泛素依赖性分选在细胞内吞中的作用

摘要

如何选择蛋白质进行泛化

泛素（Ub）通过E2结合酶和E3连接酶的协同作用与底物蛋白共价连接(瓦沙夫斯基2012). 泛素化的大多数特异性和调节是在E3连接酶的水平上，其数量远远超过E2-结合酶。泛素化是由E2或在某些情况下由E3作为高能硫代酯键持有的Ub转移到底物蛋白上的结果，通常位于底物受体赖氨酸侧链的末端酰胺上。由于对泛素化系统的强烈兴趣，随着混合多-Ub链的发现，关于不同类型连接酶的许多简单规则和区别、它们形成特定多-Ub链条的特异性，甚至可以被泛素修饰的底物蛋白中的残基种类都变得模糊了，Ub转移和非赖氨酸残基泛素化的新酶机制(2012年库拉图和科曼德;Wenzel和Klevit，2012年;McDowell和Philpott 2013). 尽管如此，在基本术语中，Ub连接酶作为平台发挥作用，协调底物识别与Ub转移，并通过E2-结合酶配置多-Ub链拓扑结构。底物可以直接由E3连接酶或接合器蛋白结合，接合器蛋白反过来又与连接酶结合，而进行泛素化的底物残基的选择是通过底物/连接酶复合物的特定结构来完成的，该复合物决定了硫酯连接Ub的方向。从底物中去除Ub的泛素肽酶（去泛素酶[DUbs]）在控制底物蛋白泛素化水平方面也起着关键作用。在人类约90个DUb和酵母约20个DUb中，发现许多与Ub连接酶或识别泛素化蛋白质的内吞机制有关，从而定位DUb来调节各种连接处的泛素化过程(表1) (Clague等人，2012年).

细胞表面膜蛋白的泛素化启动了其向溶酶体降解的旅程(图1). Ub在一定程度上是通过充当内化和随后分拣到溶酶体内部的信号来实现的。一般来说，选择泛素化的膜蛋白可能是由于程序性生物反应（如配体介导的受体下调），也可能是作为质量控制机制从细胞表面去除异常折叠或受损蛋白质的一种方式。

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图1。

这里展示了对细胞表面蛋白质起作用的突出的Ub-连接复合物。Cullin-Ring连接酶，如SCFβ-TRCP复合物，可以修饰细胞表面的一部分受体（如生长激素受体）。Cbl连接酶家族在与酪氨酸磷酸化受体酪氨酸激酶结合并泛素化它们以诱导其配体刺激的下调中起着重要作用。具有HECT Ub-连接酶结构域的Nedd4连接酶家族成员泛素化了多种细胞表面蛋白。这些连接酶可以直接与底物蛋白结合或通过中间衔接蛋白发挥作用。MARCH连接酶存在于分泌/内吞系统的多个域中，可以修饰多种膜蛋白。未折叠和受损的膜蛋白可以被一些识别内质网（ER）中受损蛋白的相同机制识别。图为CHIP连接酶，它与Hsp70和Hsc70伴侣在一个复合物中起作用。

受体酪氨酸激酶（RTKs）的泛素化是Ub如何通过内吞系统转运蛋白质的研究最多的例子之一。RTK在人类中由50多个成员组成，在控制细胞增殖和迁移方面发挥着重要作用(Lemmon和Schlesinger，2010年). 配体诱导的RTK激活导致一些RTK通过Cbl（用于Cas-Br-M异位逆转录病毒转化序列）RING（真正有趣的新基因）E3型泛素连接酶家族成员在PM快速泛素化(Levkowitz等人，1999年). 典型的例子是表皮生长因子受体（EGFR），它在pY活化和自身磷酸化后¹⁰⁴⁵现在可以结合Cbl的氨基末端pY-结合域（PTB）。此外，接合器蛋白、生长因子受体结合蛋白2（GRB2）增强了受体泛素化，GRB2是Cbl的组成伙伴，与EGFR的其他pY残基结合。这有助于以依赖于Ubc4和Ubc5结合酶的方式促进多单和Lys63连接的多泛素化(Haglund等人，2003年;Huang等人，2006年,2007). 其他RTK，如肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子受体（VEGFR-1）和血小板衍生生长因子（PDGF）受体的RTK，也会通过Cbl快速进行配体刺激的泛素化(Haglund和Dikic 2012). Cbl还有其他靶点，如整合素，它将细胞与细胞外基质连接，以控制细胞粘附、迁移和增殖。整合素的泛素化促进了它们的溶酶体降解，从而防止了配体结合的整合素在内胚体内的积累，这些内胚体在胞吐时可能会形成非生产性粘附位点(Lobert等人，2010年). α5β1纤维连接蛋白整合素受体α5亚单位的泛素化由FGFR2（成纤维细胞生长因子受体2）的激活触发，FGFR2诱导成骨细胞中c-Cbl的募集(Kaabeche等人，2005年).

一组日益重要的Ub连接酶是膜相关的RING-CH（MARCH）连接酶，包括11个RING-CHE3-Ub连带酶家族(Nathan和Lehner，2009年). MARCH连接酶是卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSVH）免疫逃避连接酶K3和K5的同源物，包含两个跨膜片段和一个胞浆RING-CH结构域(Boname和Lehner 2011年). 内源性或过度表达的MARCH连接酶在多种细胞表面受体（例如，MHC-I；K3、K5、MARCH-9和-4、MHC-II；MARCH-2和-8、CD4、CD44和CD98；MARCH-4和-8）的泛素依赖性下调和溶酶体降解中起着关键作用(Nathan和Lehner，2009年). 这些完整的膜连接酶用于识别其他膜蛋白底物的机制很有趣，似乎涉及到对疏水性跨膜以及与这些跨膜段并列的近端区域的识别。HLA-DR外表面界面上的跨膜疏水贴片与膜近端Lys残基共同构成MARCH-8识别表面的关键元素，而Ub-受体Lys残余物必须位于膜-细胞质界面附近(Jahnke等人，2012年;Kajikawa等人，2012年).

另一类主要的E3连接酶是神经前体细胞表达的发育下调的4（Nedd4）家族，它包含一个催化HECT（同源E6-AP羧基末端）结构域(Rotin和Kumar 2009). Nedd4家族包括酵母Rsp5和九个人类成员（例如WWP1/2、Smurf1/2、Nedd4、Nedd4-2和AIP4/Itch），每个成员包含一个氨基末端C2域、2-4个WW域和一个羧基末端催化HECT域。WW结构域结合底物蛋白中发现的PPXY一致序列。经历这种直接识别机制的含PPXY的蛋白质包括异三聚体上皮钠通道（ENaC），该通道被Nedd4-2下调，PPXY基序中的突变使ENaC稳定在细胞表面，从而导致高血压Liddle综合征(斯奈德2009). ErbB-4中含有PPXY的剪接亚型最近也有类似的规定(Carraway 2010年). 底物蛋白的一些WW结合基序被磷酸化激活；例如，CXCR-4羧基末端尾部的磷酸化招募AIP4/瘙痒连接酶，酵母中Ste2-GPCR的磷酸化是Rsp5介导的泛素化所必需的(Hicke等人，1998年;Marchese等人，2003年;Vina Vilaseca和Sorkin 2010).

Nedd4家族连接酶还可以使用间接机制，通过使用结合底物并具有自己的PPXY基序的衔接蛋白来识别底物，使其能够连接到连接酶WW结构域。迄今为止，发现的最大的适配器集中在酵母中，酵母使用间接识别方法将Rsp5靶向其大多数细胞表面膜蛋白。这些适配器包括Bsd2和Sna3，它们可以分别介导Rsp5催化的锰和蛋氨酸转运体泛素化(Hettema等人，2004年;麦克唐纳等人，2012b). 在哺乳动物细胞中发现了一组类似的完整膜蛋白Nedd4家族适配器。Ndfip1/N4WBP5和Ndfip2/N4WBP5A也含有PPXY基序，并与WWP2 E3连接酶的WW结构域结合，说明了底物识别方面的进化保守性。这种相互作用是PM金属转运蛋白DMT1/NRAMP2泛素化/降解所必需的，DMT1/NRAMP2在铁稳态中起着关键作用(Foot等人，2011年). 作为完整的膜蛋白，这些适配器可以识别与MARCH连接酶类似的膜间结构域，尽管它们是如何做到这一点的确切机制以及它是否对转运蛋白活性敏感尚待阐明。

适配器还包括一个较大的可溶性蛋白质家族，其中包括酵母中的Bul1、Bul2和11种所谓的ART蛋白质（抑制素相关贩运）(奥唐纳2012). 这些可溶性适配器，包括Bul1/2，属于α-抑制素家族。这些与研究更深入的β-arrestin家族有关，该家族在受体下调中具有公认的多种作用，但它们配备有PPXY基序，允许它们与Nedd4-家族连接酶相互作用。哺乳动物α-抑制素由6个抑制素域型适配器组成，包括ARRDC1-5和TXNIP。每个Art Rsp5适配器都被认为具有与其他Art适配器在不同程度上重叠的质膜蛋白货物储备。例如，Bul1/2在Gap1转运体向液泡的泛素化和分类中起着关键作用，而Art1在Mup1转导体的转运中起着重要作用(Helliwell等人，2001年;Soetens等人，2001年;Lin等人，2008年). 在哺乳动物细胞中，ARRDC3控制β2和β3肾上腺素能受体以及β4整合素的泛素化和下调(Draheim等人，2010年;Nabhan等人，2010年;Patwari等人，2011年;Shea等人，2012年). 最近的研究表明，一些α-arrestin蛋白通过磷酸化进行调节，特别是Tor1下游的激酶，从而允许细胞根据营养状态对质膜蛋白水平进行全局调节(MacGurn等人，2011年;Merhi和Andre 2012). 作为直接结合Nedd4-Ub连接酶的结果，所有α-arrestin家族蛋白也经历泛素化。有趣的是，缺乏主要泛素化赖氨酸靶标残基的Art1或Art4突变体作为Can1和Jen1转运蛋白底物的适配器功能很差，表明泛素化激活α-抑制素以更好地结合底物蛋白质或内吞分选机(Lin等人，2008年;Becuwe等人，2012年).

泛素损伤PM蛋白的选择

细胞还使用依赖于Ub的内胚体分选来清除受损的质膜蛋白。要做到这一点，细胞必须使用能够识别部分未折叠蛋白质的“降解子”的连接酶。在酵母细胞中，受损的膜蛋白（至少是那些可以逃逸内质网质量控制降解过程（ERAD）的膜蛋白）主要由Rsp5靶向，Rsp5是Nedd4家族连接酶，它还负责下调适当折叠的转运体和受体，以响应特定的生物刺激。具体示例包括Pma1 ATP酶、GPCR Ste2、细胞壁传感器Wsc1和精氨酸渗透酶Can1的突变等位基因(Li等人，1999;Pizziruso和Chang 2004;Wang等人，2011年;Zhao等人，2013年). Rsp5如何准确识别受损蛋白质尚不清楚，但可能涉及Rsp5用于识别其他底物的同一组广泛的衔接蛋白。一种有趣的可能性是，适当折叠的蛋白质被诱导形成类似的未折叠的“degron”样基序，作为它们在特定刺激下泛素化和下调的触发因素。例如，转运体活性本身会引起构象变化，暴露arrestin/Rsp5结合位点，这些可能模拟小的无序蛋白片段，这些片段被认为在损伤后暴露(Cain和Kaiser 2011年;Merhi和Andre 2012;Keener和Babst 2013). 一旦泛素化，这些蛋白质遵循运输（ESCRT）依赖的运输途径进入多泡体和溶酶体降解所需的内体分选复合物。

动物细胞中受损的质膜蛋白也被输送到溶酶体进行降解，但它们的泛素化识别方式有所不同。在这里，许多识别内质网未折叠膜蛋白的成分也在细胞表面起作用。蛋白质组学分析分离出与作为报告蛋白的CD4-λ的温度敏感性形式相关的泛素化机制的组分。当记者被触发展开时，它招募了热休克蛋白70（Hsc70）、Hsp90和CHIP（羧基末端Hsp70相互作用蛋白）(Apaja等人，2010年). CHIP是一种E3连接酶，在ER和细胞溶质蛋白质量控制中起作用(Cyr等人，2002年). CHIP由一个与Hsc70、Hsp70和Hsp90分子伴侣结合的氨基末端四三肽（TPR）结构域、一个介导CHIP二聚化的中心螺旋结构域和一个负责结合E2-Ub结合酶的羧基末端U盒结构域组成(Zhang等人，2005年). 类似的机制似乎与泛素依赖性降解未折叠突变（ΔF508）CFTR以及暴露的错误折叠胞质域有关。Hsc70和Hsp90以及一部分耳蜗酮（DNAJA1[Hdj2]、DNAJB2[HSJ1]、Aha1和HOP）都有助于高效的CHIP招募、泛素化和ESCRT依赖性溶酶体靶向突变CFTR(Okiyoneda等人，2010年). 除CHIP外，其他Ub连接酶可以通过伴侣相互作用识别非天然多肽。其中包括Ubr1/2、UBE3A和Cul5；然而，它们对质膜质量控制的贡献尚未得到解决(Okiyoneda等人，2011年). 也有伴侣依赖性识别非天然客户蛋白的先例，例如细胞质、内质网和细胞核中的CHIP、Hrd1和San1活性(Rosser等人，2007年;Kanehara等人，2010年;Rosenbaum等人，2011年). San1的底物识别是由具有嵌入保守识别基序的固有无序氨基和羧基末端结构域催化的(Rosenbaum等人，2011年). 可以想象，多个连接酶参与质膜质量控制，每个连接酶都有一组重叠的可能底物。CHIP的缺失部分抑制了未折叠CFTR、DRD4和V2R的溶酶体转运，而其他Ub连接酶（例如Hrd1和Gp78）的缺失减弱了ΔF508-CFTR从细胞表面的去除，这一发现支持了这种可能性(Apaja等人，2010年;Okiyoneda等人，2010年).

Ub-绑定域的基础

不同的Ub信号被存在于多种细胞蛋白（Ub受体）中的Ub结合域（UBD）识别和解码，这些蛋白能够将这些信号与特定的细胞反应（例如，修饰蛋白的内吞、降解或易位）联系起来。Ub在内吞途径中的作用主要有两种方式：作为货物上的分选信号被含有UBD的分选受体识别，或通过修饰内吞机制。迄今为止，约有20个UBD家族存在于约300个蛋白质中，尽管具有Ub结合活性的蛋白质的储备仍在扩大(Rahihi等人，2009年;Husnjak和Dikic 2012). 大多数UBD与围绕I44的Ub分子的暴露疏水补丁结合，具有相当弱的微摩尔亲和力(图2). 此外，在比较各种UBD:Ub络合物的结构时，Ub以不同的构象存在，这些构象变得很明显(Lange等人2008). 因此，Ub可以动态地采用几种构象，这些构象随后可以通过构象选择和诱导拟合的可变组合被UBD捕获(Wlodarski和Zagrovic 2009年;Long和Bruschweiler 2011;Peters and de Groot 2012年). 孤立UBD的弱结合迫使细胞应用一些支持机制，增加结合强度并确保特定信号。这些包括通过形成包含多个UBD的低聚物复合物来增加亲和力，形成多个UBD-结合表面的聚-Ub链，以及在运动受限的地方聚集结合伙伴。重要的是，在内吞途径中对Ub的识别主要发生在蛋白质仅以二维扩散而非三维扩散的膜上。此外，Ub受体可以有额外的基序来弱结合其泛素化伙伴蛋白，这不仅增加了亲和力，也增加了靶点选择的特异性。这种机制还可以提供“符合”检测能力，即这些结合基序仅在Ub结合被激发时才激活。

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图2。

Ub呈现一个疏水性相互作用表面，如图所示，它负责与绝大多数Ub结合蛋白结合。(A类)可添加到底物蛋白质的Ub拓扑类型的方案。Mono-Ub是直接附着在基板上的单个Ub。链中的多个连接的Ub可以通过K63或氨基末端连接形成线性链。这些链具有“开放”结构，其中每个Ub部分的疏水界面高度暴露。通过K48连接的Poly-Un链采用更封闭的构象，使得疏水界面更难接近。其他连接将这种相互作用界面定位在更多不同的方向，使其更适合结合含UBD的特定亚群蛋白质。(B类)Ub（PDBID:1UBQ）的结构，疏水作用表面以绿色突出显示。(C类)带有Ub的复合体中三个Ub交互模块的示例。VHS域：PDBID:3LDZ；UIM:PDBID:1Q0W；网关：PDBID:1WR6。

有各种各样的Ub修饰（各种链接类型的单、多、多泛素化），Ub信号的一个重要方面涉及细胞如何区分不同的拓扑。这些区别不仅与含UBD的内吞蛋白的功能有关，还与水解特定链型的特定DUb有关。在隔离和解决方案中，大多数已知的UBD与单-Ub相互作用，并且对特定的链类型没有明显的偏好(Husnjak和Dikic 2012). 虽然这种偏爱可能是由于目前已知的大多数UBD都是通过结合单-Ub的能力来识别和表征的。UBD的一个子集能够专门识别特定的poly-Ub拓扑，这通常是通过同时绑定到显示链接特定构象的链中的两个相邻Ub来实现的。例如，NEMO的UBAN结构域和HOIL-1L的NZF结构域通过与一个Ub部分上的表面和另一个Ub上的典型疏水表面接触，专门识别线性（Met1-连接）Ub链(Rahihi等人，2009年;Sato等人2011). TAB2和TAB3的NZF域也同时与两个相邻的Ub部分相互作用，但只有通过K63连接才能这样做(Kulathu等人，2009年). 同样，K63特异性DUb AMSH作用于泛素化的内胚体货物，同时结合两个连接的Ub部分，以正确定位在其活性位点上用于裂解的异肽键(Sato等人，2008年). 撇开这些例子不谈，许多UBD仍然显示出一些链式偏好，尽管它们与一个Ub分子结合，但许多UBD不喜欢与K48连接的poly-Ub结合(Rahihi等人，2009年). 结构研究表明，K48连接链采用紧密构象，封闭I44疏水区。相反，K63连接的链更多地延伸，并且疏水性贴片完全暴露。聚-Ub链还显示出高水平的“四元”动力学，允许溶液中出现各种截然不同的构象。限制这些构象可以直接改变特定UBD和DUb识别这些链的能力，从而提供可能调节体内Ub识别的额外物理参数(Ye等人，2012年).

尽管K11、K29和K48等其他连接也可能起作用，但在大多数情况下，单-Ub和K63连接链在内吞途径中作为分选信号占主导地位(Shields and Piper 2011年). 在实验环境中，即当Ub是永久附着的货物时，单个Ub足以输送到溶酶体(Shih等人，2000年;Raiborg等人，2002年;Stringer and Piper 2011年). 然而，作为内部化信号，单个Ub异常微弱，Ub可能仅在链中运行(Barriere等人，2006年;Hawryluk等人，2006年;Bertelsen等人，2011年). 对于多泡体（MVB）分选，多个Ub是优于单Ub的首选信号(Huang等人，2006年,2013). 此外，在沿着内吞途径运输Ub货物的过程中，DUbs不断发生链的形成和分解。制造链可能起到双重作用，不仅可以更好地与含有UBD的分选受体结合，还可以作为一种缓冲物，对抗沿途遇到的DUb，这些DUb可能会在Ub信号进入内胚体分选机之前侵蚀Ub信号(Clague等人，2012年). 类似地，内吞机制，尤其是含有UBD的内吞机制可以被泛素化，并且主要被单-Ub或短K63链修饰。单克隆抗体足以在含有UBD的蛋白质中诱导构象变化，使其无法识别和分类泛素化的货物(Hoeller等人，2006年).

除Ub外，一些UBD还结合Nedd8，与Ub相同57%；这提供了一种可能性，即这种Ub样蛋白可能在内吞途径中部分替代Ub(den Besten等人，2012年). 事实上，越来越多的证据表明Nedd8在EGF和TGF-β受体的内吞中发挥作用(Oved等人，2006年;Zuo等人，2013年). 在这两种情况下，联苯二甲酰化都是由Ub E3-l气体c-Cbl介导的。EGFR的奈德基化似乎与其泛素化的目的相同：EGFR的溶酶体分选和降解。相反，TβRII的奈迪基化通过EEA1阳性的早期内体而不是小窝途径促进其内化，从而抑制泛素化和降解。跨膜受体的neddylation在内源性条件下发生到何种程度尚需澄清；然而，这些观察表明，Ub和其他类Ub系统之间存在较大的串扰。

泛素介质如何从质膜内生化

Ub可以作为来自质膜的内化信号。对于大多数蛋白质来说，Ub作为一种分类信号进入依赖于网格蛋白的内化途径。与其他内化信号相比，如结合AP-2网格蛋白适配器复合体的YxxL或DxxxLL基序，单个Ub分子是微不足道的内化信号。工程化的Ub融合报告蛋白表明，需要多个Ub自身作为有效的内化信号(Barriere等人，2006年,2007;Hawryluk等人，2006年;Bertelsen等人，2011年). 多重单泛素化以及多泛素链可能构成有效的内化信号。在内化步骤中运行的主要多聚-Ub链似乎与K63相连，尽管也牵涉到其他关联(Boname和Lehner 2011年;Zhang等人，2013年). Ub也可以在其他较弱的内化信号的背景下发挥作用，这样多个Ub和非Ub信号的聚合效应就足以并入氯氰菊酯包被的囊泡(Kumar等人，2007年). 对于其他从质膜进行泛素化和内化的蛋白质，Ub本身可能不是操作性内化信号，而是在其他转运步骤的内吞途径中起作用(Shenoy等人，2001年;Huang等人，2006年,2007).

将Ub货物连接到网格蛋白介导的内吞机制的内吞衔接蛋白的两个最佳候选是Epsin和Eps15，它们相互作用并包含UIM结构域(表1). Epsin倾向于与K63多泛素结合，这与多个Ubs作为内化信号的需求密切相关(Hawryluk等人，2006年;Sato等人，2009年). CME现场存在其他UBD，包括CIN85和Hrs中的UBD，其他UBD可能会被发现(Soubeyran等人，2002年;Stamenova等人，2007年;Mayers等人，2013年). 由于相对较少的蛋白质被评估为依赖于Ub的内化，这些额外的含UBD的蛋白质可能作为泛素化蛋白质不同亚群的适配器。耗尽Epsin或Eps15抑制Ub融合嵌合报告子的内化，显示其在Ub依赖内化过程中的整体重要性(Hawryluk等人，2006年;Sato等人，2009年). 改变Epsin水平会干扰氯氰菊酯包被囊泡组装的动力学，当Epsin缺乏UIM结构域时，这种活性会被抑制(Barriere等人，2006年). Epsin的生化特性及其在氯氰菊酯包被囊泡组装过程中的时空特性使其成为CME内化的主要Ub受体候选物。然而，许多专门针对Epsin的Ub结合特性的分析都是在过度表达实验的背景下进行的，这些实验发现缺乏UIM的Epsin影响CME各方面的能力下降(Sugiyama等人，2005年). 在酵母实验中出现了一个更复杂的画面，其中几个内吞适配器可以被缺少UBD的版本所替代。在这里，泛素化蛋白质的内化被阻断，携带交替内化信号的蛋白质的内化也被阻断，这表明结合Ub的能力除了捕获泛素化货物外，还有其他用途(Dores等人，2010年). 有趣的是秀丽隐杆线虫表明Epsin UIM对LDLR的Ub非依赖性内吞作用很重要(Kang等人，2013年). 一种可能性是，Ub货物不仅仅是被动乘客，其Ub部分通过与相关机械的UBD相互作用，帮助正确组装和协调氯氰菊酯涂层囊泡的形成。实验表明，货物上存在的Ub会影响氯氰菊酯包被囊泡（CCV）组装的动力学，从而支持了这种可能性(Henry等人2012). 这一观点也与内吞Ub分选ESCRT装置的实验一致，该装置依靠泛素化货物的存在在内体表面进行有效组装(麦克唐纳等人，2012a). 还有一种观点认为，内化机制的泛素化可能会驱动一种强大的调控机制，该机制涉及多种分子内和分子间Ub-UBD相互作用的形成。结果是，它们的泛素化抑制了它们与其他泛素化靶点结合并控制其功能的能力。Epsin和Eps15通过依赖于它们与Ub-结扎机制相关的Ub-结合能力的机制在细胞中进行泛素化(Polo等人，2002年;Woelk等人，2006年). 通过过表达实验和嵌合Ub融合蛋白获得了泛素化可能对网格蛋白囊泡机制的功能产生影响的实验证明(Fallon等人，2006年;Hoeller等人，2006年). 这些实验提供了一个重要的概念可能性，但通过其泛素化来调节网格蛋白囊泡机械生理功能的精确且可能复杂的机制仍未解决。

泛素化膜蛋白在多血管内皮小体中的分选

一旦Ub货物被输送到早期内体，它可以被分拣成管腔内小泡（ILV），或留在内体的限制膜上，随后被回收到质膜或反式-高尔基网络（TGN）(霍塔里和海伦尼乌斯2011). 对于大多数蛋白质来说，纳入管腔内小泡可以密封其降解命运，因为这种分选步骤通常是不可逆的。ILV的形成持续到内体晚期，与溶酶体融合后，ILV及其蛋白产物被输送到溶酶体的蛋白水解腔中，从而完全降解完整的膜蛋白产物(图3). 填充晚期内体的腔内小泡使其与多泡内体或多泡小体（MVB）同义；然而，并不是所有ILV都含有从内胚体膜中分离出来的、用于溶酶体降解的蛋白质。例如，这些管腔内膜中至少有一部分作为外泌体、板层体或MHC-II复合物的储存室(Babst 2011年;2013年Raposo和Stoorvogel). 目前尚不清楚如何利用Ub将蛋白质靶向这一替代ILV亚区，并且可能独立于Ub，正如活化抗原呈递细胞中MHC-II的分类所显示的那样。此外，用于分拣Ub货物的主要分拣设备，即ESCRT设备，对于外泌体的形成或其他类别ILV的生成来说，并不是至关重要的。这些替代ILV的产生机制值得阐明，特别是鉴于最近人们认识到它们具有向远处细胞传递蛋白质和miRNA的能力，因此它们具有深刻的调节活性。酵母中似乎没有这种非Ub依赖的替代MVB途径，结合酵母和动物细胞的结构/功能研究，对负责泛素化膜蛋白溶酶体降解的保守MVB分选途径提供了坚实但仍在进化中的生化理解。

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图3。

参与细胞表面和内体泛素化膜蛋白识别和处理的蛋白质组。在细胞表面，诸如Epsin和Eps15等蛋白质识别泛素化蛋白质，并将其招募到网格蛋白包被的囊泡中。其他Ub-结合蛋白，如CIN85和Hrs，在帮助引导泛素化的货物进入囊泡方面可能具有类似的作用。一旦泛素化的货物到达内体，它就会被由ESCRT-0、-I、-II和-II组成的ESCRT装置识别。ESCRT-0的Hrs亚基具有多个Ub结合结构域，使其成为关键的Ub分选受体，可能将Ub货物传递给其他也具有Ub结合结构域的ESCRT。其他内体蛋白可作为替代性ESCRT-0样受体，将泛素化的货物输送到较大的ESCRT装置中。这些“Alt 0”蛋白包括GGA、TOM1和Bro1家族的蛋白质，其中包括Bro1、Alix和HD-PTP。

ILV生物生成和Ub依赖性分选所需的许多蛋白质首先在酵母基因筛选中鉴定出来(库恩罗德和史蒂文斯2010). 这些蛋白（通常称为E类Vps蛋白）的丢失会导致MVB形成缺陷，Ub货物分拣到溶酶体（液泡）腔中，并导致其他表型的队列，包括积累循环高尔基蛋白和液泡膜蛋白的扩大的晚期内体。总的来说，这些蛋白质定义了由离散复合物（ESCRTs-0、-I、-II和-III）以及调节ESCRT功能的辅助因子组成的ESCRT装置（运输所需的内体分选复合物）。ESCRT设备将货物识别和分拣与ILV的形成和切割相结合(Hurley和Hanson 2010). ILV的形成不同于其他囊泡形成事件，如COP-I或氯氰菊酯形成的囊泡，因为囊泡的形成是通过将细胞膜推出胞浆而不是将囊泡芽拉入胞浆而进行的。此外，ESCRT蛋白不是成品囊泡的化学计量组分，具有强大的机制以确保它们不会在囊泡制造过程中被消耗，尽管目前尚不清楚这是如何实现的。最后，ILV必须具有与限制膜功能不同的脂质组成，这允许溶酶体水解酶选择性地破坏ILV，但不破坏限制膜。大量的结构研究，结合基于脂质体的体外关键事件重组，提出了一种协同机制，即脂质通过分选和相分离进入微域，微域受到聚集在形成ILV颈部的互连ESCRT装置的约束(Hurley和Hanson 2010). ESCRT-III亚单位的螺旋聚合物在芽颈部形成，允许ILV夹入管腔。利用ESCRT-III的这种膜收缩活性在内胚体上形成ILV，也可用于逆转录病毒在动物细胞和一些太古宙中的质膜出芽和胞质分裂期间的膜断裂(Hanson等人，2008年;Lata等人，2008年;Lindas等人，2008年;Samson等人，2008年;Wollert等人，2009年;Henne等人，2012年,2013). 在ILV断开之前，可以将Ub从货物中取出，以帮助补充Ub的细胞溶质池。这一过程在酵母中得到了最好的观察，Doa4去泛素酶通过辅助因子Bro1被招募到ESCRT-III(卢塔拉和奥多里齐2004). Doa4的缺失导致Ub在液泡腔中积聚并从胞浆中耗尽，这反过来影响了许多依赖于Ub的过程(Amerik等人，2000年). 有趣的是，Doa4的活性似乎是根据Ub水平进行调节的，这表明通过MVB途径处置Ub可以作为一种调节装置来改变整个泛素/蛋白酶体系统的活性(Kimura等人，2009年). 最佳候选哺乳动物Doa4同源基因是Usp8/UBPY，它也能结合ESCRT-III；然而，其在解救溶酶体降解的Ub中的作用尚未明确(Wright等人，2011年). 事实上，USP8/UBPY以及类似位置的DUb AMSH可以绑定ESCRT-0和ESCRT-III，并且针对不同货物的大量实验表明，它们可以在MVB分拣之前对货物进行去均衡处理，以促进货物回收(McCullough等人，2004年;Mizuno等人，2005年;Bowers等人，2006年;Berlin等人，2010年;Zhou等人，2013年)，分拣后的货物去泛素化，将其从ESCRT装置中释放出来，并促进分拣到MVB中(Alwan和van Leeuwen 2007;Balut等人，2011年)，或作为一种将ESCRT组件去均衡化的方法，将其从退化或非活性构象中解救出来(Row等人，2007年;Sierra等人，2010年). 在分拣的最后阶段，货物去平衡的一个有趣的方面是，它预测货物被分拣到一个能够捕获Ub货物的域中，因此在去平衡时货物无法逃脱。目前尚不清楚是什么构成了这样一个货物陷阱；然而，已经提出了在囊泡收缩的初始阶段聚合ESCRT-III的紧密网状结构(Henne等人，2012年).

内体的Ub货物首先被ESCRT-0识别，由酵母中的Vps27和Hse1以及人类中的Hrs和STAM1/2组成。ESCRT-0具有许多生化特性，使其能够作为Ub货物的初始受体发挥作用(Shields and Piper 2011年). 首先，它有几个UBD：一个位于它的两个氨基末端VHS结构域中的每一个，三个UIM位于这两个蛋白质的中间，另一个位于STAM2的SH3结构域中(Lange等人，2012年a). ESCRT-0中的UBD需要与Ub货物关联，并能够将货物分拣到MVB ILV中。Hrs还结合另一种含UBD的蛋白质Eps15的亚型，该亚型定位于内体，可能有助于将内化蛋白的子集传递到ESCRT-0复合物。ESCRT-0还通过FYVE结构域与PtdIns3-P结合，并通过其羧基末端与氯氰菊酯结合，使其定位于早期内胚乳体内的特殊亚区，在那里蛋白质被分离以进行再循环和降解。

ESCRT-0还直接与ESCRT-I结合，并可启动ESCRT-I-向细胞膜的募集。ESCRT-I结合并招募ESCRT-II，后者随后指导ESCRT-III囊泡切断机制的组装和活动。ESCRT-I和-II也有UBD。ESCRT-I是一种异四聚体。构成酵母ESCRT-1的亚基只有四个，而人类有额外的亚型，可能有助于使ESCRT-I发挥多种细胞功能。ESCRT-I通过TSG101内的UEV结构域和UBAP1内的UBA结构域三联体结合Ub，这两个亚基在功能上分别与酵母Vps23和Mvb12同源，也与Ub结合。UBAP1是三种可并入哺乳动物ESCRT-I异四聚体的替代Mvb12同源基因之一，但它具有最高的Ub结合活性，似乎最适合将Ub货物分类为MVB(Stefani等人，2011年;Agromayor等人，2012年). 通过酵母Vps23和Mvb12或哺乳动物UBAP1阻断Ub货物分选使Ub结合失活的突变表明ESCRT-I也作为Ub分选受体发挥作用(Shields等人，2009年;Stefani等人，2011年). ESCRT-II通过其Vps36/Eap45亚单位结合Ub，该亚单位也结合内体PtdIns-3P。酵母和哺乳动物Vps36通过不同的机制与Ub结合，NZF域介导酵母Vps36与Ub的结合，哺乳动物Vps36/Eap45通过称为GLUE域的pleckstrin同源域变体结合(Shields and Piper 2011年). 目前尚不清楚ESCRT-II的Ub绑定是否对Ub货物分拣至关重要。哺乳动物ESCRT-II的耗竭不会引起与ESCRT-I耗竭相当的严重分选缺陷，其Ub结合活性在分选过程中的作用尚未确定(Bowers等人，2006年). 酵母ESCRT-II对MVB分选至关重要；然而，其Ub结合活性的丧失只会产生轻微到中度的排序缺陷。

总结意见和未来方向

过去十年已经建立了一个引人注目的范例，说明Ub如何通过作为分类信号在内吞途径中介导贩运事件。这种模式充满了细胞机器，可以识别Ub货物并分类为各种运输中间产物。广义而言，该过程通过在特定分选设备内聚集多个低亲和力UBD进行工作，该分选设备通常识别由多个Ub部分修饰的Ub货物，通常表现为短K63连接的多泛素链。这个基本框架很有帮助；然而，许多方面还没有确定，我们需要做更多的工作，才能从我们现在可以描述的基本和通用过程过渡到更准确、更复杂和更精细的理解，从而解释内吞系统的复杂性。随着操作和测量泛素化的新工具的开发，以及人们对泛素化所能发挥的扩大效应和不同的多泛素链所能实现的特殊功能的日益认识，这种理解在实验和概念上都变得越来越接近。

就将Ub理解为溶酶体分选信号而言，绝大多数研究都集中在折叠良好且表现良好的细胞表面蛋白质上，这些蛋白质在特定的触发条件下进行“下调”并传递到溶酶体。关于受损蛋白质是如何被挑选并分类为溶酶体的，以及是否需要不同的机器来处理这些蛋白质，我们知之甚少。此外，如果Ub作为细胞表面内化的分选信号，作为TGN的分选信号或可能在不同于MVB的其他位置，那么Ub分选信号只能暂时使用，作为一种逐步分拣信号，传递到内吞系统中的离散区域，而不会使货物完全进入溶酶体降解。然而，很少有实验策略被配置来测试这种可能性。

识别Ub货物的内吞机制在很大程度上受到关注。我们最完整的理解是ESCRT装置，它在内胚体上起作用，调节多泡晚期内胚体ILV的分选。我们对如何在质膜、TGN和内吞系统中识别和分类Ub货物知之甚少。尽管我们对ESCRT装置的结构有详细的了解，但在了解与Ub货物相互作用的所有蛋白质、是否有一些蛋白质专门用于不同类型的货物、它们如何将货物转移到ILV中以及如何刺激或抑制其活性方面，仍需进一步了解。此外，Ub/内体系统中的几个参与者在细胞内具有多种功能（例如，在MVB分选、胞质分裂和转录中起作用的ESCRT）或在同一过程中发挥多种作用（例如，MVB分选过程中的AMSH、USP8和Bro1）使得过表达或表达不足实验难以去卷积它们的贡献。利用这些组件如何相互作用的新兴结构细节，使特定突变体在特定功能方面存在缺陷，应该有助于更准确地解析这些角色。

另一个挑战是如何识别Ub的性质，这通常是通过不断扩大的域来实现的，这些域往往在毫摩尔范围内结合较差。事实上，大量的低亲和力UBD正在出现，这不仅表明了Ub可能控制我们尚未深入研究的大片生物的可怕前景，而且还提出了实验义务，证明此类UBD确实有助于依赖Ub的生物过程。UBD的低亲和力通常迫使它们在更大的环境中工作，与其他UBD协同工作，或者可能在蛋白质复合物中工作，这些蛋白质复合物因其自身的泛素化而发生构象变化。一个诱人的观察结果是，大多数UBD使其所驻留的蛋白质容易泛素化，为它们提供了不同调节模式的巨大潜力。例如，Rab5的GTP交换因子Rabex5在内吞途径中作为一种针对自身和其他靶点的Ub连接酶，以及作为一种结合Ub货物的Ub结合蛋白及其自身的泛素化形式，都可能影响Rabex-5激活Rab5(Mattera等人，2006年;Mattera和Bonifacino 2008年;Xu等人，2010年;Yan等人，2010年;Aikawa等人，2012年). 这些发现预示着一个丰富而有趣的未来。尽管如此，它们还是提出了一个重大挑战，因为很难清楚地剖析这些模型的生理相关性。

脚注

参考文献