自然杀伤细胞对不健康细胞的免疫监测

摘要

介绍

感染、癌基因介导的转化和其他损伤激活细胞中的各种途径，包括各种应激途径，这些途径以复杂的方式改变细胞生理学。其中一些变化可能导致固有的细胞死亡或衰老途径，从而抑制肿瘤发生和/或限制感染。同时，受影响细胞的改变可能会激活免疫系统，以先天或适应性保护反应的形式提供保护，从而破坏不健康的细胞。已经提出了许多这样的机制。在这里，我们将讨论激活自然杀伤（NK）细胞和T细胞的细胞表面分子对受感染、转化或应激细胞的上调，从而导致受感染细胞的死亡以及炎性细胞因子的产生。不健康的细胞也可能刺激释放介质，将免疫细胞招募到受影响的组织中，从而增强局部免疫反应。我们将讨论导致在不健康细胞上显示细胞表面配体的场景，这些配体通过NKG2D激活受体激活自然杀伤细胞和其他淋巴细胞，以及其他增强免疫细胞募集的信号。这些事件相互配合，有利于消除受影响的细胞。

自然杀伤细胞和NKG2D系统

NK细胞是在初级和次级淋巴器官以及粘膜组织中发现的固有淋巴细胞(Raulet，2003年). NK细胞杀死肿瘤细胞和感染细胞，并分泌各种炎性细胞因子，包括IFN-γ和TNF-α(Raulet，2003年). NK细胞杀伤需要通过激活NK细胞表面的受体来与肿瘤细胞上的特定配体结合。一些NK受体具有抑制性，其中大多数对MHC I分子具有特异性(Vivier等人，2011年). 其他受体激活NK功能(拉尼尔，2005年). 几种活化的NK受体与肿瘤细胞的杀伤有关(Raulet和Guerra，2009年). 这种受体的最佳特征是NKG2D（由Klrk1号机组基因），由所有NK细胞表达。NKG2D是一种凝集素样2型跨膜激活受体，可触发NK细胞介导的对各种靶细胞的细胞毒性(Raulet，2003年). NKG2D与5到10个（取决于个体）不同的NKG2配体结合，所有这些配体都是MHC I分子的远亲。其中包括小鼠中的三个配体亚家族（RAE-1α-ε、MULT1和H60a-c），以及人类中的两个配体亚家族（MICA-B和ULBP1-6）。小鼠中的RAE-1α-ε、MULT1和H60a-c配体与人类中的ULBP1-6蛋白质同源(Raulet等人，2013年). 配体在正常细胞中的表达较差，但由于各种途径的激活，常常在癌细胞和病毒感染细胞上诱导，其中许多与细胞应激有关(Raulet等人，2013年). 因此，激活受体NKG2D及其配体代表了一个有效且特异的系统，允许识别和消除不健康细胞。

NKG2D首次被用于肿瘤免疫监测，因为它证明许多肿瘤但很少正常细胞表达NKG2配体(Bauer等人，1999年；Cerwenka等人，2000年；Diefenbach等人，2000年；Groh等人，1999年)然后使用皮下肿瘤转移模型(Cerwenka等人，2001年；Diefenbach等人，2001年). 随后，我们实验室的研究表明，NKG2D受体对于使用两种自发性癌症模型（前列腺腺癌的TRAMP模型和B淋巴瘤的Eu-myc模型）对上皮和淋巴恶性肿瘤的免疫监测至关重要(Guerra等人，2008年). NKG2D缺乏在其他一些癌症模型中几乎没有影响，包括甲基蒽醌诱导的纤维肉瘤(Guerra等人，2008年)p53缺乏小鼠的T淋巴瘤（N.Guerra N和DH Raulet，未发表数据）。

NKG2D配体的调节

感染细胞或恶性细胞表达NKG2D配体可使免疫系统，尤其是NK细胞在清除这些细胞中发挥外源性作用(Raulet，2003年). 过去几年来，我们实验室一直致力于确定调节NKG2D配体的特定途径，因为我们相信了解配体的调节对于理解这种免疫识别模式的进化功能是必要的。以下讨论和图1毫不奇怪，正如将要讨论的，NKG2D配体的表达在转录和转录后水平上都受到调节。

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图1

NKG2D配体对细胞表面表达的调控

不健康细胞中活跃的不同途径调节mRNA或蛋白质的转录、翻译、稳定和/或NKG2D配体的细胞表面显示。我们最近证明，可能由激活的癌蛋白和PI3K信号传递的增殖信号可以诱导编码NKG2D配体RAE-1、ULBP和MICA的基因转录。在RAE-1的情况下，这发生在转录水平，并且是由E2F转录因子的诱导和/或激活介导的。癌基因激活也可能间接激活p53，从而增强某些人类NKG2D配体（ULBP1和ULBP2）的转录。热冲击应力导致MICA公司和MICB公司启动子，通过作用热休克因子1（HSF1）转录因子。据报道，NF-κB也能结合和反式编码一些人类NKG2D配体的私有基因，这增加了TLR诱导的NKG2D-配体表达部分通过NFκB活化介导的可能性。其他途径主要在转录后进行。DNA损伤反应由DNA损伤或伴随转化的DNA复制失调引起，可能通过调节稳定相应mRNA的因子诱导NKG2D配体的表达。在这种情况下，配体的诱导依赖于感知DNA损伤的激酶，即共济失调-毛细血管扩张症突变（ATM）、共济失调-Tellangiectasia和RAD3-related（ATR），以及下游激酶CHK1。DNA损伤反应也与感染某些病毒（如HIV）时NKG2D配体的诱导有关。细胞和病毒microRNA也参与NKG2D配体的调节。最后，我们证明，在紫外线照射或热休克诱导的细胞应激下，配体MULT1的泛素化和稳定性降低，阻止其降解并促进MULT1在细胞表面的表达。

内在肿瘤抑制机制与肿瘤免疫反应之间的联系

我们最近一直在研究内在抑癌机制和调节先天免疫激活从而控制肿瘤之间的联系。这项最近的工作是基于一些研究，这些研究表明p53在促进经历恶性转化和病毒感染的细胞的免疫原性方面发挥着关键作用。抑癌基因p53在调节细胞凋亡、DNA修复、细胞周期阻滞和其他细胞事件中起着核心作用。p53在诱导细胞衰老（抑制肿瘤发生的过程）中也起着中心作用(Zilfou和Lowe，2009年). 我们最近研究了这种肿瘤发展的主要屏障与NK依赖的肿瘤免疫反应之间的关系。

细胞衰老是一个复杂的生物学程序，在这个过程中细胞失去了分裂能力。细胞衰老的两种主要类型是复制性衰老（与正常分裂细胞中发生的端粒缩短有关）和癌基因诱导衰老（OIS）（与癌基因激活有关）(科拉多和塞拉诺，2010年；斯图尔特和温伯格，2006年). 由p53/p21和p16/Rb抑癌通路激活介导的致癌应激可通过抑制细胞周期进展和促进衰老状态的反式激活基因触发衰老(Braig等人，2005年；Michalloglou等人，2005年；成田等人，2003年；Serrano等人，1997年；Ventura等人，2007年). 现在人们普遍认为，癌基因诱导的衰老是发生在肿瘤发生过程早期的一个关键机制，它可以阻止癌前细胞产生恶性肿瘤(Braig和Schmitt，2006年；科拉多和塞拉诺，2010年).

越来越多的证据表明，免疫介导的衰老细胞破坏可能在肿瘤监测以及组织纤维化损伤的解决中发挥作用(Kang等人，2011年；Krizhanovsky等人，2008年；Xue等人，2007年). 天然免疫细胞，如自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞以及CD4 T细胞都参与了这些效应的介导。在一个肝细胞癌模型中，Xue等人先前表明，体内癌前细胞中p53表达的恢复诱导了一个衰老程序，导致包括NK细胞、巨噬细胞和粒细胞在内的固有细胞介导的肿瘤消除(Xue等人，2007年). Kang等人的一项研究报告称，消除癌前衰老肝细胞依赖于CD4 T细胞介导的适应性免疫反应(Kang等人，2011年). 后者还报告说，癌前衰老肝细胞的清除涉及T细胞和单核细胞/巨噬细胞的协同活动。

虽然这些研究中的肿瘤消除机制可能涉及这些免疫细胞介导的已知杀伤机制，但最近的一项研究表明，适应性免疫反应可能反过来触发肿瘤细胞的衰老(Braumuller等人，2013年). 因此，对衰老肿瘤细胞的免疫反应可能通过促进肿瘤床中额外肿瘤细胞的衰老来增强其作用。

在我们最近的工作中，我们研究了p53表达的衰老肿瘤如何激活自然杀伤细胞反应，以及NK细胞如何识别衰老肿瘤(Iannello等人，2013年). 我们能够剖析衰老程序与NK细胞介导的肿瘤监测之间的一种特定机制。使用Xue等人开发的肝细胞癌模型，我们观察到NKG2D介导的识别在很大程度上负责NK细胞依赖性衰老肝肿瘤的监测。在NKG2D缺乏的宿主中没有发生肿瘤排斥反应，并且通过在表达NKG2D的小鼠中注射NKG2C抗体来阻止肿瘤排斥反应。然而，有趣的是，肿瘤细胞在p53修复前表达了大量NKG2D配体RAE-1ε，而p53修复后NKG2D配体的数量没有增加(Iannello等人，2013年). 这些发现与上述研究一致，这些研究表明小鼠NKG2D配体由多种其他事件诱导，如E2F转录因子、PI3激酶信号、RAS癌基因信号和活化的DNA损伤反应，而不是由p53诱导(Gasser等人，2005年；Jung等人，2012年；刘等，2012；德山等人，2011年). 然而，令人惊讶的是，p53的恢复以NKG2D依赖的方式消除了肿瘤细胞，但并不影响NKG2D-配体的表达。p53的恢复可能通过调节粘附分子来调节肿瘤细胞对NK细胞识别的敏感性。然而，情况并非如此，因为我们发现p53表达恢复的肿瘤细胞比p53缺失的肿瘤细胞对NK细胞体外杀伤的敏感性稍低。因此，尽管p53修复并没有诱导或增加NKG2D配体的表达或细胞对NK细胞裂解的敏感性，但p53修复的肿瘤细胞的清除依赖于NK细胞在体内外对NKG2D的识别(Iannello等人，2013年).

p53如何影响肿瘤清除的线索来自于发现肿瘤细胞中p53的恢复以及由此产生的衰老程序导致NK细胞（以及许多髓样细胞）在肿瘤块中大量浸润。NK细胞浸润不依赖于NKG2D，表明p53引起的NK细胞浸润独立于肿瘤细胞的NK识别(Iannello等人，2013年). 此前已有研究表明，衰老肿瘤细胞保持生物活性，并经历一系列表型改变，通常称为“衰老相关分泌表型”（SASP）(坎皮西，2012；Tchkonia等人，2013年). SASP以分泌大量促炎细胞因子和趋化因子为特征，参与维持衰老状态、调节免疫反应和其他生物过程(坎皮西，2012).

我们的研究表明，在活体内p53修复后或体外培养细胞中p53修复之后，体外测试的肝肿瘤细胞能够有效诱导各种重要细胞因子和趋化因子。p53修复导致的趋化因子包括CCL2、CCL3、CCL4、CCL5以及CXCL1和CXCL2，所有这些都是已知的免疫细胞募集因子。在p53修复后产生的细胞因子中，有几种已知可激活NK细胞对抗肿瘤细胞的活性，包括IL-12、IL-15和IL-18(Iannello等人，2013年).

CCL2、CCL3、CCL4和CCL5都与NK细胞在不同环境中的招募有关(Walzer和Vivier，2011年)p53基因的恢复在一定程度上诱导了这些基因的表达。因此，我们在体内测试了它们在NK细胞募集到肿瘤中的作用。CCL2的抗体介导的中和作用阻止了NK细胞向衰老肿瘤的募集，从而导致NK依赖性肿瘤消除的减少。相反，同时中和CCL3、CCL4和CCL5并不能阻止NK细胞募集到衰老肿瘤中，也不会影响肿瘤的消除(Iannello等人，2013年). 这些数据表明p53诱导的CCL2表达在体内招募NK细胞进入衰老肿瘤中具有非冗余作用。已发表的染色质免疫沉淀实验显示p53与Ccl2公司基因调控序列与p53直接反式激活的可能性一致Ccl2公司(Hacke等人，2010年；Tang等人，2012). 我们的新结果表明，p53诱导CCL2生成是NK细胞消除衰老肿瘤的必要事件，NK细胞识别肿瘤细胞表面的NKG2D配体(图2).

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图2

肿瘤诱导衰老在NK细胞消除肿瘤中的外源性作用

癌症在一定程度上是逐步发展的。通常，癌基因激活和增殖信号会产生大量的癌前细胞。癌前细胞经常激活p19，受到DNA复制应激和DNA损伤的影响，从而激活DNA损伤反应（DDR）。DNA损伤反应、活化E2F和其他途径的作用总结于图1可以诱导NKG2D配体的表达。p19激活和DNA损伤反应激活抑癌基因p53，这为转化提供了强有力的屏障。激活的p53导致细胞周期停滞并触发细胞衰老程序（图中右侧的流）。这些事件构成了一种内在的肿瘤抑制途径，但衰老细胞也激活了由免疫细胞介导的肿瘤监测途径。在一个例子中，p53诱导的CCL2产生起到将NK细胞募集到肿瘤中的作用，而同样在衰老细胞中表达的炎性细胞因子IL-12和IL-15可以增强募集的NK细胞的活性。这些事件使NK细胞能够通过识别肿瘤细胞表面的NKG2D配体杀死衰老的肿瘤细胞，并消除肿瘤进展的潜力。相反，发育中的p53突变肿瘤细胞绕过这些屏障，发展为恶性肿瘤（图中左侧为流）。尽管这种肿瘤细胞可能表达NKG2D配体，但NK细胞和其他免疫细胞的募集和激活不足，加上肿瘤细胞的快速生长，导致无法控制进展中的肿瘤。请注意，由p53、致癌基因和衰老调节的许多其他免疫和非免疫途径也控制肿瘤进展，但该图强调了NK细胞的作用。

在进一步的研究中，我们观察到H-RasV12在野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中诱导的衰老导致Ccl2公司基因表达(Iannello等人，2013年). 相比之下，H-RasV12转导诱导的Ccl2公司p53缺陷MEF中的mRNA，表明p53在诱导Ccl2公司衰老MEF中的基因表达。因此，H-RasV12转导的WT MEF分泌CCL2蛋白的量远远高于H-RasV22转导p53缺陷MEF分泌的量。与我们的体内数据一致，H-RasV12转导、p53表达的衰老MEF以CCL2依赖的方式在体外强烈诱导IL-2激活的NK细胞迁移。H-RasV12转导的p53缺陷MEF发生的迁移更少。这些数据支持p53在迁移过程中的重要性，因为它在诱导CCL2生成方面具有活性(Iannello等人，2013年).

我们研究的一个令人兴奋的方面是，肿瘤细胞中激活的不同途径相互合作，导致NK依赖性肿瘤细胞的消除。一组独立于p53的通路诱导肿瘤细胞上NKG2D配体的表达。虽然对于有效消除肿瘤细胞是必要的，但这不足以有效消除肿瘤，因为NKG2D相互作用本身并不支持大量NK细胞迁移到肿瘤中。大量NK细胞浸润肿瘤取决于肿瘤细胞对p53的表达，或者更具体地说，取决于对p53产生的CCL2。p53还诱导各种细胞因子的表达，这些细胞因子也可能增强肿瘤内NK细胞的活化。与肿瘤发生相关的不同途径相互合作，一方面（通过趋化因子和细胞因子）动员NK细胞募集和激活，另一方面（经由NKG2D配体的表达）进行识别，可以被视为确保NK细胞以肿瘤细胞等不健康细胞为靶点的一种手段，激活了几个异常通路。

其他实验室的研究提出了另一种机制，即p53表达有助于免疫细胞消除不健康细胞。Kang等人最近报道，含有癌前衰老肝细胞的小鼠肝脏表现出炎症反应，衰老肝细胞周围有大量免疫细胞簇(Kang等人，2011年). 这项研究将这些可溶性因子的存在与免疫监视和免疫细胞的浸润联系起来，但没有提供它们参与的直接证据。Lujambio等人最近报道，p53再储存的衰老星状细胞分泌IL-1α、IL-6和IFN-γ，使巨噬细胞极化为抑瘤M1-状态，而缺乏p53的星状细胞则分泌IL-3、IL-4和IL-5，刺激巨噬细胞极化为促瘤M2-状态(Lujambio等人，2013年). M1极化的巨噬细胞能够杀死培养中的衰老细胞，而M2状态的巨噬细胞能够促进癌前细胞的增殖。

结论

综上所述，我们在此讨论的研究揭示了NK细胞清除不健康细胞的机制。NK细胞通过不健康细胞表达的配体激活受体而快速反应的能力，使这些细胞能够有效地进行免疫防御。根据不健康细胞中累积损伤的性质，多种内在细胞途径似乎参与了这些配体的调节。此外，NKG2D配体表达的调节和控制似乎在NKG2D生物发生的几个水平上进行调节，这表明最佳配体表达需要几个同时的应激信号或通路，这些信号或通路分别调节mRNA或蛋白质的转录、翻译和稳定，和/或配体的细胞表面显示。多重监管步骤揭示了系统的复杂性(图1). 很明显，需要做大量工作来辨别特定配体表达机制之间的协同作用，以及不同配体受不同压力或路径调节的程度。了解NKG2D配体的调节可能有助于制定治疗策略，以增强NKG2D-介导的免疫反应，对抗肿瘤或病毒性疾病，或潜在地抑制炎症性疾病的反应。

我们最近的研究表明，p53诱导的CCL2生成是NK募集到衰老肿瘤和NK介导的肿瘤消除的关键事件，这突出了p53介导的外源性作用及其对免疫监测的影响(Iannello等人，2013年). 我们的研究揭示了NK细胞在肿瘤发生早期的重要性，在p53因突变而丢失或失活之前。相反，这些结果提供了新的理解，为什么大多数晚期肿瘤中发生的p53功能丧失会通过降低NK细胞介导的抗肿瘤功能而损害肿瘤的免疫监视。p53的这些免疫功能代表了在p53通过施加细胞周期阻断或诱导细胞直接凋亡为肿瘤发生提供内在屏障的作用之上的额外一层肿瘤抑制(图2). 因此，制定恢复p53介导功能的策略可能在促进抗肿瘤免疫反应和肿瘤消除方面卓有成效。由于p53表达和激活的主要作用是引起免疫浸润，因此并非肿瘤内的所有肿瘤细胞都需要表达p53才能对宿主有益。因此，仅在部分肿瘤细胞中对p53进行治疗性修复可能会带来治疗益处。需要进一步的研究来了解与p53表达和SASP相关的衰老监测的其他机制。这些研究系列可能会更好地了解免疫监视机制，同时可能会发现增强癌症免疫反应治疗的新策略。

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