AKAP150依赖性协同TRPV4通道门控是内皮依赖性血管舒张的核心，在高血压中被破坏

毒蕈碱受体刺激通过PKC激活MEP相关的TRPV4通道

毒蕈碱受体[EC中的M3亚型(5)]以及通过Gα发出信号的其他G蛋白（异源三聚鸟嘌呤核苷酸结合蛋白）偶联受体（GPCR）_问，刺激磷脂酶C（PLC）产生IP_三和二酰甘油（DAG），DAG反过来激活IP_三Rs和PKC。确定是否通过GPCR-Gα对TRPV4火花进行CCh刺激_问-在EC中，我们测试了药物抑制PLC和激活PKC的作用。在没有GSK101的情况下，使用PLC抑制剂U73122进行预处理可防止CCh激活火花(表1)与PLC参与信号通路一致。用DAG类似物1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油（OAG）或PKC活化剂佛波酯-肉豆蔻酸酯醋酸盐（PMA）直接活化PKC，在MEP诱导的TRPV4火花活性与CCh诱导的相似(图1C). OAG和PMA都增加了每个字段的活动站点数量NP公司_哦每个站点(表1). 迷你网站的数量和NP公司_哦在存在选择性PKC抑制剂Gö-6976的情况下，CCh、OAG或PMA不会改变每个位点(图1C和表1). TRPV4拮抗剂HC-067047阻止了对CCh、OAG或PMA反应时火花活动的增加(图1C和表1). 在GSK101存在的情况下也获得了类似的结果(图1E,表1、和图S3、A至C). OAG和PMA仅在MEP站点诱导火花活动，对非MEP站点的火花活动没有影响(图1E和图S3、B和C). 缓激肽，另一种G的激动剂_问-耦合的GPCR，也以PKC依赖的方式在MEP处诱导TRPV4火花(图S4). 总的来说，这些结果表明G_问-耦合GPCR信号到MEP放大的TRPV4通道由PLC-DAG-PKC途径介导。

AKAP150将PKC锚定在MEP上，通过毒蕈碱受体介导TRPV4火花的激活

事实上G_问-TRPV4火花的耦合GPCR激活是PKC依赖性的，并且特别发生在MEP，这表明存在通道相关或MEP放大的PKC池。激酶与通道的关联通常由AKAP家族的支架蛋白介导(36)和AKAP150，这与TRPV4通道的PKC激活有关(24)SMC中的VDCC(37,38)是一个可能的候选人。

固定组织的免疫荧光成像显示AKAP150集中在MEP周围区域(图2A)而PKCα在EC中广泛分布，包括MEP(图S5). 在内部弹性板约93%的孔洞处观察到AKAP150免疫荧光，定义为孔洞中心5µm范围内的峰值染色。从EC的底面到SMC的顶面，通过内部弹性层拍摄的一系列z轴共焦图像显示，内部弹性层中的所有平面上都存在AKAP150(图2B)在最靠近SMC的投影端观察到最强的AKAP150染色(电影S1和图2B).大多数AKAP150免疫荧光以孔洞为中心(图2，A和B)，空间扩展（半最大振幅的最大宽度）为14.5±0.6µm²(n个=104个MEP）。

在单独的窗口中打开

图2

CCh诱导激活TRPV4火花需要MEP-localized AKAP150

(一个)C57BL6小鼠肠系膜动脉表面标本的图像显示，AKAP150免疫染色（中央，红色）位于内弹性层（IEL）水平（左侧，绿色）；IEL中93.1±0.8%的孔显示AKAP150免疫染色(n个=10个场，5条动脉）。合并图像中的虚线表示两个EC的轮廓。(B类)沿z轴（3µm，0.1-µm光学切片），显示穿过IEL深度的AKAP150荧光密度。已重建x轴和yz公司图像显示沿着MEP的AKAP150免疫染色，在投影末端染色最强。痕迹是AKAP150染色的曲线图x和年通过三维视图中显示的投影，获得5µm宽的横断面的轴。(C类)代表前/后₀微量TRPV4 Ca²⁺野生型（WT）小鼠和AKAP150肠系膜动脉中的火花^−/−老鼠（底部）。实验在WT和AKAP150的Fluo-4负荷肠系膜动脉中进行^−/−CPA（30µM）和GSK101存在的小鼠。每种颜色代表来自单个感兴趣区域（ROI）的轨迹。(D类)显示CCh诱导的WT和AKAP150肠系膜动脉内皮细胞火花活动增加的条形图^−/−GSK101存在的小鼠。数据为平均值±SEM(n个=5至6个区域，4至5条动脉；P（P）< 0.01,t吨测试）。有关钻孔数量和尺寸以及IEL深度的信息，请参见表S4.

为了测试AKAP150在将PKC锚定在TRPV4通道附近的作用，我们检测了毒蕈碱受体刺激对AKAP150携带Fluo-4的肠系膜动脉内皮TRPV4火花活动的影响^−/−老鼠(39)，不表示GCaMP2。在GSK101的存在下（增加基础活性），CCh增加了野生型小鼠Fluo-4负荷肠系膜动脉MEP的火花活性，但对AKAP150动脉的火花活性没有影响^−/−老鼠(图2、C和D). 因此，在MEP处毒蕈碱受体介导的依赖PKC的TRPV4通道激活需要AKAP150。

MEP处TRPV4通道开口的更强合作性导致局部Ca增加²⁺流入，流入

火花站点内的TRPV4通道协同工作，很可能是四通道亚结构(6). 在GSK101的存在下，整个细胞膜的TRPV4通道活性增加(图3A左图），MEP站点的影响明显大于单元中其他站点的影响(图3A，右侧）。量子能级的最大数量——荧光逐级增加，每个能级对应于与单个通道打开相关的荧光的倍数——在MEP和非MEP位置都是四个(图S6、A和B). 由于TRPV4通道复合体在MEP和非MEP位点的基本结构相似，我们假设MEP处TRPV4的通道活性增加是由于增强了协作门控（也称为功能耦合）。我们应用了一个耦合马尔可夫链模型(40)确定Ca内TRPV4通道之间的耦合系数（κ）²⁺sparket sites，这是我们以前用来检查VDCC之间耦合强度的方法(37,41). κ值的范围从0（独立打开的通道）到1（同时打开和关闭的“紧密”耦合通道）。使用此方法和κ≥0.1作为功能耦合的阈值(37)我们发现GCaMP2小鼠动脉制剂中约86%的MEP火花位点和约28%的非MEP火花部位显示TRPV4通道的耦合门控。在GCaMP2动脉和Fluo-4负载野生型动脉中，MEP部位TRPV4火花的平均耦合系数高于非MEP部位的TRPV4(图3、B和C). 统计分析，测试实验观测到的开放概率的偏差(P（P）_哦)在假设独立通道门控的情况下，来自二项式分布的TRPV4通道证实了这些结果，表明在GCaMP2小鼠的动脉制剂以及野生型小鼠的Fluo-4负载动脉中，与非MEP位点相比，协同性显著增加了MEP位点的TRPV4活性(图S7). 我们证实，在基线条件下（即在没有GSK101的情况下），TRPV4火花是功能耦合的，并且使用的低浓度（3nM）GSK101不会影响MEP位置的耦合系数(图S8). 这些结果表明，TRPV4通道在MEP处表现出更强的合作开放性，从而提供更高的Ca²⁺进入这个微域。

在单独的窗口中打开

图3

AKAP150和当地Ca²⁺负责MEP处TRPV4通道的耦合选通

TRPV4钙²⁺在含有CPA（30µM）和GSK101（3 nM）的面部制剂中，在GCaMP2小鼠肠系膜动脉或Fluo-4负载肠系膜血管中记录火花。(一个)左：GSK101对活动TRPV4通道平均数的影响(NP公司_哦)每个字段(n个=7个场，5条动脉）。右：每个站点的Sparklet活动(*P（P）< 0.05,t吨测试；n个=21至38个站点）以及MEP和非MEP站点每个字段的迷你站点百分比(*P（P）< 0.05,t吨测试；n个=7个字段）。(B类)代表前/后₀来自四种不同TRPV4 Ca的痕迹²⁺EC膜上MEP和非MEP位置的火花点[量子水平：0.19Δ前/后₀(1)]. 每条记录道上方显示了各自的耦合系数（κ）值。(C类)散点图，指示MEP和非MEP位置火花点的单个κ值。显示了每组的平均耦合系数和SEM(P（P）< 0.01,t吨测试）。（D） WT和AKAP150肠系膜动脉MEP和非MEP位置的每个部位的火花活动^−/−老鼠(*P（P）< 0.05,t吨测试；14至25个站点）。（E） 代表前/后₀来自四种不同TRPV4 Ca的痕迹²⁺在不存在（左，黑色）或存在（右，青色）EGTA-AM（10µM，在36°C下持续10分钟）或AKAP150的情况下，WT小鼠的MEP上的闪光位点^−/−（中，黄色）小鼠。各个κ值显示在上面前/后₀记录[量子水平：0.29Δ前/后₀(1)]. （F） 散点图显示了（E）中各组MEP火花点的单个κ值。该图还显示了各组的平均耦合系数和SEM(n个=8至27个站点）。使用带有事后Bonferroni检验的单向方差分析来估计P（P）值。P（P）WT MEP组与所有其他组以及WT非MEP组与EGTA非MEP组均<0.05。

TRPV4通道的协同开放依赖于AKAP150和细胞内钙²⁺

MEP处的TRPV4通道表现出两个显著特征：（i）AKAP150和PKC（AKAP150/PKC）依赖性激活和（ii）与通道合作性相关的通道活性增加。AKAP150可以通过几种可能的机制增强合作通道活性，包括变构蛋白-蛋白质相互作用和AKAP150结合PKC增加TRPV4磷酸化。在对后一种可能性的测试中，我们发现，尽管用PMA激活CCh和PKC都增加了MEP的闪光活性(图1、C和E)，均未改变MEP处TRPV4通道之间的耦合系数(图S8)这表明PKC不负责MEP的渠道合作。与此一致，Gö-6976对PKC的抑制并不影响GSK101-激活通道的耦合系数(图S8).

为了确定AKAP150是否独立于PKC调节TRPV4协同作用，我们比较了野生型和AKAP150在Fluo-4负荷肠系膜动脉MEP中GSK101诱导的TRPV4火花的特性^−/−老鼠。GSK101刺激后，来自AKAP150的MEP每个站点的TRPV4火花活动^−/−小鼠数量少于来自野生型小鼠的MEP(图3D). 缺少AKAP150消除了MEP和非MEP站点之间火花活动的差异(图3D). 两种基因型MEP位点和非MEP位点耦合强度的比较(图3、E和F)表明AKAP150中MEP位点TRPV4通道的κ值^−/−在野生型小鼠中，小鼠明显低于MEP部位(图3C). 野生型小鼠EC中95%的MEP火花位点显示了耦合门控，而AKAP150中只有33%的这些位点显示出耦合门控^−/−将小鼠配对。总的来说，来自AKAP150的肠系膜EC中MEP位点的TRPV4火花特性^−/−在野生型小鼠的EC中，小鼠与非MEP位点（也缺乏AKAP150）的小鼠相似(图3，A到C). 因此，AKAP150大大增强了MEP的协作性，但在没有耦合选通的情况下，并没有完全消除耦合选通。

因为TRPV4通道通过细胞内钙表现出浓度依赖性增强²⁺(42,43)Ca局部增加²⁺钙引起的浓度²⁺四通道集群中通过其他TRPV4通道的流入可能有助于合作活动。为了测试这个，我们破坏了Ca²⁺-通过螯合细胞内钙进行依赖性通道间通信²⁺虽然EGTA适度降低了非MEP站点TRPV4信道的耦合系数，但在MEP站点却显著降低了耦合系数，基本上消除了两个站点之间的合作性差异(图3、E和F). 此外，TRPV4通道协同性诱导Ca增加²⁺AKAP150的流入量较低^−/−小鼠和在EGTA存在下(图S7). 因此，MEP位点的协同TRPV4通道门控依赖于AKAP150和细胞内Ca²⁺.

PKC和离子通道的MEP定位有效地将毒蕈碱受体信号与TRPV4依赖性血管舒张联系起来

我们之前报道过，GSK101在每个EC中直接激活三个TRPV4通道可通过激活IK通道实现最大的血管扩张(6). 为了确定这种高效的血管舒张信号机制是否延伸到毒蕈碱受体途径，我们测量了血管内压收缩的肠系膜动脉中CCh的血管舒张和TRPV4火花活动（80 mmHg；见材料和方法）(6). 直径是在存在我-NNA（硝基-我-精氨酸；NOS抑制剂）和吲哚美辛（COX抑制剂）分离EDH依赖性舒张，并使用和不使用TRPV4拮抗剂HC-067047测定TRPV4组分(图4A). 对TRPV4火花活性和直径变化的分析表明，每个细胞少于一个活性TRPV4通道的随机等效性足以对CCh产生约50%的膨胀(图4B). Gö-6976对PKC的抑制减弱了CCh诱导的舒张作用，而直接激活TRPV4通道（GSK101）或IK通道（NS309）诱导的血管舒张作用不受Gö6976的影响(图S9、A和B). 在IK通道抑制剂charybodotoxin的存在下，CCh的扩张几乎完全被阻断(图S9、A和B). 总的来说，这些结果表明毒蕈碱受体介导的MEP放大的TRPV4通道的刺激通过PKC和IK依赖性途径有效地传递延迟信号。

在单独的窗口中打开

图4

每个EC激活不到一个TRPV4通道导致肠系膜动脉最大扩张

(一个)条形图显示了在NOS和COX抑制剂存在的情况下，仅对CCh（Con）的延迟反应我-NNA（100µM）和吲哚美辛（Indo；10µM我-NNA、Indo和HC-067047（1µM；TRPV4抑制剂），以确定依赖于TRPV4的EDH介导的扩张。最大膨胀被定义为钙存在时的膨胀²⁺-免费PSS。数据为平均值±SEM(n个=5至7条动脉）*P（P）<0.05，使用单因素方差分析和事后Bonferroni检验。(B类)CCh引起的HC-067047敏感性（TRPV4）扩张成分和GSK101被绘制为每个EC的平均TRPV4通道活性的函数。通过将EC中所有火花位点的荧光积分除以一个量子能级（一个通道）持续2分钟的荧光积分，估算了整个2分钟记录期间每个EC激活的TRPV4通道的平均数量。数据为平均值±SEM(n个=5至7条动脉扩张；每个小区的平均信道数为14至26个小区）。

动物程序

本研究中使用的动物程序符合机构指南，并得到佛蒙特大学和华盛顿大学动物护理和使用委员会的批准。野生型C57BL6/J，转基因GCaMP2^{缝隙连接蛋白40}和AKAP150^−/−(39)使用小鼠。GCaMP2^{缝隙连接蛋白40}小鼠表达循环排列的Ca²⁺传感器GCaMP2由连接蛋白40(缝隙连接蛋白40)促进剂(34,35)，限制GCaMP2在血管壁中的EC表达。成年（3至4个月大）雄性小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg），然后开胸行安乐死。将肠系膜动脉的三级分支（内径约100-µm，80 mmHg）分离到由10 mM Hepes、134 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM MgCl组成的Hepes缓冲生理盐溶液（Hepes–PSS-1）中₂，2 mM氯化钙₂，7mM葡萄糖，用NaOH调节至pH 7.4。动脉完整用于加压动脉研究，或纵向切割并固定在SYLGARD块上，内皮面朝上，用于内皮细胞钙显像的正面准备²⁺信号和AKAP150免疫染色。

加压动脉

如前所述进行加压动脉的直径测量(6,33). 简单地说，肠系膜动脉被剥离并脱离周围组织，安装在动脉造影室（生活系统仪器）中类似大小的玻璃吸管上。然后在不含Hepes[119 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.2 mM KH的预热（36°C）PSS中将动脉加压至80 mmHg至少45分钟₂人事军官₄，1.2 mM氯化镁₂，2 mM氯化钙₂，7 mM葡萄糖，24 mM NaHCO_三（pH 7.4）]，不断用20%的O冒泡₂和5%CO₂使用CCD（电荷耦合器件）摄像机和边缘检测软件（IonOptix）连续监测内径。将所有化合物添加到PSS中，PSS通过动脉造影室持续再循环。在每个实验结束时，用无钙PSS治疗动脉[119 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.2 mM KH₂人事军官₄，1.2 mM氯化镁₂，7 mM葡萄糖，24 mM NaHCO_三，5 mM EGTA（pH 7.4）]以获得最大膨胀。肌原性张力计算如下：

其中直径_基底的是在80 mmHg压力下动脉的基底直径。肠系膜动脉扩张表现如下：

其中直径_膨胀的是添加CCh、GSK101或NS309后的直径。

EC膜片钳和通道数计算

如前所述，从三级肠系膜动脉新鲜分离出内皮细胞(6,63,64). 正常血压小鼠内皮细胞的平均膜电容为14.6±0.7 pF(n个=11个细胞），来自高血压小鼠的为14.0±1.8 pF(n个＝13个细胞）。使用穿孔贴片配置和Hepes-PSS-2沐浴液（与Hepes–PSS-1相同，只是含有10 mM葡萄糖而非7 mM葡萄糖），在+100 mV的新分离的内皮细胞中记录宏观TRPV4、IK和SK电流。移液管溶液由10 mM Hepes、30 mM KCl、10 mM NaCl、110 mM K-天冬氨酸和1 mM MgCl2组成（用NaOH调节至pH 7.2）。

与我们之前所做的一样，通过使用100 nM GSK101刺激获得最大TRPV4通道电流(6). 使用传统的全细胞膜片钳记录用10 mM Hepes、123.2 mM KCl、10 mM NaCl、5.5 mM MgCl组成的移液管溶液透析的孤立内皮细胞的最大IK和SK电流₂，0.2 mM氯化钙₂和5 mM HEDTA（用16.8 mM KOH调节pH值为7.2），并含有3µM游离钙²⁺和1 mM游离镁²⁺，使用Maxchestrator程序（C.Patton，美国加利福尼亚州斯坦福大学）计算，以最大化通道活性(6,63,64). IK通道电流是根据用河豚毒素治疗后电流的减少来确定的，而SK通道电流是通过电流的进一步减少以及随后添加阿帕明来确定的。

任何类型的电流和膜电位之间的关系都可以用Goldman-Hodgkin-Katz恒定场方程来描述（65,66）。对于K⁺由IK和SK通道介导的电流，此关系表示如下：

其中P_k个是通道对K的渗透率⁺离子（cm/s）；【K】⁺]_o个和[K⁺]_我是K的浓度⁺分别位于细胞外和细胞内；E类是膜电位（V）；F类是法拉第常数；R（右）是气体常数；和T型是温度（开尔文）。单通道渗透率K值⁺(P（P）_k个)之前我们实验室报告的，为8.7872×10⁻¹⁴IK通道为cm/s，2.1968×10⁻¹⁴SK频道为cm/s(64). 每个EC的IK和SK通道数由宏观电流方程确定，I=N×I×P_哦，其中N个是通道数，我是单通道电流，以及P（P）_哦是通道的开放概率。单通道电流(我)，使用[K在−70 mV下计算⁺]_o个=6 mM和[K⁺]_我=140 mM，IK通道为0.073 pA，SK通道为0.018 pA。平均全细胞（宏观）电流(我)IK通道在−70 mV时为38.67 pA(n个=6个EC）和4.88 pA（对于SK信道(n个=5 EC）。以前出版过P（P）_哦值为0.7(67,68)和0.8(69)分别用于IK和SK通道。

每个EC的TRPV4通道数如前所述进行计算(6).

EC钙²⁺成像

钙²⁺如前所述，利用Revolution Andor共焦系统（Andor Technology）对EC中的信号进行成像，该共焦系统由带有60×浸水物镜[数字孔径（NA）1.0]的直立尼康显微镜和电子倍增CCD相机组成(4,6,33). 简而言之，使用Andor Revolution TL采集软件（Andor Technology）以15帧/秒的速度采集GCaMP2小鼠的动脉图像，30帧/秒采集Fluo-4加载的动脉图像。与钙相关的排放变化²⁺用固体激光器在488nm处激发，用527.5/49nm带通滤波器收集发射的荧光，检测结合，中心波长为527.5nm，保证最小带宽为49nm。钙²⁺成像实验在36°C下进行。TRPV4钙²⁺火花在1.7-µm定义的ROI内进行分析²框（5×5像素）位于对应于峰值TRPV4 Ca的点²⁺火花振幅。野生型C57BL6小鼠和AKAP150的制剂中^−/−在成像前，在30°C和普鲁尼酸（2.5 mg/ml）存在下孵育45分钟，用Fluo-4（10µM）装载小鼠EC。视野为~113×136µm，相当于每个视野14.5±0.5个细胞(n个=6个字段）。包括CPA（30µM，15分钟）以消除IP_三R介导的钙²⁺发送信号。在CCh、PMA或OAG治疗前和治疗后5分钟记录图像。在用CCh、OAG或PMA和HC-067047（1µM，10 min）处理之前添加Gö-6976（1µ）。显示前/后₀使用截止角频率为3.98 Hz的高斯滤波器对记录道进行滤波。对应前/后₀图中所示的痕迹表示治疗前后的ROI相同。MEP被确定为内部弹性层中的黑洞，对应于无自荧光(4,19,22). 自动荧光图像中最小孔洞的直径为2 mm，用作定义孔洞的低端截止线。MEP处的火花点被确定为在内部弹性层孔中心5 mm范围内具有荧光峰值的点。活性的变化表示为相对于对照的倍数变化。

免疫染色

手术开放的动脉安装在硅胶块上，用冰镇丙酮固定10分钟，用0.2%Triton X渗透，用5%正常驴血清封闭，用AKAP150（sc-6445，1:250；Santa Cruz Biotechnology Inc.）、IK通道（APC-064，1:500；Alomone Labs）或PKCα（sc-208；Santa Cruz Biotechnology Inc.）在4°C下过夜。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗五次后，在室温下用Alexa Fluor 568–结合驴抗羊或抗兔二级抗体（1:500；Life Technologies Corp.）培养动脉90分钟。如上所述，用Revolution Andor共焦系统对动脉进行成像。通过固态激光器在488nm处激发，并使用527.5/49nm带通滤波器收集发射的荧光，评估内部弹性薄板的自荧光。AKAP150免疫染色通过在560nm处激发并使用641.5/117nm带通滤波器收集发射的荧光来评估。AKAP150免疫染色孔被鉴定为内弹性层孔中心5µm范围内的峰值染色孔。对于三维体绘制，图像沿z轴从内皮基部到平滑肌表面的增量为0.1-µm。系统的z分辨率为1.2µm。使用Andor iQ软件重建Z堆栈图像。AKAP150染色的MEP数量表示为内部弹性层中孔总数的百分比。我们经常使用这种AKAP150抗体(38)对SMC中的AKAP150进行免疫染色，并在AKAP150中测试其特异性^−/−老鼠(60)使用竞争肽（Santa Cruz Biotechnology）和PBS替代。在这些条件下，AKAP150相关免疫染色不存在。

血管紧张素II输注和血压测量

收缩压采用尾剪断容积描记法（哥伦布仪器公司）记录。简单地说，在连续两天记录基线收缩压之前，对3至4个月大的小鼠进行1周（每天两次）的训练。为了植入渗透微型泵，用5%异氟醚麻醉小鼠，并在100%氧气中吸入2%异氟醚₂如前所述，将含有Ang II（Bachem）的渗透微型泵（ALZET 2004；Durect Corp.）植入皮下(49). Ang II的输注速率为1.4 mg/kg/天。麻醉恢复后，老鼠被关在单独的笼子里，可以自由获得食物和水。微泵植入后第4、7、10、14、18和21天继续进行收缩压记录。用0.9%生理盐水灌注小鼠3周后的收缩压（120.9±4.6 mmHg，n个=4只小鼠）与正常C57BL6/J小鼠无差异。CCh（1µM）诱导的盐水小鼠肠系膜动脉扩张（79.1±4.5%最大值，n个=4）也与正常C57BL6/J小鼠无差异。因此，未融合的C57BL6/J小鼠被用作后续实验的对照组。

TRPV4火花活性的计算

如前所述，使用A.Bonev编写的定制设计软件分析TRPV4火花活动(6). 分数荧光(前/后₀)通过将收集到的图像中ROI的荧光除以相同ROI中10张无活性图像的平均荧光，得到一个位置。使用梯形数值积分计算每个事件的曲线下面积（AUC）([F–F₀]/F类₀随着时间的推移，以秒为单位）。TRPV4Ca的活动²⁺sparket站点被确定为该站点在2分钟记录时间内所有事件的AUC总和。将一个字段中所有迷你图站点的活动积分相加，以获得该字段的总迷你图活动。在配对实验中，比较处理前后每个场的Sparklet活性。类似地，对一个字段中所有sparket站点的活动积分进行平均，以获得该字段中每个站点的活动。

估算P（P）_哦和渠道活动(NP公司_哦)在一个迷你网站上的TRPV4频道

活动TRPV4通道的平均数量，NP公司_哦(N个，频道数量；P（P）_哦，观察到的开放概率），计算为

哪里T型是MEP和非MEP火花点观测到的每个量子能级的驻留时间，以及T型_全部的是记录的持续时间，使用Clampfit的单通道搜索模块和所有点直方图中的已知量子振幅（Δ前/后₀GCaMP2小鼠为0.19，Fluo-4负荷动脉为0.29）(6).NP公司_哦通过平均获得每个站点NP公司_哦对于一个字段中的所有站点。这个NP公司_哦将3到10个字段中每个站点的值平均，以获得平均值NP公司_哦每个站点。NP公司_哦通过求和以类似的方式估计每个单元格或每个字段NP公司_哦整个单元格或字段上的每个站点。实验观察到的P（P）_哦在火花点的位置通过划分来确定NP公司_哦在该位置乘以4，即在MEP和非MEP位置观测到的最大量子能级（通道）数。

估算协同门控对钙的贡献²⁺通过TRPV4通道的流入

通过估计独立通道选通的概率，确定了协作选通导致火花点处TRPV4通道活动的增加。概率我通道在以下集群中打开N个独立信道可以根据二项式分布计算(6),

哪里N个是相同和独立信道的数量（根据实验数据固定为每个站点4个），以及P（P）_哦是通道独立选通的打开概率。我们发现了P（P）无论情况如何（MEP、非MEP、AKAP150^−/−，和高血压），这表明火花站点中一个通道的打开反映了独立的门控。然而，2级、3级和4级的概率并不独立(6). 因此，我们使用上述方程来估计信道P（P）_哦在缺乏合作性的情况下，通过迭代P（P）_哦为了获得第一级（一个通道打开）的实验观测概率，使用n个=4。通道活性增加（Ca²⁺通过将实验观测到的PO除以二项式分布的通道开放概率（假设独立(图S7).

TRPV4火花耦合系数（κ）的计算

如前所述，在MATLAB中实现了耦合马尔可夫链模型，以确定EC膜上TRPV4通道之间的耦合系数(37,41). [F–F₀]/F类₀分析中使用了基线稳定时间至少为30s的记录道。分别分析每个TRPV4火花点。耦合马尔可夫链模型最初由钟和肯尼迪描述(40)模拟和拟合部分耦合信道的独立记录。使用MATLAB语言编写的程序，使用半振幅协议识别单通道开口，单一事件的量子水平设置为0.19Δ前/后₀对于GCaMP2小鼠动脉和0.29Δ前/后₀用于Fluo-4负荷动脉。TRPV4通道的活动被建模为一阶离散马尔可夫链，并使用MATLAB中内置的隐马尔可夫参数估计函数，根据火花记录及其相应的通道开放时间过程估计马尔可夫转移矩阵。估计的转移矩阵被建模为部分耦合的马尔可夫链，其中耦合系数（κ）是一个无量纲参数，对于无耦合（独立选通）的信道，该参数可能从0变化到1，对于完全耦合的信道。该模型还具有两个附加参数：ρ，河道开-关概率和ζ，河道闭-关概率。这三个参数一起充分描述了完全解耦信道对转移矩阵的贡献。使用梯度下降算法对每个记录拟合部分耦合马尔可夫链模型的最佳参数集（κ，ρ，ζ）。这是一个“集总”模型，其中通道在“打开”和“关闭”的可观察状态之间切换；因此，我们的模型只有三个自由参数，包括耦合系数。它并没有完全描述通道的实际动力学。因此，从该集总模型获得的转移概率不被解释为速率常数。

我们感谢Hydra Biosciences提供的HC-067047，NeuroSearch A/S提供的NS309，R.Dixon和S.Renjitham提供的耦合系数分析帮助，C.Yuan提供的AKAP150抗体帮助，J.Brayden、K.Freeman、M.Koide和G.Wellman对手稿的评论。基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院资助的国家研究资源中心COBRE（生物医学研究卓越中心）项目的资助（2-P20-RR-016435-06）；美国心脏协会（AHA）科学家发展基金（13SDG16470005）和美国心脏协会-肺动脉高压协会博士后奖学金（10POST3690006）。；伦德贝克基金会向T.D.提供博士后奖学金。；NIH向J.D.S.（R37GM48231）和M.I.K.（GM086736）的拨款；以及NIH（HL044455、1P01HL095488、R37DK053832和R01HL098243）、托特曼医学研究信托基金和勒杜克基金会向M.T.N。