H460（p53野生型）细胞⁻¹)RT-PCR检测mRNA表达。e（电子），用阿霉素（0.2μg/ml）处理乳腺癌细胞系MCF7⁻¹)在指定的持续时间内，使用RT-qPCR测量mRNA表达。（f），RT-qPCR用于测定第7a11页在具有指定基因型的MEF中。克，示意图，表示小鼠上潜在的p53结合位置和序列第7a11页基因。TSS，转录起始位点；浅蓝色盒子，5′-UTR。小时，对用坚果素（10μM）处理6 h的MEF进行ChIP–qPCR。所有qPCR在两个技术重复中进行，显示平均值±标准差。所有实验均独立重复三次。

扩展数据图2

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MEF中橡皮素诱导细胞死亡的特征

一，量化细胞死亡，如所示图3a误差条是两个技术副本的s.d。b条，在具有指定基因型的MEF中，橡皮素（1μM）在24小时内诱导的细胞死亡动力学。进行了技术复制，并显示了平均值±标准差(n个= 2).c（c），用TNFα（20 ng/ml）处理的野生型MEFs的透射电子显微镜图像⁻¹)和CHX（5μg ml⁻¹)16小时，箭头指向碎片核。d日用小鼠TNFα（20 ng ml）治疗野生型MEF⁻¹)和CHX（5μg ml⁻¹)或橡皮素（1μM）8小时，然后进行蛋白印迹。e（电子），TUNEL分析是使用野生型MEF进行的d日.（f），TUNEL信号的量化e（电子）.显示了十个随机显微镜视图的平均值±标准差（放大倍数，×20）。克在拍摄图像之前，用橡皮素（4μM）和特异性细胞死亡抑制剂处理显示p53状态的MEF 8小时（放大倍数×10）。3-MA，3-甲基腺苷。所有实验至少重复了三次，并显示了具有代表性的数据。

扩展数据图3

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细胞死亡抑制剂的有效性

一，野生型MEF细胞在缺乏葡萄糖、丙酮酸钠或我-谷氨酰胺加或不加3-甲基腺苷（2 mM）2小时，然后进行蛋白印迹。b条用TNFα（20 ng ml）处理野生型MEF 48 h⁻¹)、SMAC模拟物（100 nM）和Z-VAD-FMK（10μg ml⁻¹)在存在或不存在坏死抑制素-1（10μg/ml）的情况下诱导坏死⁻¹)（放大倍数，×10）。c（c），量化细胞死亡，如所示b条PI，碘化丙啶。显示了两个技术复制品的平均值±标准差。d日用TNFα（20 ng ml）处理野生型MEF 48 h⁻¹)、SMAC模拟物（100 nM）和坏死抑制素-1（10μg ml⁻¹)在有或无Z-VAD-FMK（10μg ml）存在的情况下诱导细胞凋亡⁻¹)（放大倍数，×10）。e（电子），量化细胞死亡，如所示d日显示了两个技术复制品的平均值±标准差。（f）,第53页^{3公里/3公里}用橡皮素（4μM）和各种化学物质处理MEF 24小时，然后测定细胞死亡百分比；两个技术复制品的误差条。二甲基亚砜；DFO、去铁胺；U0126，1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫代]丁二烯；β-ME，β-巯基乙醇；N-乙酰NAC-我-半胱氨酸。所有实验均独立重复三次。

扩展数据图4

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SLC7A11在人类癌症患者肿瘤中过度表达

a–c，定量RT-PCR用于测定SLC7A11型来自结肠的配对正常组织和癌组织(一)，肾脏(b条)和肝脏(c（c）); 正常组织中的平均表达水平在每种类型的癌症中标准化为1。显示了两个技术复制品的平均值±标准差。d日SLC7A11在成对患者癌症和邻近正常组织冰冻切片上的代表性heamotoxylin和eosin（H&E）和免疫荧光染色。放大倍数，×20。N、 正常组织；C、 癌组织。蓝色，DAPI；绿色，抗ATP1A1；红色，抗SLC7A11。e（电子），对结肠癌样本进行DNA测序，并鉴定出特定的突变。独立实验重复了三次，并显示了具有代表性的数据。

扩展数据图5

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p53诱导的细胞死亡^3公里橡皮素是铁凋亡和SLC7A11过度表达对菌落形成的影响

一，中处理的细胞培养物的代表性相位对比图像图4b（放大倍数，×10）。b、 第53页^3公里按指示处理tet-on稳定系细胞，并量化细胞死亡百分比（DFO，去铁胺；U0126，1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫代]丁二烯；β-ME，β-巯基乙醇；NAC，N-乙酰基-我-半胱氨酸）。显示了两个技术复制品的平均值±标准差。c、 24小时后用所示质粒转染H1299细胞，然后进行western blot。HA、血凝素d、转染到c.e的10-cm平板中的集落形成试验的代表性图像，集落形成分析的量化如d.所示。对照平板中形成的集落数量标准化为100，显示了两个技术复制品的平均±s.d。所有实验都重复了三次，并显示了具有代表性的数据。

扩展数据图6

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第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−小鼠胚胎致死

一，Mdm2状态基因分型的代表性凝胶图像第53页^{3公里/3公里}背景老鼠。b条，从中回收的活胚胎和幼崽数量摘要第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/−杂交育种。c（c）显示基因型E7.5胚胎的血红素和曙红（H&E）、p53免疫组化染色和TUNEL分析（放大倍率×20）。d日TUNEL或BrdU阳性细胞的百分比通过计数三个不同胚胎每个切片中的100个细胞来确定。误差线，s.d。；N.S.，不显著。e（电子）用E9.5胚胎的全胚胎提取物进行western blot。作为阳性对照，使用辐照（IR）野生型小鼠胸腺蛋白裂解物（8Gy）。（f），信使RNA表达水平彪马使用具有指定基因型的E9.5胚胎通过RT–qPCR进行测定(n个=3用于第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/+和n个=5，用于第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−; 误差线，s.d。；N.S，不显著）。克，使用指定基因型的E9.5小鼠胚胎进行的整体衰老相关β-半乳糖苷酶染色的代表性图像（放大倍率，×2）。小时，与中的协议相同克用于染色对照野生型胚胎和表达β-半乳糖苷酶的HAUSP杂合敲除物的胚胎⁴⁰（放大倍数，×2）。我，使用与克（放大倍数，×10）。

扩展数据图7

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Ferrostatin-1部分挽救第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−老鼠

一，所示基因型E11.5小鼠胚胎的代表性形态（放大倍数，×3）。b条，从第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/−交叉注入或不注入ferr-1。星号标记的虚线突出显示了死者的尸体第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−胚胎，进一步解剖后解体（放大倍数×1.5）。c（c），头尾长度第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−对胚胎进行测量并与第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/+控件(n个=每组4第53页^{3公里/3公里}马里兰州2^−/−含或不含铁-1处理的胚胎；误差条，s.d.）。d日，眼部结构的代表性苏木精和曙红（H&E）染色第53页^{3公里/3公里}百万平方米^+/+和第53页^{3公里/3公里}百万平方米^−/−小鼠胚胎（放大倍数，×20和×40，如图所示）。

扩展数据图8

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nutlin/ROS协同作用下的铁下垂

一，细胞死亡百分比如所示图6a被量化。显示了两个技术复制品的平均值±标准差。b条对p53稳定敲除的U2OS细胞进行nultin（10μM）处理24 h，然后添加ROS（叔丁基过氧化氢，350μM）4 h。进行蛋白质印迹。c（c），量化细胞死亡，如所示图6c显示了两个技术复制品的平均值±标准差。d日U2OS细胞首先用胡桃素（10μM）处理24 h，然后用活性氧（叔丁基过氧化氢，350μM）和指示的细胞死亡抑制剂处理；24h后定量细胞死亡。两个技术复制品的误差条，s.d。e（电子）用DNA损伤剂（足叶乙甙，20μM；阿霉素，0.2μg ml）处理U2OS细胞⁻¹)48小时，无论是否存在铁-1（2μM）（放大倍数，×10）；细胞死亡在（f）显示平均值±标准差(n个=2个技术副本）。所有数据独立重复三次。

扩展数据图9

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BAC转基因小鼠的制备第7a11页过度表达

一，显示生成过程的示意图第7a11页-BAC转基因小鼠。b条、小鼠周围BAC的快照第7a11页基因。BAC（RP24-242E11），仅包含第7a11页选择基因进行注射。c（c）BAC构建物两端的PCR鉴定创始者（编号21和编号22）为BAC转基因阳性小鼠。d日，在c（c）.NC，无模板控件。e（电子）、来自3周龄对照和第7a11页-用western blots对BAC转基因小鼠进行裂解和检测。（f），将具有指定基因型的MEF细胞作为图6e持续2 h，通过RT-qPCR测定mRNA水平。显示了两个技术复制品的平均值±标准差。克，中处理的细胞代表性图像图6e（放大倍数，×10）。

致谢

脚注

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