跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞分子医学杂志。2011年4月；15(4): 949–956.
2010年5月24日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1582-4934.2010.01092.x号
预防性维修识别码：项目经理3922679
PMID：20497491

绘制排斥反应网络——鉴定心脏移植候选基因的系统生物学方法

马丁·卡德拉斯,*,a、，b、，1 曼努埃尔·冯·拜仁,a、，1 安舒辛哈,c（c） 库拉姆·沙赫扎德,一 法拉纳·拉蒂夫,一 魏济特·林,c（c） 埃尔南·格雷内特,b条 埃斯特班·塔巴克,d日 托德·克林勒,e（电子） 安德烈亚·卡利法诺,c中，1和马里奥·C·邓*,a中，1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

技术的发展导致人们对系统生物学方法的兴趣增加，以表征疾病机制和与特定疾病相关的候选基因。我们建议通过细胞重建来描绘人类外周血单个核细胞（PBMC）网络，以指导候选基因的鉴定。基于来自98名心脏移植患者的285个微阵列（7370个基因），这些患者参与了心脏同种异体移植排斥基因表达观察研究，我们使用了一种称为ARACNe（精确细胞网络重建算法）的信息理论逆向工程算法和染色质免疫沉淀分析，以重建和验证假定的基因PBMC相互作用网络。我们将重点放在转录因子（TF）基因上，并制定了优先评分，以结合网络动力学方面的内容和已发表文献中的信息来监督基因发现。ARACNe生成了一个细胞网络，并预测了排斥和静止期间每个TF的相互作用。优先级得分最高的基因包括与凋亡、体液和细胞免疫反应相关的基因，如GA结合蛋白转录因子（GABP）、B细胞κ轻多肽基因增强子核因子（NFκB）、Fas（TNFRSF6）相关的基因通过死亡域（FADD）和c-AMP反应元件结合蛋白。我们使用TF CREB来验证我们的网络。ARACNe预测了29个可能的CREB第一邻居基因。其中11人（37%）之前曾有报道。在18个未知的预测相互作用中，共鉴定出14个引物，11个引物可被免疫沉淀（78.6%）。总的来说，75%(n个=22）验证了推断的CREB目标，显著高于随机预期(P（P）<0.001，Fisher精确测试）。我们的结果证实了ARACNe重建PBMC转录网络的准确性，并显示了系统生物学方法在识别可能的分子靶点和生物标记物方面的实用性。

关键词：系统生物学、细胞网络、心脏移植、排斥反应、基因表达、候选基因

引言

心脏移植因不同形式的心脏移植排斥反应而变得复杂[1]. 移植心脏的免疫反应是一个复杂的异质性过程，由多种细胞途径介导，这些细胞途径取决于与受体、供体、缺血再灌注损伤以及手术过程和供体-受体相互作用对自然人体屏障的破坏有关的因素[2]. 为了应对这种免疫反应，移植医生在识别、引发和维持免疫反应时使用多种药物的组合来损害免疫系统[三]. 已经认识到三种主要的拒绝形式[1]. 在同一个活检标本中发现多种排斥反应是常见的[1,4]. 此外，还存在各种形式的移植物功能障碍，这些功能障碍被认为是排斥反应的发作，但没有明确的具体机制[5]. 尽管如此，对这些发作的治疗还是遵循了经典的排异方法；在某些情况下，临床反应是有利的。

急性排斥反应的系统生物学方法包括一个假设，即对移植移植物的反应是由各种细胞途径介导的一系列事件的结果。这些可能在器官和系统层面极化为一种表现，具有与共同作用过程相关的复杂性。我们将这些过程确定为具有特定尺寸和模块或接头配置之间特定关系的模块。我们设想拒绝过程，通常称为单个实体(即急性细胞排斥或抗体介导的排斥），是具有不同大小和空间配置的模块化结构组合的结果。

这一假设表明，并没有一种特定形式的排斥反应，而是一系列生物过程促进了特定表型的发展，这是由潜在生物学的复杂性产生的。需要问的问题是：（1）这些模块存在吗？（2） 我们能描述他们吗？（3） 它们是否具有作为表型条件出现的特定可塑性？

这些问题的答案很可能在短期内无法解决，当然我们也无法解决，但至少可以利用不断发展的技术来探索这些问题。这些答案，尽管仍然是部分的，但已经证明作为治疗干预的指南是有用的[6]. 他们有望成为开发新的个性化、诊断和治疗策略的驱动力[7].

人类基因组序列的公布为通过应用高通量技术以前所未有的方式了解急性排斥过程开辟了一条途径[8]. 微阵列表达谱提供了研究数千个功能特征和非特征基因活性的能力；它们的使用促进了移植领域的发展[9]. 基因表达谱相关研究的许多局限性、挑战和解决方案已经得到解决[10–12].

涉及系统生物学的方法可以通过定量测量同时观察多个成分。通过与数学模型的严格数据集成，而不是在有限条件下研究系统的单个方面，该技术可用于识别“紧急属性”。系统生物学方法表明，细胞调节网络中模块的失调最终导致单个基因转录物及其与临床表型相关的蛋白产物的差异表达模式。器官层面的特性是从分子和细胞层面的调控模式“涌现”出来的。通过检查一组相关基因的联合行为，即使在个别基因的表达没有显著差异的情况下，也可以检测到连贯的变化[13]. 系统方法已用于生命科学和社会科学[14–18]. 通过使用各种数据，包括微阵列表达谱，它们越来越多地应用于分析在特定细胞环境中活跃或不受调控的分子通路[19]. 在本报告中，我们描述了一项回顾性研究，涉及目前可用的技术[10,19,20]这使我们能够使用系统生物学方法识别和表征与排斥问题相关的特定基因和模块。

材料和方法

该项目涉及对一项大型多中心研究产生的基因表达数据进行回顾性分析，该研究题为“心脏同种异体移植排斥基因表达观察”（CARGO）研究。本研究使用基因微阵列作为开发分子分类器的步骤之一[9]. CARGO研究的结果已在其他地方发布。在这项回顾性分析中，我们使用基因表达分析和细胞重建方法来识别和表征急性细胞排斥过程的组成部分基因和基因模块。本研究中遵循的步骤摘要如下所示表1和D如下所述。

表1

网络重建和分析中的顺序

步骤程序
1建立表型独立网络
2关注生物相关基因
三构建探索性表型特定网络
4计算优先级分数
5生成基因列表并选择候选TF
6验证结果

患者

本研究中的患者来自CARGO研究数据库。心脏移植后，在特定时间间隔或发生不良事件时，对所有患者进行常规心内膜心肌活检（EMB）评估。每次患者进行活检以进行微阵列分析时，均采集外周血单个核细胞（PBMC）样本。PBMC微阵列的结果用于与病理结果相关，并用于基因发现。共有98名患者提供了285份PBMC样本，用于微阵列分析。对于研究人群，捐赠者和接受者的特征与器官共享联合网络2003年报告的特征相同，并在其他地方进行了描述[9].

心内膜心肌活检

按照1990年心脏移植EMB的分类，由当地病理学家和三名独立的“中央”病理学家对标准技术进行的EMB进行分级，而这些病理学家对临床信息一无所知[21]. 这一分类根据炎症浸润的严重程度和其他因素确定不同程度的排斥反应。在目前的分析中，我们将EMB分为两大组，“静止”组[国际心肺移植学会（ISHLT）0级]或“排斥”组（ISHLT1A级或更高）。

血液样本

使用密度梯度离心法从8 ml静脉血中分离出PBMC（细胞制备管，Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）。在静脉切开术后2小时内，将样品冷冻在裂解缓冲液（RLT）中（美国加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）。纯化RNA的完整性由生物分析仪测试；只有28S-18S比例足够的样品才用于微阵列杂交。

微阵列表达谱分析

我们使用了一个定制的以白细胞为中心的7370基因微阵列（TeleChem International，Inc.，Sunnyvale，CA，USA），该微阵列用于多中心CARGO研究的初始阶段[9]. 该微阵列是通过使用刺激和静息人类白细胞中表达的RNA序列（PCR Select，Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA）和公共序列数据库开发的。消除了任何显示出显著系统变异的基因阵列。将所有产生的微阵列数据提交给国家生物技术信息中心的基因表达总览[22] (GSE2445标准). 删除了缺失值超过30%的基因，剩下4688个基因有待分析。由于网络生成中使用的相关性度量不能容忍缺失数据，因此使用k个-最近邻算法在微阵列显著性分析中的实现(http://www-stat-class.stanford.edu/sam) [23]. 然后将得到的矩阵导入生物信息学平台（geWorkbench，http://gforge.nci.nih.gov/frs/？group_id=78)用于蜂窝网络重建过程。

蜂窝网络改造

为了推断蜂窝网络，我们使用了一种称为ARACNe（精确蜂窝网络重建算法）的算法。此算法的应用已由其他人发布[7,19,24]，蜂窝网络重建过程的详细描述已在别处发布[20]. 简言之，ARACNe是一种信息理论的逆向工程算法，用于人类细胞网络的全基因组推理[19]. ARACNe分两个不同的步骤计算蜂窝网络的再生。在第一步中，通过计算相互信息来识别候选交互(我[克我;克j个])对于所有基因-基因对，只保留那些超过相互信息阈值的对，我0，对应于所需P（P）-值，P（P）0拒绝了两个基因在统计上独立的无效假设，即 我[克我;克j个]†我0在第二步中，ARACNe通过使用数据处理不等式消除了大多数间接交互[25]（DPI），信息论的一个特性。DPI指出，如果基因克1和克三只通过第三个基因相互作用，克2，以下关系成立：我[克1;克三]≤最小值(我[克1;克2],我[克2;克三]). ARACNe从第一步开始识别每个三边环，删除所有(克1–克三)满足先前DPI公式的交互作用。最终，ARACNe插补了一个遗传“共识”网络，这需要进一步的探索和验证。

网络可视化

在Cytoscape中创建了重建细胞网络的图形表示[26]. Cytoscape是一个开源生物信息学软件平台，用于可视化分子相互作用网络和生物路径，并将这些网络与注释、基因表达谱和其他与细胞状态相关的数据集成(http://www.cytoscape.org).

确定初始研究的重点基因

重构蜂窝网络后，第一个挑战是确定如何进行研究。寻找起点的一种方法是关注在普通生物学中起核心作用的基因[27,28]. 其中，转录因子（TF）基因与多种过程相关，它们高度连接并调节细胞内的众多过程。因此，我们选择关注TF。为了识别微阵列中的TF，我们根据基因本体联盟分类使用了基因本体术语“TF活性”（GO:0003700）[29]. 下一个问题是这些TF在排斥或静止期间是如何受到不同调节的。我们使用ARACNE在拒绝和静止期间执行蜂窝网络重建（因为只有在探索性目的中才需要小样本），并将此信息用于我们的算法，如下所述。

蜂窝网络的探索

为了确定在我们最初的研究中要关注的候选基因组，我们创建了一个经验分数，我们称之为“优先级分数”。该分数是一种定量测量，总结了重建网络的特性，并整合了特定基因下与研究过程相关的已发布生物信息。该优先级分数估计如下：

方程式图像

对于给定的基因交叠项[1]测量两种表型之间的差异连接性；这个连通性项[2]测量连接度（第一个邻居或连接边的数量）和合理性术语[三]根据已发表的文献测量免疫反应的生物学合理性。所有这三个因素都在0和1之间缩放，并乘以一个权重因子，以产生总优先级分数，该分数也在0和1.之间缩放。权重系数允许灵活确定每个因素的相关性。在重叠术语中[1],我是静止和排斥两种表型之间的重叠连接数；一是静止表型的总连接数b条是排斥表型的总连接数。我们使用的最小值一和b条对重叠部分进行称重，我，以便在0和1之间缩放整个因子。我们使用拒绝网络和静止网络来估计哪个TF具有最大的差分连通性。这使我们能够识别TF，其网络可能是介导排斥反应的重要遗传模块与平静。因此，TF基因在两种状态之间的连接性发生显著变化时，得分更高。

在连接性术语中[2],k个是感兴趣基因的连接性程度，通过将表型中的目标数相加并减去重叠数，从而只有唯一的目标数计入得分。k个最大值是建立TF高度连接的最大连接度。

在合理性术语中[三],我通过与排斥反应和免疫系统激活相关的基因相关文献的数量来衡量，与所研究的TF中发现的最大数量相比。由于很难衡量搜索召回（检索）的成功程度，所以这个因素不容易确定。在这种情况下，我们使用GeneCards接口来确定数字，我与TF相关的相关出版物，并通过我最大值，一个常数，表示确定TF已被充分研究所需的最大文献量。GeneCards是一个集成的人类基因数据库，可自动挖掘基因组、蛋白质组和转录组信息，可在http://www.genecards.org/index.shtml。通过此工具，我们使用可用别名和其他搜索词“免疫”、“免疫”和“炎症”搜索PubMed。

验证

我们执行了两个验证步骤：生物信息学使用以前发布的数据和在体外使用染色质免疫沉淀（ChIP）分析。

验证生物信息学

用于验证生物信息学，通过PubMed检索的已识别基因的公开数据提供了必要的信息，使用每个基因名称和“染色质免疫沉淀”作为关键词。在确定为候选基因的基因中（见“结果”部分），c-AMP反应元件结合蛋白（CREB）的信息可用。因此，为了进行验证，我们选择了该基因，该基因包含在目标基因数据库中，该数据库位于http://natural.salk.edu/CREB网站/[30]. 通过Fisher精确检验，将已确定为CREB第一邻居的基因与我们的发现进行了比较。A类P（P）-值<0.01被认为是显著的。

验证在体外

对从浅黄色大衣（纽约市血库，纽约，纽约，美国）中获得并与甲醛交联的PBMC进行了ChIP分析[31]. 简单地说，细胞被裂解和超声处理以产生基因组DNA的小片段。在制备细胞提取物和染色质碎片后，将蛋白质与交联的DNA一起进行免疫沉淀。然后反转免疫沉淀材料中的蛋白质-DNA交联，并纯化DNA片段。用于特定基因组区域的关联体内与基因组的其他部分相比，该区域的DNA片段应在免疫沉淀物中富集。免疫沉淀物中相关基因组区域的存在是通过PCR扩增，使用来自相关区域和参考区域的特异性引物来确定的[24]. 引物是使用转录调控元件数据库设计的(http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/TRED.cgi？进程=home)通过使用geWorkbench v1.0.4在转录起始位点上游4000bp和下游250bp处搜索CREB结合位点（TGACGTCA）(http://gforge.nci.nih.gov/frs/). 对于所有靶点，选择与假定结合位点序列匹配概率最高的结合位点。引物3选择了最靠近结合位点的侧翼引物(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，产品规模在150至250 bp之间。

结果

蜂窝网络的重建

蜂窝网络的重建分两步完成。第一步，建立共识网络（表型无关）。在第二步中，为了探索目的，重建了表型特异性网络。构建该网络是为了独立预测与每个表型相关的基因可能的相互作用。在此过程之后，ARACNe使用保留用于分析的所有微阵列4688个基因重建了网络，与基因生物学无关。对于每个基因，我们获得了一个“第一邻居”基因列表，根据该算法，这些基因被预测与每个基因直接交互。这个网络生成过程需要大量资源。它包含了关于基因生物学和基因在存在或不存在排斥反应时的行为的有限信息。然而，它反映了所有基因表达谱组合的所谓推定共识或平均网络，我们验证了其准确性（见下文）。在评估生成网络的再现性后，我们进一步探索了它。

TF网络的重建

我们首先关注具有高度生物相关性的基因组，并研究其周围网络。为此，我们首先关注通过基因本体分类识别的TF基因。我们通过静态和拒绝样本恢复了每个TF的细胞网络，以进行探索。聚焦于TF是朝着两个目标迈出的第一步，即识别控制主要细胞过程的相关基因，并降低最初问题的复杂性。ARACN按照以下总结的程序为152个TF重建了轮毂表1这只允许将DPI应用于所有三种相互作用本质上都是转录的相互作用子集，从而避免了成对相同复杂蛋白质的转录相互作用的消除，这些蛋白质通常具有高度相关的表达谱。在本分析的母体研究中，该方法增加了经验证的目标富集的统计显著性[20].

差异TF网络

通过在探索意图中推导拒绝和静止的单独网络，对TF进行差异连接性排序，并使用“静止”（ISHLT 0级拒绝）或“拒绝”（ISHLT≥1A/1R）应用优先级得分，确定最有可能代表同种异体免疫中关键中枢的TF候选者样品。这使得探索性生成每个表型的单独ARACNe网络成为可能。根据这些结果计算优先级得分。根据表S1中列出的TF在排斥反应和静止中的生物学作用，应用优先级评分对其进行排名。得分最高的10%基因的结果见表2以及表S2中基因和得分的完整列表。

表2

排名最高的TF

TF基因N个Q中的节点N个R中的节点N个节点重叠N个找到个文章轮毂度PS（聚苯乙烯）
GABPB2公司354203105219,1144520.829877
RERE公司113602810361450.798333
NFKB1型36921412661884570.783399
NR4A3型4342205333650.776946
STAT3（状态3）147165526272600.76502
RELA公司8075175401380.758773
MYC公司188169625452950.741747
NR3C1号机组167121555962330.701433
STAT5B型48364245800.682093
CREB1号机组151136462992410.669258
STAT5A型102124282441980.667587
座椅模块组件3270192712243910.663352
PPARG公司9064346901200.661664
红外16666223461100.659133
RARA公司12194261701890.642897

TF：转录因子；Q： 静止；R： 拒绝。

使用评分系统对TF进行优先级排序

根据其优先级得分，排名靠前的基因包括NFKB1、信号转导和转录激活因子（STAT）家族的基因、人类c-myc基因（myc）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）和干扰素调节因子（IRF）。TF CREB在152个TF中排名第10，按枢纽连通度排名第5。我们选择CREB进行进一步的分析和验证。在排名前10%的候选TF中，我们选择CREB进行进一步研究的原因是文献中有大量可用信息，以便使用ChIP-on-ChIP数据进行验证。此外，CREB在细胞增殖过程中的作用以及在移植领域缺乏信息，使其成为一个有趣的候选。然而，其他几个基因也可以用类似的理由选择。正如“讨论”部分进一步阐述的那样，关于CREB在排斥反应中的作用，还有一些尚未回答的问题，可以根据对基因调节活性的进一步了解进行进一步研究。可能会从该列表中选择其他高级目标进行未来研究。

验证生物信息学预测的第一个邻居

在ARACNe重建CREB第一邻域后，我们进行了两层验证程序，以确认CREB的预测靶基因确实是靶基因。在我们的战略中，我们对发布的验证目标使用可用的CREB靶基因数据库[30]在http:（natural.salk.edu（CREB）（包含ChIP-on-ChIP信息。29个预测的第一个邻居中有11个（38%）以前被报告为CREB结合靶点(P（P）=0.000001，费希尔精确试验）；18个构成了新的预测。先前验证的基因包括细胞因子诱导的含SH2蛋白（CISH）、拓扑异构酶（TOP）1、MAP/微管亲和力调节激酶（MARK）3、SON DNA结合蛋白（SON）、FADD、肿瘤易感基因（TSG）101、锌指蛋白（ZNF）146、HSPC111（假想蛋白）、MDS025（假想蛋白质）、，GA结合蛋白转录因子、β亚基（GABPB）2和甲基CpG结合域蛋白（MDB）4(图1，左侧).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcmm0015-0949-f1.jpg

CREB第一/第二邻居网络。左：通过包含所有具有P（P）<1e-7基于他们与CREB的成对相互信息。CREB子网络包括29个直接连接到CREB的基因（第一个邻居；用较大的圆圈表示）和491个通过中间物连接的基因（第二个邻居）。红色或粉色节点分别代表ChIP数据可用或不可用的第一邻近靶基因；黄色和淡黄色节点分别代表ChIP数据可用或不可用的第二邻近靶基因；CREB以绿色显示；白色节点表示没有CREB相关信息的基因。附录中给出了完整的基因列表，包括基因符号、ID和LocusLink ID。对18个未经验证的假定CREB第一邻居的14个基因的CREB结合位点（TGACGTCA）进行了ChIP。有10个8人类白细胞，14个基因产物中有11个是免疫沉淀的。免疫沉淀前的总染色质（输入DNA）以1:1000稀释度用作PCR阳性对照（未显示阴性对照）。

对之前未验证的预测第一个邻居进行ChIP验证生物信息学

此外，我们执行了特定的ChIP分析验证未验证的预测目标生物信息学在ARACNe鉴定的18个假定靶点中，我们选择了14个基因，其启动子序列可以从TRE数据库中检索到，其CREB结合位点（TGACGTCA）在相对于转录起始位点的-4 kbp到+250 bp范围内被鉴定，以供ChIP进一步生化验证。这14个基因中的11个【MBD4，FLJ14153（假设蛋白），220 kDa大鼠激酶D相互作用物质的同源物（KIDINS220），去盖酶（DCP）2，人类免疫相关核苷酸（HIAN）2，HESB-样结构域包含（HBLD）1，kelch-like 6（果蝇）（KLHL6），蛋白酪氨酸磷酸酶，E型受体（PTPRE）、剪接因子、精氨酸/丝氨酸富集（SFRS）2IP、溶酶体相关膜蛋白（LAMP）2、HIMAP4（免疫相关蛋白2）]可使用CREB抗体进行免疫沉淀（sc-2027，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA），表明CREB与其启动子结合体内(图1，右侧）。CREB目标验证时生物信息学从生物化学角度考虑，75%的ARACNe推断的CREB靶点（29个靶点中的22个）得到了验证，这一比例高于偶然预测(P（P）<0.0001，Fisher精确测试）。这证实了ARACNe算法在人类蜂窝网络推断中的高精度。

讨论

对基因组完整序列的了解，以及能够监测导致特定细胞功能的信息流的技术，为系统生物学[14–18]. 因此，我们建议通过应用系统生物学方法可以更好地理解心脏移植排斥反应过程的复杂调控。先前的工作涉及从PBMC表达谱中获得的数据，以生成一种诊断测试，排除急性细胞性心脏移植排斥反应[9].

在这项回顾性研究中，我们证明了系统生物学方法的可行性，该方法涉及新技术和概念，用于评估排斥过程。这种方法包括(我)重建蜂窝网络(ii（ii）)关注可能在调控网络中发挥作用的相关基因（如TF）(三)应用一种名为“优先级评分”的探索工具，开发该工具的目的是利用与免疫系统网络特征和已发表生物学相关的信息来通知候选基因的选择，以及(iv（四）)使用先前发布的信息验证推断的一致性蜂窝网络[19,30]和通过ChIP分析[24].

我们证明，可以使用逆向工程方法计算推断假定的PBMC监管网络通过心脏移植受者急性细胞性心脏移植排斥反应和静止期间获得的一组聚焦PBMC微阵列表达谱。具体而言，我们旨在开发一种系统化策略，用于从微阵列分析重建细胞网络，并评估显著的TF基因。从网络和生物学原理出发，优先度得分被开发为分析和整合计算和生物学信息的工具，以将候选基因列表缩小为一组高度相关的基因。我们将从计算重建网络中收集的信息与公布的生物证据相结合，同时允许对分配给每个变量的权重的灵活性适用于不同的分析方法。为了计算优先级得分，我们(我)分析了平均网络中每个TF的连通性（第一个邻居的数量）（优先级得分的连通项）(ii（ii）)评估排斥和静止这两个子网络的基因变异（优先得分的重叠项）和(三)通过使用GeneCards和PubMed界面评估每个TF的相关文献，纳入了一个生物相关性标准（优先级评分的合理性术语），因为它与每个TF拒绝相关。优先评分充分识别了TF，如GABP、NFKB和STAT家族的TF，这些TF已被广泛研究并与细胞免疫反应相关[32–34].

为了验证重建的网络，我们使用了两个程序，生物信息学和在体外虽然ARACNe推断的29个基因中只有11个（38%）是非TF聚焦共识网络中CREB的靶基因，但之前通过ChIP芯片数据进行了验证[30]，另外11个基因在本研究中得到验证，使总百分比达到75%。这一结果再现了使用这种方法的先前研究的成功率[19,20]并证实了其在推断基因间物理相互作用方面的价值。为了支持我们的结果，即ARACNe促进了感兴趣的中枢基因的预测可能性（75%验证的假定CREB第一邻居）是其他组的结果[28]. 张等。使用全基因组方法来表征CREB调控的目标基因，发现82个已发表基因中的64个（77%，P（P）= 2 × 10−11)在基因组水平上进行了验证，表明它们的使用生物信息学方法产生生物学相关位点。出于类似的原因，我们认为75%的ARACNe的确认/验证通过结合生物信息学和在体外方法在已发布的标准范围内。将ARACNe算法与传统策略结合使用的好处在于快速可靠地识别目标。

我们的实验至少部分回答了我们的首要问题。首先，我们确定了模块，在这种情况下，每个TF与其第一个邻居（“TF邻居”）。这些模块通常由具有相似功能特征的基因组成，或以某种方式相互生物关联，从而参与特定的协调反应。其次，我们确定了这些模块的特性，这些特性代表了这些基因对环境变化的活性调节(即拒绝），推断为在一种条件下直接相互作用，而不是在另一种条件中。

已知与排斥反应病理相关的基因（如GABP、NFKB和STAT）被鉴定为高得分中枢基因。我们选择用于验证计算推断网络的TF CREB是一种参与细胞增殖的基因，这是一种在免疫反应中很重要的机制[35,36]. 抗原提呈后，T细胞被激活，这意味着钙释放到胞浆并激活，通过c-AMP是一种涉及P56、蛋白激酶c（PKC）、大鼠肉瘤（RAS）、小鼠白血病病毒癌基因同源物（RAF）-1、有丝分裂原活化蛋白激酶（MEK）和核糖体S6蛋白激酶2（RSK2）等的途径。这些途径激活的产物磷酸化CREB，CREB与CREB结合并以复合物形式进入细胞核。在细胞核中，它与CRE结合，诱导转录反应，从而抑制c-jun、c-fos、Fra-2和fos B，进而抑制凋亡和促进T细胞增殖[36,37]. 这种机制被认为支持CREB在调节细胞免疫中的作用[37]但这在急性细胞性心脏移植排斥反应领域尚未得到探索。

由于我们研究中使用的样本材料和样本大小的限制，这些假定的计算结果无法验证。为了验证我们的发现，有必要通过合作收集必要事件而生成更多数据[38]. 这项初步研究还有其他局限性，包括其回顾性；使用EMB对急性细胞排斥进行分类，这是一种在诊断上具有显著差异的程序[39,40]; 使用聚焦的非全基因组阵列；富含白细胞生理和免疫反应相关基因；该方法仅限于使用TF信息分析表达数据（忽略文献和其他来源的已知通路信息）以及TF优先级评分的启发式性质。然而，我们的发现令人鼓舞；它们突显出我们越来越有能力利用人类细胞中全基因组细胞网络逆向工程来识别关键基因组程序的分子靶点，并指导生物标记物和分子靶点的发现。

在总结基因组学和计算生物学为关键调控中心和模块的逆向工程提供了强大的工具，这些调控中心和组件是表型特异性调控因子的候选对象。这些可以进一步作为设计新的移植排斥分子药物干预措施的潜在靶点。对于在移植领域中重要的分子的鉴定，我们的研究是首次涉及到越来越多地应用于分子生物学领域的技术的使用。

利益冲突

提交人确认，不存在利益冲突。

支持信息

表S1

微阵列中的转录因子列表（按字母顺序排序）

表S2转录因子的优先级得分。我最大值= 1000,k个最大值= 500,w个1= 0.6,w个2=0.3和w个三=0.1。

单击此处查看。（329K，文档）

参考文献

1Stewart S、Winters GL、Fishbein MC等，1990年心脏排斥诊断术语标准化工作公式的修订。心肺移植杂志。2005;24:1710–20.[公共医学][谷歌学者]
2Hale DA。基本移植免疫学。北美外科诊所。2006;86:1103–25.[公共医学][谷歌学者]
三。Kirklin JK、Young JB、McGiffin D。心脏移植。纽约：丘吉尔·利文斯通；2002[谷歌学者]
4Rodriguez ER。心脏移植活检标本的病理学：回顾1990年ISHLT工作公式。心肺移植杂志。2003;22:3–15.[公共医学][谷歌学者]
5Patel JK，日本小桥川。心脏移植排斥反应的免疫抑制、诊断和治疗。塞明胸心血管外科。2004;16:378–85.[公共医学][谷歌学者]
6Downward J.癌症生物学：特征指导药物选择。自然。2006;439:274–5.[公共医学][谷歌学者]
7Mani KM、Lefebvre C、Wang K等。预测B细胞淋巴瘤中致癌基因和分子扰动靶点的系统生物学方法。分子系统生物学。200810.1038/msb.2008.2。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Schena M、Shalon D、Davis RW等。用互补DNA微阵列定量监测基因表达模式。科学。1995;270:467–70.[公共医学][谷歌学者]
9Deng MC，Eisen HJ，Mehra MR，等。利用基因表达谱对心脏移植受者排斥反应的无创识别。《美国移植杂志》。2006;6:150–60.[公共医学][谷歌学者]
10Simon R.微阵列数据和基因表达谱特征评估的挑战。癌症投资。2008;26:327–32.[公共医学][谷歌学者]
11Allison DB、Cui X、Page GP等。微阵列数据分析：从混乱到整合和共识。Nat Rev基因。2006;7:55–65.[公共医学][谷歌学者]
12Ioanidis JP、Allison DB、Ball CA等。已发表微阵列基因表达分析的重复性。自然遗传学。2009;41:149–55.[公共医学][谷歌学者]
13Mootha VK、Lindgren CM、Eriksson KF等。参与氧化磷酸化的PGC-1alpha应答基因在人类糖尿病中协调下调。自然遗传学。2003;34:267–73.[公共医学][谷歌学者]
14Bertalanffy Lv，宾夕法尼亚州拉维奥莱特。人的系统观。科罗拉多州博尔德：威斯特维尤出版社；1981[谷歌学者]
15Oltvai ZN，Barabasi AL.系统生物学。生活的复杂性金字塔。科学。2002;298：763-4。[公共医学][谷歌学者]
16Ideker T，Galitski T，Hood L.解读生命的新方法：系统生物学。《基因组学与人类遗传学年鉴》。2001;2:343–72.[公共医学][谷歌学者]
17系统生物学：集成技术、生物学和计算。机械老化发展。2003;124:9–16.[公共医学][谷歌学者]
18Hood L，Perlmutter RM。系统方法对药物发现中生物问题的影响。国家生物技术。2004;22:1215–7.[公共医学][谷歌学者]
19Basso K，Margolin AA，Stolovitzky G等。人类B细胞调控网络的逆向工程。自然遗传学。2005;37:382–90.[公共医学][谷歌学者]
20Margolin AA、Nemenman I、Basso K等。ARACNE：哺乳动物细胞环境中基因调控网络重建的算法。BMC生物信息学。2006;7：S7。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Billingham ME、Cary NR、Hammond ME等。心脏和肺排斥诊断中术语标准化的工作公式：心脏排斥研究小组。国际心脏移植学会。心脏移植杂志。1990年；9:587–93.[公共医学][谷歌学者]
22Edgar R，Domracev M，Lash AE。基因表达总览：NCBI基因表达和杂交阵列数据存储库。核酸研究。2002;30:207–10. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Tusher VG，Tibshirani R，Chu G.应用于电离辐射反应的微阵列显著性分析。美国国家科学院程序。2001;98:5116–21. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Palomero T、Lim WK、Odom DT等。NOTCH1直接调节c-MYC并激活前馈转录网络，促进白血病细胞生长。美国国家科学院程序。2006;103:18261–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Han TS、Kobayashi K。信息和编码的数学。普罗维登斯，RI：美国数学学会；2002[谷歌学者]
26Shannon P、Markiel A、Ozier O等。细胞景观：生物分子相互作用网络集成模型的软件环境。基因组研究。2003;13:2498–504. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Jeong H、Mason SP、Barabasi AL等。蛋白质网络中的致死性和中心性。自然。2001;411:41–2.[公共医学][谷歌学者]
28Albert R，Jeong H，Barabasi AL.复杂网络的容错与攻击。自然。2000;406:378–82.[公共医学][谷歌学者]
29创建基因本体资源：设计与实现。基因组研究。2001;11:1425–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Zhang X，Odom DT，Koo SH，等。人类组织中cAMP反应元件结合蛋白占有率、磷酸化和靶基因激活的全基因组分析。美国国家科学院程序。2005;102:4459–64. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Weinmann AS。基于ChIP的新策略，用于发现免疫系统中的转录因子靶基因。Nat Rev免疫学。2004;4:381–6.[公共医学][谷歌学者]
32薛HH，Bollenbacher-Reilley J，Wu Z，等。转录因子GABP是B淋巴细胞发育的关键调节因子。免疫。2007;26:421–31.[公共医学][谷歌学者]
33Goodnow CC。自我耐受和自身免疫性疾病治疗的途径。柳叶刀。2001;357：2115–21。[公共医学][谷歌学者]
34Benczik M，Gaffen SL.白细胞介素（IL）-2家族细胞因子：T淋巴细胞的存活和增殖信号通路。免疫学研究。2004;33:109–42.[公共医学][谷歌学者]
35Refojo D、Liberman AC、Giacomini D等。在分子水平上整合系统信息：不同靶细胞上类固醇受体和细胞因子信号之间的相互作用。Ann NY科学院。2003;992:196–204.[公共医学][谷歌学者]
36Mayr B，Montmini M.磷酸化依赖因子CREB的转录调控。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2:599–609.[公共医学][谷歌学者]
37Kuo CT，Leiden JM。T淋巴细胞发育和功能的转录调控。免疫学年度回顾。1999;17:149–87.[公共医学][谷歌学者]
38Bansal M，Belcastro V，Ambesi-Impiombato A，di Bernardo D。如何从表达谱推断基因网络。分子系统生物学。2007;三:78. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Marboe CC、Billingham M、Eisen H等。在心脏移植受者中，结节性心内膜浸润（Quilty病变）导致ISHLT 2级和3A级排斥反应的诊断存在显著差异。心肺移植杂志。2005;24：S219–26。[公共医学][谷歌学者]
40Crespo-Leiro MG、Schulz U、Vanhaecke J等。心脏活检解释中的观察者间变异仍然是一个挑战：心脏同种异体移植排斥基因表达观察（CARGO）II研究的结果。心肺移植杂志。2009;28：S230。 [谷歌学者]
文章来自细胞和分子医学杂志由以下人员提供布莱克威尔出版社