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.2014年7月8日；7（333）:ra66。
doi:10.1126/scisional.200552。

AKAP150依赖性协同TRPV4通道门控是内皮依赖性血管舒张的核心，在高血压中被破坏

Swapnil K Sonkusare公司 1, 托马斯·达尔斯加德 1, 阿德里安·德·博内夫 1, 大卫·希尔·尤班克斯 1, 迈克尔一世·科特利科夫 2, 约翰·D·斯科特 三, 路易斯·桑塔纳 4, 马克·T·纳尔逊 5
附属公司

AKAP150依赖性协同TRPV4通道门控是内皮依赖性血管舒张的核心，在高血压中被破坏

Swapnil K Sonkusare公司等。 科学信号. .

摘要

内皮细胞功能障碍是高血压的一个特征，其特征是对内皮细胞依赖性血管扩张剂的反应减弱。TRPV4通道在内皮依赖性血管舒张中起着重要作用，这是一种通过功能耦合的TRPV4渠道簇的局部Ca（2+）内流介导的功能，而不是通过内皮细胞Ca（2+）的整体增加介导的。我们发现，刺激小鼠动脉内皮细胞上的毒蕈碱型乙酰胆碱受体只能激活位于肌内皮投射（MEP）的TRPV4通道，肌内皮投射是内皮细胞接触平滑肌细胞的特殊区域。毒蕈碱受体介导的TRPV4激活依赖于蛋白激酶C（PKC）和PKC锚定蛋白AKAP150，后者集中于MEP。集群TRPV4通道的协同开放特别放大了MEP处的Ca（2+）内流。TRPV4通道在非MEP位点的合作性要低得多，而细胞内Ca（2+）或AKAP150敲除的螯合作用大大降低了MEP的合作性，这表明Ca（2+）通过相邻通道进入是TRPV4活性依赖于AKAP150增强的基础。在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压小鼠模型中，AKAP150的MEP定位被破坏，毒蕈碱受体刺激没有激活TRPV4通道，TRPV4渠道在MEP处的协同作用较弱，并且对毒蕈碱类受体刺激的血管舒张反应减弱。因此，MEP放大的AKAP150可实现阻力动脉的内皮依赖性舒张，从而确保PKC与TRPV4通道的接近，以及从血管内皮细胞到平滑肌细胞的有效沟通所需的耦合通道门控。这种分子组装的破坏可能导致高血压患者的血流改变。

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数字

图1
图1。CCh通过PLC-DAG-PKC途径激活MEP的TRPV4火花
TRPV4钙2+在含有CPA（30µM）的GCaMP2小鼠肠系膜动脉的面部标本中记录到火花。(A类)显示视野中EC的灰度图像。内部弹性层中的黑洞对应于MEP所在的位置。标有字母的白色箭头表示MEP的四个不同的TRPV4火花站点。(B类)代表前/后0在添加CCh之前（对照）和之后的基础条件下，MEP处TRPV4火花点的痕迹如（A）所示。(C类)柱状图总结了在存在或不存在PKC抑制剂Gö-6976（1µM）或TRPV4抑制剂HC-067047（1μM）的情况下，CCh（10μM）、OAG（10μM）和PMA（10 nM）对MEP位点TRPV4火花活动的影响。CPA仅用作对照，PKC抑制组除外，其中CPA+Gö-6976用作对照。数据为平均值±SEM(n个＝5到10个字段）。(D类)代表前/后0在3 nM GSK101存在下，添加CCh之前（蓝色）和之后（黄色）三个不同MEP和非MEP火花点的痕迹。(E类)条形图总结了在GSK101（3nM）存在和Gö-6976或HC-067047存在或不存在的情况下，CCh、OAG和PMA对MEP和非MEP位点TRPV4火花的影响。数据为平均值±SEM(n个=4至7个字段）。使用CPA（30µM）和GSK101（3 nM）存在下的火花活性作为对照，PKC抑制组除外，其中使用CPA、GSK101和Gö-6976存在下的闪光活性作为对照。在（C）和（E）中，Gö-6976在CCh、OAG或PMA治疗前10分钟加入，而HC-067047在CCh、OAG或PMA治疗后（10分钟）加入*对第1列至第3列与对照列以及第7列至第9列的差异<0.05[采用事后Bonferroni检验的单向方差分析（ANOVA）]。
图2
图2。CCh诱导激活TRPV4火花需要MEP-localized AKAP150
(A类)C57BL6小鼠肠系膜动脉表面标本的图像显示，AKAP150免疫染色（中央，红色）位于内弹性层（IEL）水平（左侧，绿色）；IEL中93.1±0.8%的孔显示AKAP150免疫染色(n个=10个场，5条动脉）。合并图像中的虚线表示两个EC的轮廓。(B类)沿z（z）轴（3µm，0.1-µm光学切片）显示穿过IEL深度的AKAP150荧光密度。已重建x赫兹和yz公司图像显示沿着MEP的AKAP150免疫染色，在投影末端染色最强。痕迹是AKAP150染色的曲线图x个和年通过三维视图中所示投影的5µm宽横断面的轴。(C类)代表前/后0微量TRPV4 Ca2+野生型（WT）小鼠和AKAP150肠系膜动脉中的火花−/−老鼠（底部）。实验在WT和AKAP150的Fluo-4负荷肠系膜动脉中进行−/−CPA（30µM）和GSK101存在的小鼠。每种颜色代表来自单个感兴趣区域（ROI）的轨迹。(D类)显示CCh诱导的WT和AKAP150肠系膜动脉内皮细胞火花活动增加的条形图−/−GSK101存在的小鼠。数据为平均值±SEM(n个=5至6个区域，4至5条动脉；对<0.01，t吨测试）。表S4提供了钻孔数量和尺寸以及IEL深度的信息。
图3
图3。AKAP150和当地Ca2+负责MEP处TRPV4通道的耦合选通
TRPV4钙2+在含有CPA（30µM）和GSK101（3 nM）的面部制剂中，在GCaMP2小鼠肠系膜动脉或Fluo-4负载肠系膜血管中记录火花。(A类)左：GSK101对活动TRPV4通道平均数的影响(NP公司O（运行）)每个字段(n个=7个场，5条动脉）。右：每个站点的Sparklet活动(*对< 0.05,t吨测试；n个=21至38个站点）以及MEP和非MEP站点每个字段的迷你站点百分比(*对< 0.05,t吨测试；n个=7个字段）。(B类)代表前/后0来自四种不同TRPV4 Ca的痕迹2+EC膜上MEP和非MEP位置的火花点[量子水平：0.19Δ前/后0(1)]. 每条记录道上方显示了各自的耦合系数（κ）值。(C类)散点图，指示MEP和非MEP位置火花点的单个κ值。显示了每组的平均耦合系数和SEM(对<0.01，t吨测试）。（D） WT和AKAP150肠系膜动脉MEP和非MEP位置的每个部位的火花活动−/−老鼠(*对< 0.05,t吨测试；14至25个站点）。（E） 代表前/后0来自四种不同TRPV4 Ca的痕迹2+在EGTA-AM（36°C下10µM持续10分钟）或AKAP150不存在（左侧，黑色）或存在（右侧，青色）的情况下，WT小鼠MEP的火花点−/−（中，黄色）小鼠。各个κ值显示在上面前/后0记录[量子水平：0.29Δ前/后0(1)]. （F） 散点图显示了（E）中各组MEP火花点的单个κ值。该图还显示了各组的平均耦合系数和SEM(n个=8至27个站点）。使用带有事后Bonferroni检验的单向方差分析来估计对值。对WT MEP组与所有其他组之间的差异小于0.05，WT非MEP组和EGTA非MEP。
图4
图4。每个EC激活不到一个TRPV4通道导致肠系膜动脉最大扩张
(A类)条形图显示了在NOS和COX抑制剂存在的情况下，仅对CCh（Con）的延迟反应我-NNA（100µM）和吲哚美辛（Indo；10µM我-NNA、Indo和HC-067047（1µM；TRPV4抑制剂），以确定依赖于TRPV4的EDH介导的扩张。最大膨胀被定义为钙存在时的膨胀2+-免费PSS。数据为平均值±SEM(n个=5至7条动脉）*对<0.05，使用单因素方差分析和事后Bonferroni检验。(B类)CCh引起的HC-067047敏感性（TRPV4）扩张成分和GSK101被绘制为每个EC的平均TRPV4通道活性的函数。通过将EC中所有火花位点的荧光积分除以一个量子能级（一个通道）持续2分钟的荧光积分，估算了整个2分钟记录期间每个EC激活的TRPV4通道的平均数量。数据为平均值±SEM(n个=5至7条动脉扩张；每个小区的平均信道数为14至26个小区）。
图5
图5。高血压小鼠的动脉中没有EDH介导的扩张，但单个离子通道的功能没有改变
在正常血压（NT）和高血压（HT）小鼠的加压（80 mmHg）三级肠系膜动脉中的扩张研究。(A类)响应CCh或GSK101的代表性容器内径轨迹。(B类)比较NT和HT小鼠动脉对CCh和GSK101的反应的直径数据摘要(n个=5只NT和HT小鼠的5-6条动脉*对<0.01，t吨测试）。数据为平均值±SEM。最大血管扩张由Ca中获得的直径确定2+-自由溶液。(C类)显示NT和HT小鼠EC中TRPV4（+100 mV）、IK和SK通道（均为0 mV）最大电流密度的汇总数据(n个=5至8个单元格）。(D类和E类)代表性直径轨迹（D）和直径数据汇总（E）显示了NT和HT小鼠肠系膜动脉对IK和SK通道开放剂NS309（0.3至2µM）的扩张反应。数据为平均值±SEM(n个=5至12条动脉）。表S2至S4提供了内径的平均值。
图6
图6。高血压小鼠AKAP150的MEP定位缺失导致局部钙缺陷2+MEP的信号传导与EDH介导的舒张功能丧失
(A类)GSK101（10至13条动脉，n个=21至46个站点*对< 0.05,t吨测试）。(B类)散点图总结了NT和HT小鼠MEP处TRPV4火花的耦合系数（κ）数据(对基线和GSK101存在时的比较结果<0.01，t吨测试）。(C类)说明在GSK101（3 nM）存在的情况下，HT动脉中CCh和PMA导致TRPV4火花活化缺失的汇总数据；n个=4至5条动脉*对<0.01，t吨测试）。(D类)NT和HT小鼠肠系膜动脉面部标本中AKAP150染色的代表性图像。(E类)AKAP150的汇总数据——免疫抑制数据如（D）所示。带有可识别AKAP150染色的孔的数量表示为每个场内部弹性层中孔总数的百分比(n个=5条动脉*对<0.01，t吨测试）。（F） 通过（D）包围孔中的图像绘制代表性水平横断面（5µm宽x 70µm长）的AKAP150免疫染色曲线。虚线表示位于IEL孔处的MEP的位置。表S4提供了NT和HT小鼠中孔洞数量和尺寸以及IEL深度的信息。
图7
图7。MEP处TRPV4通道的组织和功能拟议方案
EC膜上的TRPV4通道存在于MEP和非MEP位置的四个通道簇中。TRPV4通道的协同开放依赖于细胞内钙2+和AKAP150，主要针对MEP。TRPV4通道的毒蕈碱受体激活仅通过AKAP150锚定的PKC发生在MEP处。钙2+通过激活的TRPV4通道流入激活IK通道并超极化EC，导致SMC通过缝隙连接超极化。超极化降低了SMC中VDCC的活性，导致血管扩张。血管紧张素II诱导的高血压中的内皮功能障碍涉及MEP中AKAP150的丢失，这将毒蕈碱受体信号解偶联到TRPV4通道，并破坏TRPV4渠道之间的合作性。虽然目前的共识是EDH主要通过缝隙连接向SMC进行电子传播，但在某些情况下，IK和SK通道激活也会释放可溶性内皮衍生超极化因子（EDHF，未显示）。
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