针对ALS患者iPSC-derived运动神经元的RNA焦点C9ORF72型重复膨胀

道德声明

人对照成纤维细胞系取自科雷尔医学研究所。Coriell细胞库维护供体成纤维细胞样本的同意和隐私。本研究中的所有细胞系和方案都是根据雪松西奈医学中心和圣路易斯华盛顿大学的机构审查委员会批准的指南进行的。

的生成C9ORF72型ALS和健康对照iPSCs使用上体质粒

成纤维细胞来自C9ORF72型ALS患者（28iALS-n2、29iALS-n 1、30-iALS-n1、52iALS-n-6）来自圣路易斯华盛顿大学。健康对照组成纤维细胞（00iCTR-n2:GM05400；14iCTR-n 6:GM03814；83iCTR-n 13:GM02183）从科里尔医学研究所获得）或从西达斯-西奈岛健康供体获得（03iCTR-n-1）。使用pCXLE-hUL、pCXLE/hSK和pCXLE-hOCT3/4-shp53-F载体（Addgene，改编自先前发布的协议(20)). 利用Amaxa人皮肤成纤维细胞核因子试剂盒制作无病毒iPSC ALS株。简单地说，收集成纤维细胞（每个核感染0.8×106个细胞），并在200g下离心5分钟。将细胞颗粒小心地重新悬浮在Nucleofector Solution（VPD-1001，Lonza）中，并结合六个因子的上位质粒表达：OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和p53 shRNA，通过质粒核感染实现(20). 这种方法与病毒转导相比具有显著优势，因为基因不整合，而是以暂时的方式在外周表达。将细胞/DNA悬浮液转移到Nucleofector®中，并应用U-023程序。在重新编程期间，所有培养物均保持在常氧条件下（5%O2），这进一步提高了iPS细胞生成的效率。培养基保持48小时，逐渐转变为含有小分子的hiPSC培养基，以提高重编程效率。使用的小分子为：1）丁酸钠（0.5 mM），2）糖原合成酶激酶3βWnt/β-catenin信号通路抑制剂（CHIR99021，3μM），3）MEK通路抑制剂（PD 0325901，0.5μM）；4）TGF-βI型受体ALK5激酶选择性抑制剂，I型激活素/节点受体ALK4和I型节点受体ALK 7（A 83-01，0.5μM）。25-31天后出现ES/iPSC样形态的菌落。随后，挑选出形态最佳的菌落，并用标准hiPSC培养基和BD-Matrigel转移至各层^™化学定义的mTeSR®1培养基中hiPSC的饲料无关维护矩阵。将从每个重新编程的成纤维细胞样本中挑选三个独立的iPS细胞克隆，并根据之前公布的方案进一步扩增和冷冻保存(48).

iPSC特性

在Cedars-Sinai iPS细胞核心处，使用标准的多能性分析组合对iPSC细胞进行了严格的鉴定，包括多能性表面和核标记免疫染色和流式细胞术定量（>80%SSEA4和Oct3/4双阳性），G带核型分析以确保正常核型，自发胚体分化以判断生殖层形成能力，基于基因芯片和生物信息学的PluriTest分析，内源性多能性基因表达的定量RT-PCR，以及通过基因组DNA PCR确认外显体质粒基因缺失，如前所述(20，21，23).

运动神经元分化

在分化开始之前，iPS细胞在正常维护条件下生长到接近汇合处。简言之，通过去除mTeSR1培养基和添加由补充有B27维生素A（2%）和N2（1%）的IMDM组成的限定神经分化培养基（SaND）来诱导iPSC集落的神经分化。用这种培养基处理细胞6天。每2-3天补充一次培养基。第6天，在37℃下，通过accutase处理5分钟，从Matrigel中轻轻取出培养物。将密度为10000个细胞/孔的单细胞悬浮液在Matrigel和SaND培养基中离心，并添加尾化因子全反式维甲酸（RA；0.1μM），置于灭菌的384孔PCR板中，以形成均匀大小的神经聚集物。2天后（第8天），神经聚集体在悬浮低附着培养瓶中培养9天。为了诱导运动神经元分化，在iPSC期后第17天，将尾状神经聚集物放置在第1阶段运动神经元诱导培养基（Neurobased，2%B27和1%N2）中，并在全反式维甲酸（RA；0.1μM）和腹侧化因子（purmorphamine，PMN；1μM）的存在下继续培养8天。然后在运动神经元成熟培养基（由DMEM/F12组成，辅以2%B27、RA（0.1μM）、PMN（1μM），db-cAMP（1μM）、抗坏血酸（AA；200 ng/ml）、脑源性神经营养因子（BDNF；10 ng/ml和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF；10 ng/ml）再治疗2-7周。这些条件允许在无血清条件下进行运动神经元分化。所有分化培养物均保存在37°C（空气中5%CO2）的加湿培养箱中。

电生理学

在分化后9至10周，采用盲法实验设计研究了从健康或疾病患者的成纤维细胞中诱导的多能人运动神经元。细胞培养在层粘连蛋白涂层的盖玻片上，并置于细胞外溶液中（mM中的成分为：119 NaCl、26 NaHCO3、11葡萄糖、2.5 KCl、2.5 CaCl2、1.3 MgCl2和1 NaH2PO4，与5%CO2和95%O2混合时pH为7.4）。运动神经元根据其特有的梯形形状进行鉴定，其中两个以上的树突状突起用直立显微镜（Leica）用×40浸水物镜进行观察，并以2.8–3ml/min的速率持续灌注碳气泡细胞外液。大多数细胞（43/60）电流注射后引发动作电位，被河豚毒素阻断。使用硼硅酸盐玻璃移液管进行记录，当填充内部移液管溶液（mM中的成分：135 KMSO4、10 NaCl、10 HEPES、3 MgATP 0.3 Na2GTP、0.1mM EGTA添加100μM Alexa Flour 594酰肼（分子探针），并将其调节至pH 7.4时，电阻在4至5 M之间。使用多灯700B放大器（分子器件）在电流灯模式下进行全细胞记录。每个细胞接受一系列从−10pA到70pA的递增电流注入，以5或10 pA为步长。电流在4 kHz下过滤，并使用Digidaa 1440（Axon仪器）在20 kHz下采样。使用pClamp 10进行峰值检测和分析，并在Excel或Igor软件中进行进一步分析。数字是用伊戈尔制作的。结果报告为平均值±SEM。

免疫细胞化学

在培养分化的适当时间点，将电镀细胞固定在多聚甲醛（PFA，4%vol/vol）或冷冻丙酮：甲醇（1:1）中，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗。固定培养物在含有0.2%（vol/vol）Triton X-100的5-10%（vol/vol）山羊或驴血清中被阻断，并与一级抗体孵育(表S2). 与一级抗体孵育后，在PBS中冲洗培养物，并在种特异性AF488或AF594结合的二级抗体中孵育。用Hoechst 33258（0.5μg/ml；Sigma）对细胞核进行复染，并使用GelTol水性固定介质（Immunotech）将其固定在玻片上。在10倍、20倍、63倍放大（尼康/莱西亚）下进行可视化，并使用Metamorph Offline软件（分子器件）完成阳性细胞的量化。

质粒

C9ORF72型cDNA转录变体1（NM_145005.5）和转录变体2（NM_018325.1）购自Origene（pCMV6）-C9ORF72型-TV1-myc-DDK，目录号RC222418和pCMV6-C9ORF72型-TV2-myc-DDK，目录号RC209700）。

ASO公司

仅在指定的治疗第一天将浓度为3μM的反义寡核苷酸添加到运动神经元成熟培养基中。只进行了一次治疗。7天后观察到敲除，该敲除持续至少14天，无需额外治疗。mRNA敲除、蛋白敲除、病灶缩小和ASO逆转的评估时间点均在ASO治疗后14天进行。在治疗期间正常更换培养基，直到细胞固定。靶序列如下：对照组ASO-141923–CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC；外显子2 ASO-576816–GCCTTACTCATGGACCAAGA；特定于异构体的ASO-577061–TACAGGCTGGTTTTCC。

初级抗体

以下抗体用于Western Blot分析：抗TARDBP（Proteintech Group，10782-2-AP）、抗C9ORF72（GeneTex，GTX119776）、抗GAPDH（Sigma-Aldrich，G8795）、抗EGFR（Thermo Scientific，PA1-1110）和抗SP1（Millipore，07-645）。抗C9RANT抗体如前所述(16).

RNA分离和实时定量PCR（RT-PCR）

使用PureLinkTM RNA迷你试剂盒（Ambion）从运动神经元培养物中收集RNA。RNA（1μg）首先经过DNA酶处理，然后使用Promega逆转录酶系统用寡核苷酸（dT）逆转录到cDNA。qPCR反应使用SYBR Green master mix（Applied Biosystems）进行三次，感兴趣的基因归一化为RPL13核糖体蛋白L13A，并通过2^-ΔΔCT方法进行计算（Schmittgen和Livak，2008）。PCR产物使用以下引物扩增：C9ORF72使用正向引物5′-TGTGAGAGTGAATGCAGTGA-3′和反向引物5’-GCCACATTAAGAATCTGTCTTG-3′，RPL13核糖体蛋白L13A使用正向5′-CCTGGAGAGAGAGGAAAAGAGA-3′以及反向5′-TGAGACCTCTGTATTTCA-3′，CBLN1使用正向5′-TCAGAACGCAGCACTTTCATC-3′和反向5′-TTAGCATGAGGCTCACCTGT-3′，CBLN2使用正向5′-CGACGGGTGCTTTTAAGGT-3′和反向5′-CGAAGGTTGCTCCAAACTC-3′，和SLITRK2使用正向5′-CAAGTCTCTGTGCCTCTC-3′和反向5′-CAGGTCAGAGATAGTGA-3′。每个PCR循环包括95°C 10分钟、95°C 30 s->58°C 60 s、50个循环和72°C 5分钟。在65°C到95°C之间测量并记录熔化曲线，增量为0.05°C到0.5°C。

Western和斑点杂交分析

293T细胞保存在DMEM加10%FBS、1%谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的培养基中。使用1μg DNA和3μl Mirus转染试剂在6孔板中进行瞬时转染。293T细胞转染C9ORF72型转录变体1和2作为鉴定内源性C9ORF72型在运动神经元培养中。用1X PBS将293T细胞的全细胞裂解液洗涤两次，并在含有50 mM Tris-HCl（pH 8.5）、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.5%NP40、1 mM-PMSF和完整蛋白酶抑制剂颗粒（Roche）的缓冲液中裂解。

定量和统计分析

使用ImageJ 1.46r软件（美国国立卫生研究院）进行Western blot定量。实验一式三份，数值以平均值+/-SEM表示。所有统计评估均使用GraphPad Prism软件进行，使用未配对t检验对两组进行比较。Prizm软件（GraphPad软件，加利福尼亚州La Jolla）用于所有统计分析。免疫细胞/组织化学分析和细胞存活的所有计数数据均表示为平均值±SEM，并通过双尾t检验或双向方差分析（ANOVA）和Bonferonni事后检验进行分析。当p<0.05时，差异显著

Southern blot定量C9ORF72型膨胀尺寸

从患者源性细胞系（成纤维细胞、iPSC或运动神经元培养物）中分离出10μg基因组DNA。在0.8%SeaKem GTG琼脂糖凝胶（Takara）上用1x TBE在20V电压下进行24小时的片段电泳，随后转移到GeneScreen Plus尼龙膜（PerkinElmer）。含有较小已发表探针的590-bp探针具有更高的灵敏度，并使用以下引物通过PCR产生：正向5′-AAATTGCGATGACTTGCAGGACCGTGG和反向5′-GCTCCTCACTCTGGAGAACAA）。凝胶纯化后，用³²P-dCTP（PerkinElmer）使用随机引物DNA标记试剂盒（Roche），并使用Ambion NucAway自旋柱（Life Technologies）纯化。在68°C下，在含有100μg/ml鲑鱼精子DNA的Perfect Hyb Plus缓冲液（Sigma）中隔夜进行杂交（Life Technologies/Invitrogen）。过滤器在室温下用2x SSC+0.1%SDS清洗两次，每次5分钟；在68°C下用0.2x SSC+0.1%SDS清洗2次，每次20分钟。将BioMax MS胶片（柯达）用增感屏在−80°C下曝光5天。

cDNA末端的快速扩增（5′RLM-RACE）分析

使用PureLink从成纤维细胞和前体运动神经元培养物中分离出总RNA^™符合制造商协议的RNA迷你试剂盒（Ambion BY Life Technologies，Cat.12183018A Carlsbad，CA）。使用GeneRacerTM试剂盒（Invitrogen，Cat.L1502-02 Carlsbad，CA）进行5′-RLM-RACE，制造商的说明修改如下：每个样品使用2μg总RNA。用小牛肠磷酸酶（CIP）处理RNA以去除任何截短mRNA中的5′磷酸盐。用烟草酸焦磷酸盐（TAP）处理去磷酸化RNA以去除全长mRNA中5′端帽，留下5′磷酸。GeneRacer RNA^™然后使用T4 RNA连接酶将低聚物连接到mRNA的5′端。使用SuperScript合成第一个cDNA^™使用随机六聚体引物的III-反转录酶。从该反应中，使用1μg cDNA扩增5′端，以使用铂Taq DNA聚合酶高保真（Invitrogen，Cat.12532-016，Carlsbad，CA）、GeneRacer 5′引物（5′-CGACTGGACGACTGA-3′）和C9ORF72基因特异性引物（5'-AACTGAGAGACGCATA-3′）进行测序使用GeneRacerTM试剂盒手册中描述的循环参数：94°C 1次循环2分钟，然后94°C 35次循环24秒，55°C 30秒，72°C 1分钟，然后72°C一次循环2 min，并保持在4。对成纤维细胞和前体运动神经元使用两种不同的技术去除未使用的引物和核苷酸。用EXOSAP-IT（Affymetrix，Cat.78200，Santa Clara，CA）处理成纤维细胞初级PCR产物。将一微升EXOSAP-IT成纤维细胞扩增产物稀释到10微升水中，在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳分离，并通过紫外线透照可视化三带产物（469、474和574 bp）。一旦确认，使用GoTaq（Promega，Cat.PRM8297，Madison，Wisconsin）、内部引物[GeneRacer（5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′）C9ORF72基因特异性（5′-GTGATGTCTTGCCCACGC-3′）]和1μg初级PCR进行二次PCR。成纤维细胞的二级PCR循环参数为：1个94℃循环2分钟，然后15个94℃周期24秒，55℃周期30秒，72℃周期1分钟，然后1个72℃周期2分钟。

在纯化前体运动神经元时，采用了更广泛的方法。这表明ExoSAP-It在单独用ExoSAP-It处理后，无法通过3%琼脂糖凝胶上的多条带去除多余的引物和核苷酸。在进行嵌套PCR之前，对初级PCR产物进行凝胶纯化。将15微升初级PCR产物置于1.5%的凝胶上，去除400-600bp之间的条带。一微升12ul洗脱液用作巢式PCR的模板。此外，采用热启动触地PCR方法，以减少误判和延伸，提高特异性，减少运动神经元二次PCR的背景扩增。前体运动神经元的二级PCR循环参数修改为：1个94℃循环2分钟，然后5个94℃周期20秒和72℃周期1分钟，94℃周期30秒和70℃周期1 min，然后6个94℃的周期30秒，68℃周期30 s每30秒减少2度，68℃循环30秒，然后94°C循环14次，持续30秒，65°C循环30秒，68°C循环30s，然后68°C的1次循环10分钟，最后4°C保持。

总的来说，在1.5%琼脂糖凝胶上运行15微克二级PCR产物，收集150-300bp（163、168和268bp）之间的条带，并在12ul水中洗脱。使用PCR®4-TOPO载体（Life Technologies，Cat.K4575-01，Carlsbad，CA）克隆1微升凝胶纯化的二次PCR产物，并在TOP10细胞中转化，在卡那霉素琼脂平板上生长过夜。人工采集菌落并送往GeneWiz测序进行分析。

细胞计数

每一张幻灯片都以无偏见的方式拍摄了几张照片。总细胞计数是通过使用变形细胞核计数程序计数hoescht染色获得的。其他标记细胞计数由研究人员完成。计数方法标准化。

RNA-seq和微阵列分析

为了进行RNA-seq分析，如上所述将iPSC培养物分化为运动神经元，并使用Ambion提取试剂盒进行采集。分离mRNA，并在Illumina Hi-Seq平台上进行文库制备和测序，以获得100bp的配对末端读数。使用BOWTIE将读取结果与人类基因组的hg19构建进行比对，并导入Partek软件进行基因注释和差异表达分析。

我们感谢Renate Lewis和Bryan Traynor对Southern blotting的帮助，感谢Paul Cooper对C9ORF72重复患者的PCR基因分型的帮助，以及Charles A.Thornton对RNA FISH的实施提供技术建议。

基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款NS055980和NS069669（R.H.B）、NIH-U24NS07837（C.N.S）以及加利福尼亚再生医学研究所拨款RT2-02040（发给C.N.S.和D.S.）的支持。R.H.B.获得Burroughs Wellcome基金颁发的医学科学家职业奖。分析工作得到了加州大学洛杉矶分校肌肉营养不良核心中心的部分支持，该中心由美国国立关节炎、肌肉骨骼和皮肤疾病研究所（P30 AR057230）资助，位于加州大学洛杉矶校区Duchenne肌营养不良中心，LP工作得到了梅奥诊所基金会的支持；美国国立卫生研究院/美国国家老龄研究所[R01 AG026251（LP），美国国立卫生院/美国国立神经疾病和中风研究院[R21 NS074121（TG），R01 NS063964（LP）；R01 NS077402（LP）和R21 NS084528（LP）]；国家环境卫生服务研究所[R01 ES20395（LP）]；肌萎缩性侧索硬化协会（LP）。