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.2012年4月；13(4):331-8.
doi:10.1038/embor.2012.18。

货物泛素化对多泡体管腔内小泡的形成至关重要

克里斯·麦克唐纳 1, 尼古拉斯·布奇科维奇, 丹尼尔·斯特林格, Scott D Emr公司, 罗伯特·C·派珀
附属公司

货物泛素化对多泡体管腔内小泡的形成至关重要

克里斯·麦克唐纳等。 EMBO代表. 2012年4月.

摘要

各种运输囊泡的有效形成受货物的存在影响，这表明货物本身可能在囊泡的生物发生中起决定性作用。然而，由于难以消除内源性货物，因此缺乏支持这一概念的明确体内实验。输导所需的内膜分选复合体（ESCRT）装置将泛素化膜蛋白分类为内胚体管腔内小泡（ILV），并在多小泡体内积聚。在这里，我们表明，货物泛素化是有效将ESCRT机械招募到内胚层膜上以及随后形成ILV所必需的。

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数字

图1
图1
Hse1融合到一种去泛素酶，阻止泛素化蛋白质的MVB分类。(A类)Hse1 DUb融合蛋白示意图，显示ESCRT-0的Hse1亚基的关键功能结构域与去泛素化酶UL36的催化结构域融合。VHS（Vps27，Hrs，STAM），UIM（Ub-相互作用基序）和SH3（Src-同源性3）。(B类)第四人民党表达空载体（−）或GFP-Ub（+）的Δ细胞生长到对数期，并用三个5分钟脉冲（35球化和裂解前的S-蛋氨酸；然后使用抗GFP抗体对裂解产物进行免疫沉淀。(C类)GFP-Ub在携带整合蛋白的WT细胞或WT细胞中的定位CUP1大学-Hse1-DUb（上部面板）。用CuCl培养细胞2显微镜检查前7小时。下部面板显示GFP-Ub在第4版Δ，无论是否表达Hse1 DUb。用脂质结合内吞示踪剂FM4-64对细胞进行反标记（在30°C下30分钟），然后在富培养基中追踪15分钟第4版Δ突变体。比例尺，5μm。(D类)275个突变株的E类舱室内体（通过FM4-64的积累鉴定）第4版Δ电池或101第4版表达Hse1-DUb的Δ细胞与GFP-Ub共定位进行评分。条形代表平均和误差条形s.d.ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；MVB，多泡体；Ub，泛素；WT，野生型。
图2
图2
失去泛素化的货物可消除腔内水泡的生成。(A类)示意图显示了在每个实验组中使用的与Ub融合或不融合的货物形式（Mup1-GFP），以及与UL36 DUb酶融合或未融合的ESCRT-0亚单位Hse1形式。(B类)Mup1-GFP在中的本地化pep4Δatg8Δ不表达Hse1-DUb或表达Hse1-DUb的细胞。Mup1-GFP-Ub在第四人民党Δ第8天还显示了ΔHse1 DUb单元（右侧面板）。细胞在富含CuCl的培养基（充满蛋氨酸的YPD）中培养12小时2.比例尺，5μm。(C类)基于TEM的细胞分析，如B类细胞经球状成形、固定、染色并进行TEM分析。五、 标记M和N。比例尺，1μm。(D类)基于冷冻电子显微镜的细胞分析B类.比例尺，1μm。(电子)MVB定位ILV的冷冻电子显微镜图像放大D类.比例尺，50 nm。DUb，氘化；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；ILV，腔内小泡；M、 线粒体；MVB，多泡体；N、 细胞核；透射电镜；Ub，泛素；五、 液泡。
图3
图3
额外的泛素化货物补充了ILV的积累。(A类)TEM实验的形态分析如图2C所示。通过计算24个野生型细胞、52个表达Hse1-DUb的野生型细胞和36个同时表达Hse1-DUb和Mup1-GFP-Ub的野生细胞液泡内的ILV，计算出ILV的平均数量（每个细胞每段）。误差棒=s.d.通过测量野生型细胞中的329个ILV和共表达Hse1-DUb和Mup1-GFP-Ub的细胞中的333个ILV，计算平均囊泡大小。误差线=s.d(B类)的TEM图像vma4型Δ细胞有和没有Hse1-DUb表达。在球状成形、包埋和电镜分析之前固定细胞。(C类)单独表达Mup1-GFP-Ub或表达Mup1-GFP和Hse1-dub的WT细胞的荧光定位和TEM分析*其中DUb携带失活突变，表达Hse1-DUb（活性）的细胞与Ste3-GFP-Ub或Ub-GFP-Cps1共存。DUb，氘化；运输所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；ILV，腔内小泡；透射电镜；Ub，泛素；五、 液泡。
图4
图4
Ub-cargo对内吞体ESCRT定位的影响。(A类)GFP标记的ESCRT-0（Vps27）、ESCRT-I（Vps 23和Vps 28）和ESCRT-II（Vps 22和Vps36）亚单位在缺乏或存在Hse1-DUb的野生型细胞中的定位。细胞在存在CuCl的最小培养基中生长2显微镜检查前7小时。还描述了GFP标记的ESCRT在共表达Mup1-RFP-Ub的Hse1-亚表达细胞中的定位（右侧柱）。比例尺，5μm。(B类)GFP标记的ESCRT亚单位在第4版Δ细胞在不存在或存在Hse1 DUb表达的情况下。比例尺，5μm。DUb，氘化；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；Ub，泛素；WT，野生型。
图5
图5
GFP标记ESCRT的功能和功能建模。(A类)对WT细胞或表达GFP标记的ESCRT亚单位的细胞进行分析，将其作为该蛋白的唯一来源，以便将Sna3-RFP的MVB正确分拣到液泡内部。还显示了对缺乏Vps28-GFP和Vps36-GFP细胞的相同分析VPS4系列. (B类)CPY是从细胞内和分泌的细胞外部分进行免疫沉淀的，这些部分来自脉冲标记的细胞35S-蛋氨酸10分钟，在30°C下追逐50分钟。(C类)Ub-cargo如何推动ESCRT招募或保留以及后续ILV形成的模型。在没有货物的情况下，ESCRT迅速从内体中回收，无法形成生产复合物。在有货物的情况下，ESCRT得到更好的保留，使其能够正确组织并完成ILV的形成，同时将Ub-cargo分类到这些囊泡中。羧肽酶Y；E、 细胞外；ESCRT，转运所需的内体分选复合物；绿色荧光蛋白；I、 细胞内；ILV，腔内小泡；MVB，多泡体；RFP，红色荧光蛋白；Ub，泛素；WT，野生型。
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