Distinct p53 transcriptional programs dictate acute DNA-damage responses and tumor suppression

doi:10.1016/j.cell.2011.03.035

.2011年5月13日；145(4):571-83.

doi:10.1016/j.cell.2011.03.035。

独特的p53转录程序决定了急性DNA损伤反应和肿瘤抑制

科琳·A·布雷迪¹, Dadi Jiang公司, 斯蒂芬诺·梅洛, 托马斯·约翰逊, 莱斯利·A·贾维斯, 玛格丽特·科扎克, 丹妮拉·肯泽尔曼·布罗兹, 沙什瓦蒂·巴萨克, 尤妮斯·J·帕克, 玛格丽特·麦克劳林, 安东尼·卡内齐斯, 劳拉·阿塔迪

附属公司

PMID： 21565614
预防性维修识别码：项目经理3259909
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2011.03.035

不同的p53转录程序决定了急性DNA损伤反应和肿瘤抑制

科琳·A·布雷迪等。单元格. 2011.

.2011年5月13日；145(4):571-83.

doi:10.1016/j.cell.2011.03.035。

作者

科琳·A·布雷迪¹, Dadi Jiang公司, 斯蒂芬诺·梅洛, 托马斯·约翰逊, 莱斯利·贾维斯, 玛格丽特·科扎克, 丹妮拉·肯泽尔曼·布罗兹, 沙什瓦蒂·巴萨克, 尤妮斯·J·帕克, 玛格丽特·麦克劳林, 安东尼·卡内齐斯, 劳拉·阿塔迪

附属

¹美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院放射肿瘤学系放射与癌症生物学部，邮编94305。

PMID： 21565614
预防性维修识别码：项目经理3259909
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2011.03.035

摘要

p53介导的肿瘤抑制的分子基础尚不清楚。在这里，为了阐明p53肿瘤抑制的机制，我们使用表达一系列p53转录激活突变体的等位基因敲除小鼠。微阵列分析表明，一个突变型p53（25，26）严重损害了大多数p53靶基因的反式激活，而且，p53（25,26）不能诱导G（1）-阻滞或凋亡以应对急性DNA损伤。令人惊讶的是，p53（25,26）在衰老和肿瘤抑制中保持着强大的活性，这表明大多数已知p53靶点的有效反式激活对于这些途径是不必要的。相反，反式激活缺失型p53（25,26,53,54）突变体不能诱导衰老或抑制肿瘤发生，如p53基因缺失。因此，p53反式激活对肿瘤抑制至关重要，但有趣的是，它与一小部分新的p53靶基因相关。总之，我们的研究区分了参与急性DNA损伤反应和肿瘤抑制的p53转录程序，这是设计治疗药物的关键目标，这些药物可以阻止化疗的p53依赖性副作用，而不影响p53肿瘤抑制。

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数字

**图1。p53 TAD突变敲除小鼠的产生**
**（A）**用于产生p53敲除小鼠的靶向方案^25,26,53,54以突变体为例。突变体*第53页*靶向等位基因的表达被沉默，直到Cre的引入允许删除停止元件。灰色虚线表示HindIII消化后每个等位基因产生的片段大小。**（B）**与野生型细胞系相比，Southern blot显示2个靶向正确的杂合ES细胞克隆。基因组DNA用HindIII消化，Southern blot用（A）中所示的3’外部探针探测。**（C）**反向补体的序列分析证实了在适当靶向的细胞系中存在点突变。**（D）**p53示意图^25,26，p53^53,54和p53^25,26,53,54显示反式激活域（TAD）、DNA结合域（DBD）和寡聚化域（OD）的蛋白质。**（E）**表总结了整个手稿中使用的样本的基因型、治疗和最终功能性p53状态。*LSL静音*表示任何*Lox-Stop-Lox箱*p53 TAD突变体。**（F）**野生型或纯合型p53蛋白的Western blot分析*第53页^{LSL-mut公司}*用Ad-Cre或Ad-empty转换的MEF（表示为*第53页*null），未经处理（UT）或用0.2µg/ml dox（阿霉素）处理8小时（8）。β-actin作为负荷控制。p53免疫染色证实Cre重组的效率相当高（>90%的细胞）。**（G）**野生型或纯合型p53的免疫荧光*第53页^{LSL-mut公司}*用Ad-Cre或Ad-空转导的MEFs。细胞未经处理（左）或用0.2µg/ml dox处理以稳定p53（右）。细胞核用DAPI染色。

**图2。p53 TAD突变体转录激活电位分析**
**（A）**（上图）使用p53依赖性基因集定义p53 TAD突变体的反式激活能力的热图，该基因集通过微阵列分析通过比较6HrasV12；第53页野生型设置为6HrasV12；第53页MEF样本为空。列表示独立的MEF行。（下）热图检查确认的直接p53靶基因上的p53突变活性（Brady和Attardi，2010；Riley等人，2008）。**（B）**使用来自（A）的RNA样本进行Northern杂交。**（C）**ChIP显示p53^25,26,53,54绑定到中的p53响应元素*第21页*启动子而不是下游3kb的无关区域。p16抗体作为阴性对照。**（D）**未经处理（白色条）或用0.2µg/ml dox处理8小时（黑色条）的MEF RNA的qRT-PCR。图中显示了首先归一化为β的数量的平均值+/-SEM-*肌动蛋白*然后从3个独立的MEF线获得野生型未经处理的样本值。*表示p>0.05 v的差异不显著。*第53页*无效的。另请参见图S1。

**图3。第一个p53 TAD在急性DNA损伤反应中起主导作用**
**（A）**来自异步野生型MEF的代表性碘化丙啶和BrdU流式细胞术数据显示G₁γ射线照射后的阻滞反应。**（B）**γ辐照处理/未处理MEF的平均S相比。野生型，*第53页^{LSL-25,26/LSL-25,26}，p53^{LSL-53,54/LSL-53.54}*、和*第53页^{LSL-25,26,53,54/LSL-252,26,53.54}*用Ad-Cre或Ad-empty感染细胞并进行照射。绘制了3-5个实验的平均值+/-SD。*表示p<0.001v的显著差异。*p53重量*，使用Bonferroni事后测试进行单向方差分析。**（C）**p53的免疫染色^25,26-表达小肠（顶部）和胸腺（底部）*Rosa26CreER；第53页^25,26/25,26*用三苯氧胺治疗的小鼠。**（D）**典型的TUNEL染色图像显示小肠中的凋亡细胞（箭头）。野生型*p53，p53^{LSL-wt/LSL-wt}*（重量*），*第53页^{LSL-25,26/LSL-25,26}，p53^{LSL-53,54/LSL-53.54}*、和*第53页^{LSL-25,26,53,54/LSL-252,26,53.54}*携带*Rosa26CreER公司^T2段*用三苯氧胺处理等位基因并照射，6小时后收集组织。用三苯氧胺治疗的Cre阴性小鼠作为*第53页*null控件。**（E）**每个基因型至少4只小鼠每100个小肠窝+/-SD中TUNEL阳性细胞的平均数量。*表示p<0.001v的显著差异。*p53重量*，使用Bonferroni事后测试进行单向方差分析。**（F）**胸腺的典型TUNEL染色，箭头指示凋亡。

**图4。第53页^25,26，但不是p53^25,26,53,54，诱导HrasV12 MEF细胞衰老**
**（A）**一段时间内BrdU阳性细胞的平均百分比。左：HrasV12-表达*第53页^+/+，p53^{LSL-25，26/LSL-25，26}*、和*第53页^{LSL-25,26,53,54/LSL-252,26,53.54}*MEF感染Ad-Cre并培养。显示了显示BrdU阳性的p53阳性细胞的总百分比。右：HrasV12-表达*第53页^+/+，p53^53,54/53,54*、和*第53页^{LSL-53,54/LSL-53.54}*(*第53页*null）的MEFs进行培养并分析BrdU掺入。图表下的时间线表示Ad-Cre后的任何一天（在*HrasV12型*转导；left）或天后*HrasV12型*转导（右图，未使用Ad-Cre）。每个基因型至少有3个细胞系的平均+/-SEM图。**（B）**衰老相关靶基因表达的qRT-PCR分析*p21、Pai-1和Pml*在里面*HrasV12型*MEF公司**（C）**Pml免疫染色*HrasV12型*衰老分析最后时间点的MEF。DAPI染色细胞核。**（D）**MacroH2A染色*HrasV12型*衰老分析最后时间点的MEF。DAPI染色细胞核。**（E）**SA-β-半乳糖苷酶染色的相位对比图和形态学*HrasV12型*衰老分析最后时间点的MEF。另请参见图S2。

**图5。第53页^25,26和p53^53,54，但不是p53^25,26,53,54，是有效的肿瘤抑制剂**
*喀斯特^{LSL-G12D型/+}*带有*第53页^+/+*（n＝9），*第53页^{LSL-25,26/LSL-25,26}*（n=6），*第53页^{LSL-53,54/LSL-53.54}*（n=12），*第53页^{LSL-25,26,53,54/LSL-252,26,53.54}*（n=13），或*第53页^−/−*（n=6）状态在6-8周时用Ad-Cre鼻内感染，12周后采集肺部。**（A）**来自*喀斯特^G12D系列;第53页^+/+*和*喀斯特^G12D系列;第53页^−/−*老鼠，箭头指示肿瘤。**（B）**所有基因型小鼠中宏观肺肿瘤的平均数量+/-SD。**（C）**所有基因型小鼠的平均肿瘤负担，计算为H&E染色切片上肿瘤总面积与肺总面积之比，+/−SD。*表明无显著差异，p>0.05 v。*第53页*野生型**表示p<0.001v的显著差异。*p53重量*，单向ANOVA Bonferroni事后测试。**（D）**每个基因型肺的代表性组织切片。

**图6。微阵列分析确定与肿瘤抑制相关的p53靶点**
**（A）**基因表达谱*HrasV12型*MEF来自*第53页*保留野生型p53抑癌活性的基因型(*wt p53、p53^53,54/53,54*和*第53页^25,26/25,26*)与那些缺乏p53抑癌活性的人进行比较(*第53页^{25、26、53、54/25、26、53、54}*和*第53页*null）。与野生型组相比，这些基因表达的标准偏差至少高出野生型组的2倍和1.5倍*第53页*null组被用作p53标记来预测*第53页*PCA对人类乳腺癌样本的状态（Miller等人，2005；Blue=wt p53，p53^53,54和p53^25,26MEF，红色=p53^25,26,53,54和p53空MEF，绿色=p53^重量人类乳腺癌，粉红色=p53^{多用途终端}人类乳腺癌）。**（B）**Kaplan-Meier曲线证明了MEF p53信号在按患者生存率分层人类乳腺癌样本中的有效性；p=0.0422，对数秩检验。**（C）**示意图显示了识别潜在参与肿瘤抑制的p53靶基因的方法。**（D）**显示14个符合（C）中所述筛选标准的基因的热图。**（E）**qRT-PCR验证显示靶基因的平均表达水平+/-SDHrasV12型MEF纯合子*wt p53、p53^25,26*，或*第53页*零等位基因，归一化至*β-肌动蛋白*.（F）DNA损伤对靶基因的诱导依赖于GM00011人成纤维细胞中的p53。qRT-PCR证明了*第53页*用击倒*第53页*shRNA与加扰对照shRNA的比较（左）以及用0.2µg/ml dox治疗24小时后靶基因诱导的p53依赖性（右）。值是3个重复+/-SD的平均值。**（G）**用0.2µg/ml dox处理6小时的野生型MEF中p53与靶基因共有位点结合的ChIP。IgG抗体作为阴性对照。数值表示与不相关基因沙漠位点的结合相比，与p53一致位点的结合的倍数增加，是3次重复+/−SD的平均值。另见图S3。

**图7。新型p53靶基因产物显示抑癌活性**
**（A）**免疫荧光标记HA-tagg蛋白的定位*HrasV12；p53无效*MEF公司。**（B）**BrdU标记的量化*HrasV12；p53缺失*表达不同靶基因产物的MEF和转染后24小时的BrdU脉冲。用免疫荧光法测定HA阳性细胞的BrdU标记指数。将数值标准化为表达HA-GFP的细胞的增殖指数，并将p53用作阳性对照。显示平均值+/-SD。**（C）**表达p53或不同靶基因产物的H1299和Saos2细胞中BrdU标记的量化，如（B）所述。显示了平均值+/-SEM。**（D）**平均肿瘤体积+/−SEM，作为时间的函数，in科学与发展部小鼠注射*E1A-人力资源V12*转化的MEF可击倒各种基因。shGFP对照肿瘤由每个图中的蓝线指示并标记为*。**（E）**急性DNA损伤与致癌信号反应中p53作用的模型。p53对急性DNA损伤（包括细胞凋亡和细胞周期阻滞）的反应依赖于第一个p53 TAD的活性和典型p53靶基因（如*p21，诺萨，彪马*、和*Perp公司*相反，衰老和肿瘤抑制中致癌信号下游的p53反应可由p53 TAD驱动。更有限的p53反式激活程序，例如通过有效激活由第一或第二个p53 TAD调节的新p53靶基因，包括*Phlda3、Abhd4*、和*Sidt2公司*，可以解释p53在这些上下文中的功能。**（F）**表格总结了整个研究中的发现**表示大多数但不是所有p53靶基因的最小反式激活。另请参见图S4。

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中的注释

分析p53转录激活。
坎皮西J。坎皮西J。开发单元。2011年5月17日；20(5):573-4. doi:10.1016/j.devcel.2011.04.015。开发单元。2011 PMID：21571212

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1. Barboza JA、Liu G、Ju Z、El-Naggar AK、Lozano G.p21通过保持染色体稳定性延缓肿瘤发病。美国国家科学院院刊。2006;103:19842–19847.-项目管理咨询公司-公共医学
1. 加利福尼亚州布雷迪，阿塔迪。p53基因。细胞科学杂志。2010;123:2527–2532.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Brown JP，Wei W，Sedivy JM.正常二倍体人成纤维细胞p21CIP1/WAF1基因断裂后的衰老旁路。《科学》（纽约，NY.1997；277:831-834）。-公共医学

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