发现一种生物标记物并将小分子引入靶向r（GGGCC）-c9FTD/ALS中的相关缺陷

结合r的小分子的鉴定（GGGCC）_经验

利用上述发现，我们试图识别结合r的小分子（GGGCC）_经验并确定它们是否改善了c9FTD/ALS相关缺陷。据报道，TMPyP4，一种已知的G-四链体结合物，结合r（GGGCC）₈ 在体外(Zamiri等人，2014年). 尽管TMPyP4的生物活性尚未被探索，但这些研究表明，有可能识别结合r（GGGCC）重复序列的小分子。我们之前开发了一种利用RNA与小分子相互作用信息设计结合RNA靶点的小分子的策略(Velagapudi等人，2014年). 小分子引线可以通过化学相似性搜索进一步优化，该搜索可以识别与引线化学相似的化合物。我们报道了小分子1a个绑定r（CGG）中存在的1×1 GG内部环路_经验并改善脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）相关缺陷(迪斯尼等，2012年). 给定r（CGG）之间的结构相似性_经验和r（GGGCCC）_经验，我们假设1a个和化学性质类似的化合物可能结合r（GGGCC）_经验.我们收集了132个这样的小分子，并筛选它们与r（GGGCCC）的结合₈三种铅化合物(1a个，2和三)已确定(图1E，S1A；表S2)并进一步表征。动力学结合研究表明1a个，2、和三与r结合（GGGGCC）₈使用K_d日分别为9.7、10和16μM，与r（CGG）的观测值相似₁₂相反，1a个，2、和三与一根完全配对的发夹结合得更弱，表明这些化合物至少具有适度的选择性(图S1B). 我们通过折叠r（GGGCC）扰动发夹和G-四链结构之间的平衡₈在存在额外100 mM NaCl（倾向于发夹）或KCl（倾向于四倍体）的情况下。观察到的K_d日的用于1a个和三在Na的存在下，其强度降低了3到10倍⁺和K⁺表明离子强度影响结合。有趣的是2对于r（GGGGCC）₈钠的添加没有显著影响⁺，但K值下降了6倍以上⁺这些结果表明化合物2识别G-四链体上的发夹结构(图S1B).

鉴于r的小分子结合物（GGGCC）_经验可能影响RNA的热力学稳定性，进而影响病灶的形成和RAN的翻译，光学熔化用于研究化合物是否增加r（GGGCC）₈稳定性。While化合物三未显著影响r（GGGCC）₈的稳定性或熔化温度，1a个和2RNA分别稳定0.95和0.63 kcal/mol，并增加T_米分别降低3.1和1.9°C(图S1C&表S3).

r的小分子粘合剂（GGGCC）_经验抑制（GGGGCC）RAN翻译和病灶形成₆₆-表达细胞

确定化合物是否1a个，2和三绑定r（GGGCC）_经验在细胞中，我们使用转染的COS7细胞表达66个GGGGCC重复序列，没有上游ATG，以及我们之前报道的识别小分子细胞靶点的策略。在这种策略中，小分子被偶联到：（i）一个反应性模块，该模块与目标（氯丁嘧啶）形成共价交联；加利福尼亚州); 和（ii）生物素，用于简单分离小分子-生物分子加合物(关和迪士尼，2013年). 首先，一种生物素-氯丁嘧啶偶联物1a个合成了(1a-CA生物素;图2A，图S2A、B)，添加到（GGGGCC）₆₆-表达细胞，并允许其与细胞靶点反应。然后用链霉亲和素功能化树脂分离生物分子-小分子加合物。对分离组分的qRT-PCR分析显示r（GGGCC）富集80倍₆₆与18S rRNA相比（归一化为未经处理的裂解物；图2B). 确定是否1a个，2和三绑定r（GGGCC）_经验直接，我们通过共处理（GGGCC）完成了竞争性剖面测试₆₆-表达细胞1a-CA生物素以及复利。也就是说1a个，2和三可以通过下拉分数中的损耗来推断。事实上，r的量（GGGCC）₆₆与形成加合物1a-CA生物素在每种化合物的存在下都被显著耗尽(图2B).

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图2

小分子靶向r（GGGCC）抑制RAN翻译和（GGGCC）病灶形成₆₆-表达细胞

A）的结构1a-CA生物素; 氯丁嘧啶部分(加利福尼亚州)一旦小分子被结合，就会与细胞靶形成共价键。生物素用于从细胞中分离生物分子-小分子加合物。B）r的归一化富集（GGGCC）₆₆与qRT-PCR测定的18S rRNA进行比较。用1a CA生物素单独或与1a个，2或3（竞争概况）。在竞争性剖析实验中，未反应化合物抑制目标与1a-CA生物素因此目标在下拉分数中耗尽。数据表示为平均值±标准偏差（n=2）。C）过度表达66（GGGGCC）重复序列（C9-66R）而非2（C9-2R）或20（C9-20R）的细胞表达多聚（GP）和多聚（GA）蛋白。星号表示非特定带。D类)（GGGCC）中poly（GP）和poly（GA）蛋白的Western blot和密度测定₆₆-用二甲基亚砜或化合物处理的表达细胞1a个，2或三（100μM，24小时）。数据表示平均值+SEM（n=3）。E）在C9-66R细胞的细胞核（Hoechst；蓝色）中检测到RNA焦点（红色）。F）通过RNA FISH评估治疗后foci-阳性细胞的百分比。数据表示10个字段中的平均值+SEM。G-H）化合物1a个减少多聚（GP）蛋白的RAN翻译（GGGCC）₆₆C9-66R细胞中的重复(G公司)，但不影响从反义（CCCCGG）翻译的聚（GP）或聚（PR）蛋白RAN的水平₆₆C9-AS-66R细胞中的重复序列(H（H）)通过GP和PR免疫分析进行评估。数据表示平均值+SEM（n=3或4）。一）C9-AS-66R细胞中含有r（CCCCGG）的病灶的百分比不受以下因素的影响1a个。J） 1a个减少表达CGG的细胞中poly（G）的RAN翻译₈₈GFP上游。数据表示为平均值+SEM（n=3）*P<0.05**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，通过单因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett多重比较测试（Multiple Comparison Test）进行评估。^##P（P）经t检验，<0.01。另请参见图S2。

已确定所有三种化合物都结合r（GGGCC）₆₆，我们评估了它们对RAN翻译的影响。虽然在仅表达2个或20个（GGGCC）重复序列的HEK293细胞中没有发现RAN翻译的证据，但（GGGCC）的表达₆₆导致poly（GP）和poly（GA）蛋白的合成(图2C)，但不是聚（GR）蛋白质（未显示）。化合物三（100μM，24 h）适度抑制聚（GP）蛋白的合成，但不影响聚（GA）蛋白的生成(图2D). 相反，化合物1a个和2显著降低聚（GP）和聚（GA）蛋白水平(图2D). 鉴于此1a个和2对RAN翻译有类似的影响1a个也抑制了iNeurons中的这种事件（如下所示），我们测试了1a个发现它对RAN翻译具有剂量依赖性；通过（GGGCC）裂解物的免疫分析检测到聚（GP）在统计学上显著减少，分别为10%、18%和47%₆₆-分别用25、50或100μM处理的表达细胞(图S2C).

除了c9RAN蛋白的积累外，在（GGGGCC）₆₆-表达细胞(图2E). 与它们对RAN翻译的影响一致，复合词1a个和2，但不是三，显著降低foci阳性细胞的百分比(图2F). 这可能是由抑制病灶形成引起的，而不是探针与r（GGGGCC）结合受损的结果₆₆在存在化合物的情况下，假定在固定的、未处理的（GGGCC）上进行RNA FISH₆₆-探针与1a个没有阻止病灶的检测(图S2D).

自从C9ORF72型重复序列扩展在c9FTD/ALS中是双向转录的，因为含有（CCCCGG）重复序列的反义转录物也被RAN翻译并形成焦点(Gendron等人，2013年;Mori等人，2013年a;Zu等人，2013年)，我们评估了1a个英寸（CCCCGG）₆₆-先前显示的表达细胞表达聚（PR）和聚（GP）蛋白(Gendron等人，2013年). 鉴于1a个（100μM，24小时）显著降低从感觉转录物翻译的聚（GP）蛋白RAN(图2G)对反义r（CCCCGG）翻译的poly（GP）或poly（PR）蛋白RAN无影响₆₆，通过免疫分析评估(图2H;看见图S2E和图S4A用于分析验证）。同样，在以下情况下，未检测到携带r（CCCCGG）病灶的细胞百分比发生变化1a个处理(图2I). 相比之下，我们报告说1a个减少r的病灶（CGG）₆₀-表达细胞(迪斯尼等，2012年)，我们在这里展示1a个也抑制表达CGG的细胞的RAN翻译₈₈置于GFP的5'UTR中，但不影响下游规范翻译(图2J). 这些结果证实了r（CGG）_经验和r（GGGGCC）_经验细胞内，以及1a个朝向此结构。

r（GGGCC）小分子结合物抑制（GGGCC）RAN翻译和病灶形成_经验-表达iNeuron

为了建立一个更生理性的疾病细胞模型，成纤维细胞有或没有C9ORF72型如最近所述，重复扩增通过抑制聚嘧啶结合蛋白（PTB1）直接转化为神经元谱系(薛等，2013). PTB1缺失导致成纤维细胞采用神经元形态，胞体尺寸和突起形成减少(图3A、B和S3A系列). 这些iNeuron表达神经元和突触标记，包括MAP2、TUJ1、PSD95、Synapsin I和Drebrin(图3A，S3B型). 核病灶，被RNase A降解但对DNase I耐药(图S3C)，都出现在C9ORF72型+成纤维细胞(图S3D)和iNeurons(图3C). 细胞质多（GP）包涵体以及多（PR）包涵体也存在于C9ORF72型+i神经元(图3C)但在亲代成纤维细胞中未发现(图S3E). 在缺乏扩张重复序列的iNeuron中未检测到病灶或多聚（GP）内含物(图3C). 重要的是，在三个C9ORF72型+iNeuron线，化合物1a个显著降低有RNA病灶的细胞百分比(图3D)和聚（GP）包裹体(图3E、F)，但对C9ORF72型mRNA水平(图S3F). 与（GGGGCC）中的发现一致₆₆-在表达细胞中，观察到poly（GP）的RAN翻译呈剂量依赖性减少1a个-处理过的C9ORF72型+iNeurons，但从反义转录物合成的poly（PR）表达没有变化(图S3G). 由于与化合物相关的毒性2在iNeurons中，它没有在这个模型中进行测试。综上所述，我们的数据表明，我们设计r小分子调节剂（GGGCC）的策略成功地鉴定出一种化合物，该化合物可缓解r（GGGCC）引发的异常事件_经验。

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图3

靶向r的小分子（GGGCC）抑制iNeuron中RAN翻译和病灶形成C9ORF72型膨胀

A）用非沉默shRNA或shPTB1转导的成纤维细胞对PTB1和神经元标记物MAP2进行免疫荧光染色。比例尺，20μm。B）转导或不转导shPTB1的成纤维细胞的PTB1蛋白印迹分析。C）RNA焦点在iNeuron中积聚C9ORF72型重复膨胀(C9ORF72型+)但在缺乏扩展的iNeuron中没有(C9ORF72型-)根据RNA FISH评估。用抗GP或抗PR的免疫荧光染色显示c9RAN蛋白在C9ORF72型+iNeurons。比例尺，5μm。D）治疗C9ORF72型+具有复合物的iNeurons1a个（2μM，4 d）显著降低有病灶的细胞百分比。对于每个iNeuron线，数据反映了3个不同区域中foci-阳性细胞+SEM的平均百分比。E-F）化合物1a个显著降低含有抗GP，但不含抗PR免疫反应性内含物的细胞百分比（放大倍率：20倍）。对于每条线，数据表示96 well板的9个孔中计数的内含阳性细胞+SEM的平均百分比。^#P<0.05，^##经t检验，P<0.01。另请参见图S3。

我们感谢捐献脑脊液、皮肤样本和尸检组织的患者。我们感谢Lillian Daughrity、Luc Pregent和Mary Davis提供的技术支持，以及香港向明博士在1D方面的帮助¹核磁共振实验。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/美国国家老龄研究所（R01GM097455[M.D.D]；R01AG026251[L.P.]）的支持；NIH/国家神经疾病和中风研究所（R21NS074121[K.B.B.，T.F.G.]，R21NS07，9807[Y.Z.]，R22NS084528[L.P.]，R01NS088689[R.H.B.，L.P.]、R01NS063964[L.P.]；R01NS077402[L.P.]:R01NS050557[R.H.B.]；ARRA奖RC2-NS070-342[R.H.B]，P01NS084974[L.P.，D.D.，R.R.R.R.，K.B.B]）；国家环境卫生服务研究所（R01ES20395[L.P.]）；国防部（ALSRP AL130125[L.P.，M.D.D]）；NIH、国家老龄化研究所（Z01-AG000949-02[B.J.T.]）和国家神经疾病和中风研究所的校内计划（Z01 NS002976-16 to M.F.K.and B.J.T.）；梅奥诊所基金会（L.P.）；梅奥再生医学诊所（P.O.B.）、梅奥个体化医学诊所（T.F.G.，L.P.，K.B.B.）、ALS协会（K.B.B.B.，P.O.B.L.P.、T.F.G.Y.Z.和M.E.D.）、阿尔茨海默病协会（Y.Z）、约翰·霍普金斯大学罗伯特·帕卡德ALS研究中心（L.P.和J.D.R.）、Target ALS（L.P.M.D.D.）、，加拿大卫生研究院（V.V.B.）、Sirausa基金会（V.V.B）、Robert and Clarice Smith&Abigail Van Buren Alzheimer's Disease Research Foundation（V.V.B.）、Digiovanni杂项基金（M.E.D.）、ATA（M.E.D）、ALS项目（R.H.B.）、天使基金（R.H.B）、，AriSLA联合资助了意大利卫生部的“5x1000”医疗研究（授予EXOMEFALS 2009[V.S.]和NOVALS 2012[V.S.]）、意大利卫生部（RF-2009-1473856[C.M.，A.R.，V.S.]）和欧洲委员会（JNPD SOPHIA和STRENGTH[C.M..，A.R..，V.S.]]）。Z.S.和V.B.是由ALS协会资助的Milton Safenowitz博士后研究员。W-Y.Y是FRAXA研究基金会资助的FRAXA博士后研究员。c9RAN蛋白抗体已被授权给一家商业实体。R.R.拥有一项专利，用于筛选C9ORF72型基因。