用于神经活动成像的超敏荧光蛋白

GCaMP蛋白质工程

GCaMP公司¹⁷及其后代^11,16由循环置换绿色荧光蛋白（cpGFP）组成²⁵钙结合蛋白钙调蛋白（CaM）和CaM相互作用的M13肽²⁶(图1a). CaM/M13复合物靠近cpGFPβ桶内的发色团²⁷CaM/M13中钙依赖的构象变化，包括溶剂进入和pK的调节_一生色团的结合导致亮度增加。尽管进行了广泛的结构导向优化^11,16GCaMP和其他蛋白质传感器仍然存在灵敏度低和动力学慢的问题。

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图1

分离神经元的GCaMP突变和筛选

a、，GCaMP结构^27,64以及与GCaMP5G相关的不同GCaMP变体的突变。

b、，GCaMP3、5G、6f、6m、6s和OGB1-AM在多个神经元和微孔中的平均响应。顶部，荧光变化响应1个动作电位。底部，10个动作电位。

c、，筛选结果，447个GCaMP。顶部，响应1个动作电位的荧光变化（垂直条，ΔF/F₀; 绿色条，OGB1-AM，左侧；黑条，单个GCaMP突变；红条，组合突变；蓝色，GCaMP6指标）和不同动作电位刺激的显著性值（彩色图）。10个动作电位后的中、半衰减时间。底部，静止荧光，F₀归一化为核樱桃荧光。红线，GCaMP3级别；绿线，GCaMP5G级；蓝线，OGB1-AM级。

d-g，GCaMP传感器和OGB1-AM（蓝色）作为刺激强度函数的比较（颜色如b所示）。日期：，响应幅度；e、，信噪比；f、，半衰变时间；g、 峰值时间（刺激抵消后）。误差条对应于s.e.m（对于GCaMP3、GCaMP5G、OGB1-AM、6f、6m、6s，n分别为300、16、8、11、13、11口井）。

我们产生了许多额外的GCaMP变体，并在自动神经元分析中对其进行了测试(图1). 为了提高灵敏度，我们将突变集中在cpGFP和CaM之间16个氨基酸位置的界面上，一些突变接近完成(图1a,补充表5)¹⁶在另外18个位点发生突变，特别是在M13/CaM界面，这可能影响钙亲和力²⁸（A317）和CaM（R392）¹⁶(图1a).

24孔板中分离的大鼠海马神经元被转导GCaMP变体（每个孔一个），以及细胞核mCherry²⁹使用慢病毒介导的基因转移。电极触发每个孔内所有神经元的动作电位序列（方法）。采集了包含10-100个神经元的～800μm视野的时程图像（35 Hz），同时提供了一系列动作电位序列(图1c). 从单个神经元提取的荧光变化用于比较单个GCaMP变体和OGB1-AM的灵敏度、动态范围和动力学(图1d). 我们通过测量相对于红樱桃荧光的绿色荧光来监测传感器的静息亮度。

与GCaMP3（ΔF/F₀响应于一个动作电位；p<0.01；Wilcoxon秩和检验）(图1c;补充图1). 此外，与亲本GCaMP变体相比，M13/CaM界面（A317E）的一个突变加快了动力学（4倍），但也降低了响应幅度（2倍）(补充图2). 在第二轮诱变中，我们根据改进的反应幅度（1-3个动作电位）和/或动力学选择有利突变，而不损害基线荧光或最大反应（160个动作电位，94个变体，最多8个有利点突变；图1a，c,补充表5). 在某些情况下，有益效果是相加的(补充图2). 与主传感器相比，A317E持续加速动力学。我们总共筛选了447个GCaMP变异体(补充表5).

基于培养神经元的筛选(图1)，我们选择了三种超灵敏GCaMP6传感器（分别用于慢、中、快动力学）进行表征体内这些传感器的动力学不同，灵敏度较高的传感器动力学较慢。与GCaMP5G相比，GCaMP6传感器的基线亮度相似，动态范围增加了1.1-1.6倍（160动作电位下的ΔF/F0）。对于少量动作电位，最灵敏的传感器GCaMP6产生的信号是GCaMP3的7倍（大于GCaMP5的10倍），图1b-e;补充表1). 这种灵敏度增加的基础是多个因素(补充表2). 与GCaMP5G相比，GCaMP6s对钙的表观亲和力高3倍，饱和荧光高1.3倍，具有相似的基线荧光。钙饱和的GCaMP6s比增强型GFP（EGFP）亮27%，EGFP是其亲本荧光蛋白。最快的传感器GCaMP6f的上升时间比GCaMP5G快2倍，衰减时间快1.7倍(图1f，g) (补充表1). GCaMP6f是神经元胞浆游离钙的最快基因编码钙指示剂，其敏感性与OGB1-AM相当(图1d-g). GCaMP6指标在突触前神经丛中比其他GCaMP变体更敏感和/或更快果蝇属幼虫神经肌肉接头²⁴(补充图3；补充表4)，在果蝇属气味呈现期间的成人触角叶¹⁶(补充图4)斑马鱼顶盖的神经膜和体细胞体内¹⁶(补充图5).

小鼠视觉皮层的成像神经元群

接下来，我们测试了小鼠视觉皮层V1层（L）2/3锥体神经元的GCaMP6体内(图2a). 大多数V1神经元可以被驱动到火动作电位以响应漂移光栅³⁰.V1感染了表达GCaMP变异体的腺相关病毒（AAV）-hsyn1（hsyn1）-GCaMP变体）¹¹AAV感染三周后，绝大多数L2/3神经元主要在胞浆中显示荧光(补充图6). 感觉刺激由向对侧眼睛八个方向移动的光栅组成^12,16.双光子成像显示神经元亚群中视觉刺激诱发的荧光瞬变(图2a-c). 这些反应在整个试验中都是稳定的(补充图8)并调整到刺激方向(图2a、b和补充图9). GCaMP5G、GCaMP6f、GCaMP6m和散装OGB1-AM的定向调谐类似⁵(补充图9). 与其他传感器相比，GCaMP6f的荧光瞬态更快，并且能够忠实地跟踪动态感官刺激(图2d).

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图2

GCaMP6在小鼠视觉皮层的表现

a、，上图，实验示意图。底部，显示神经元根据GCaMP5G（左）和GCaMP6s（右）的首选方向（色调）和响应幅度（亮度）进行彩色编码的视野。

b、，表达GCaMP6的三个神经元的痕迹示例。叠加单次扫描（灰色）和5次扫描（黑色）的平均值。光栅运动方向（8个方向）如轨迹（箭头）所示。

c、，表达GCaMP6f的三个神经元的痕迹示例。叠加单个扫描（灰色）和5个扫描（青色）的平均值。

日期：，顶部，荧光变化的高倍视图对应于b（黑色）和c（青色）中的红色方框，归一化为响应峰值。底部，用GCaMP5G、OGB1-AM、6f、6s转导的1 Hz漂移光栅驱动的神经元的傅里叶谱归一化为0 Hz的响应幅度。

e、，当加载不同的钙指示剂时，被评分为对视觉刺激有反应的细胞部分。误差条对应于s.e.m.（GCaMP3、5G、OGB1-AM、6f、6m、6s的n=70、39、23、38、21、34 FOV）。GCaMP3、5G和OGB1-AM数据来自参考¹⁶.

f、，荧光在细胞中的分布在优选方向上发生变化。

GCaMP6的性能通过多种方式与其他传感器进行了比较。GCaMP6s检测到的反应神经元的比例是GCaMP5G的3倍（比GCaMP3高5倍）(图2e). 值得注意的是，GCaMP6s和GCaMP6m检测到的活动神经元的分数也显著高于OGB1-AM(图2e、f，p<0.01，Wilcoxon秩和检验）。因此，GCaMP6传感器揭示了以前蛋白质传感器无法检测到的神经元动力学。

我们通过慢性成像窗口对表达GCaMP6s的神经元成像^6,31在V1中持续数周(补充图6c)¹⁸神经元的感觉反应和方向调节基本稳定(补充图6c，e). 随着时间的推移，一小部分神经元的反应消失了，这与其他开始反应的神经元相平衡。在所有成像过程中反应的神经元（～56%的第一次反应的细胞）的取向偏好非常稳定(补充图6d). 经过数月的表达，一小部分高表达神经元获得了核荧光；这些神经元最终也产生了异常反应¹¹(补充图7). 这些实验表明，GCaMP6s在1-2个月内的表达不会明显干扰皮层回路的功能。

我们使用松散密封的细胞贴附记录直接比较了细胞荧光变化和峰值。视觉刺激的对比度在线调整，以保持适度的峰值频率。GCaMP6s即使在响应单动作电位时也会产生较大的荧光瞬变（大于GCaMP5K的6倍，图3和补充视频1)，对单个棘波的检测率很高（99±0.2%；假阳性率为1%时，n=9个细胞，250个棘波）。GCaMP6f和GCaMP6m的尖峰检测效率稍低，但动力学更快(图3,补充表3). 突发中的单个峰值导致荧光逐步增强(图3b)，如果它们按传感器上升时间的顺序被间隔隔开（100-150 ms，GCaMP6s；75-100 ms，GCa MP6m；50-75 ms，GCa-MP6f；图3f,补充图10，补充表3). 这些数据表明，GCaMP6可以检测到锥体细胞中接近100%的动作电位。

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图3

视觉皮层的联合成像和电生理学

a、，表达GCaMP6s（顶部）和GCaMP5f（底部）的神经元中的同步荧光动力学和峰值。每个脉冲的峰值数量显示在轨迹下方（单个峰值用星号表示）。左插图中，用记录移液管图示了一个表达GCaMP6的神经元。

b、，放大动作电位的爆发。顶部，GCaMP6；底部，GCaMP6f。

c、，一个动作电位引起的荧光变化。顶部，GCaMP6；底部，GCaMP6f。

日期：，不同钙指示剂对一个动作电位的响应中位荧光变化。阴影对应于s.e.m.，n=9（GCaMP5K，参考数据¹⁶)、11（GCaMP6f）、10（GCaMPa 6m）、9（GCaMP 6s）细胞。GCaMP5K和GCaMP5AG具有类似的属性¹⁶.

e、，峰值荧光变化是250ms仓中动作电位数量的函数（5K:n=161、65、22、4个事件，用于1、2、3、4个动作电位；6f:n=366、120、50、15、7个事件，用于1、2、3、4、5个动作电位；6m:n=354、105、31、11、7个事件，用于1、2、3、4、5个动作电位；6s：n=250，60，20，5，4个事件，1，2，3，4，5动作电位）。误差条对应于s.e.m。

f、，GCaMP指标比较。左，以1%假阳性率检测到的孤立峰值的分数。中等衰减时间。对，将时间增加到峰值。误差条对应于s.e.m。

树突棘中的钙瞬变

锥体神经元的输出是由分布在树突轴上的数千个兴奋性突触形成的。单个兴奋性突触的激活通过NMDA-Rs介导导致单个树突状棘中的钙蓄积^32,33，可以成像以测量单个突触的调谐体内^10,33。我们使用GCaMP6对慢性时间尺度下树突棘内的突触钙信号进行成像。在带有稀疏标记L2/3锥体神经元的V1中（方法），在视觉刺激过程中高倍放大成像小树突状分支(图4a). 我们首先关注的是那些没有激发视觉诱发动作电位（约40%的神经元）的神经元，以避免动作电位反向传播到树突引起的钙变化⁷单个棘显示出大的荧光瞬变，通常独立于它们的亲本树突(图4b、d和补充视频2). 脊柱反应是方向调谐的(图4b-e)正如预期的那样，V1神经元的大多数输入源于（可能是方向调谐的）V1神经元³⁴。相邻的脊椎通常以不同的首选方向进行调谐。方向调谐与脊椎间距之间的相关性较弱（R=0.08；p>0.05）。总的来说，27%的脊椎（62/228，15个树突，4只小鼠）具有视觉反应，并且大多数是方向调节的(图4f，g). 此外，近40%的脊椎在成像过程中的某个时间处于活动状态(图4f). 在40次成像试验（320秒连续成像，图4h).

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图4

视皮层树突状棘的成像活性

a、，表达GCaMP6的L2/3树突状分支的图像。感兴趣区域（ROI）以虚线圆圈表示（红色，棘状；黄色，树枝状）。

b、，荧光变化图（ΔF=F_响应-F类_基线)响应8个不同方向的漂移光栅。

c、，基于像素的方向偏好地图。

日期：，树枝状棘（s1-s3）和相邻树枝状轴（d1-d3）对不同方向漂移光栅的响应（对应于一).

e、，单个脊椎的方向调整（s1、s2、s3）。误差条对应于s.e.m（n=5次试验）。

f、，显示可检测到的钙瞬变（活性）和对视觉刺激（反应性）有反应的脊椎部分（定义见方法）（228个脊椎；15个树突；4只小鼠）。

克，方向选择性指数在视觉反应性脊椎（62个脊椎）上的分布。

小时，连续成像320秒以上单个树突棘的基线荧光（228个棘；15个树突；4只小鼠；误差条反映了跨越棘的s.e.m.）。

我，左边，同样的GCaMP6标记的脊柱在数周内成像。右图，定向漂移光栅的荧光响应。插图，成像脊椎的父体。

j、，随着时间的推移测量的单个棘的定向选择性（与我).

k、，在间隔一周的两次成像过程中，脊椎的首选方向为顶部。在本分析中，相反的刺激方向被认为是等效的。底部是ΔOri的分布（两个会话之间首选方向的差异）。

我们在间隔数周的成像过程中对相同的树突状节段进行成像。大多数脊椎在这个时间尺度上持续存在，尽管其他脊椎出现并消失³¹我们分析了持续性脊椎的视觉反应。对视觉刺激作出反应的脊椎的百分比在一周内保持稳定（第1天为37/139；第8天为34/139）。在一次成像过程中有反应的脊柱也可能在一周后有反应（65%）。此外，视觉反应性脊椎大多保持其方向调谐(图4i-k).

定向调节神经元如何与其他定向调节神经元连接仍然存在争议^10,35一些测量表明，单个神经元从具有不同方向调节的神经元采集异质输入¹⁰。模型表明方向调整不需要特定的连接³⁶然而，其他测量结果强调，神经元更喜欢与具有相似方向调谐的神经元形成突触³⁵，但在阈下膜电位水平上的取向调谐较弱^37,38因此，我们比较了单个棘细胞群体的方向调节及其父代神经元的输出。我们发现神经元具有调谐输出（OSI，0.91±0.04，n=5）(图5a)并测量每个神经元大量树突棘的方向调谐（平均201个棘；范围120-298个棘）(图5b-d). 使用计算减法程序去除反向传播动作电位对信号的贡献（方法；补充图11). 对于单个神经元，所有脊髓的平均方向调谐偏向于父神经元的方向调谐(图5e，f)尽管脊椎的调制深度较小（p<0.01，Wilcoxon秩和检验）。在脊椎的择优取向分布中也有类似的趋势(图5g，h). 我们的结果表明，脊椎荧光瞬变不一定能很好地预测兴奋性突触输入的强度³⁹平均值预测细胞输出的方向调谐。

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图5

树突棘种群的取向偏好预测其亲本神经元的取向偏好

a、，表达GCaMP6s的2/3层锥体神经元（深度，120μm）对定向漂移光栅（顶部）的体细胞荧光反应以及相应的调谐曲线（底部，归一化）。

b、，树突乔木的重建（红色树突，树突以d表示；虚线方框，其他图像区域）。

c、，顶部，视觉反应性脊椎的荧光反应（84/298）按其首选方向排序（5次试验的平均值）。每行显示一条归一化为其峰值的脊椎。底部，总计ΔF/F₀跨越所有脊椎（无标准化）。

日期：，成像树突子集上定向选择棘的位置（对应于b中的红色树突）。圆圈的大小对应于平均ΔF/F₀在首选刺激下，颜色表示首选方向，颜色的饱和度编码方向选择性指数（OSI=1，饱和颜色；OSI=0，白色）。

e、，顶部，躯体ΔF/F的调谐曲线。底部，脊椎ΔF/F的总和。细胞1对应于面板a-d。

f、，5个神经元（与e（电子）). 转向曲线与输出响应的首选方向对齐（0度）。将平均值归一化。

克，树突棘择优取向的分布（5个细胞；取样的棘数：298166137278116）。

小时，视觉反应性脊髓倾向于与突触后细胞的首选方向成0、45或90度角。在本分析中，相反的刺激方向被认为是等效的。误差条对应于s.e.m。

神经培养屏

GCaMP变异体是在改良的基于SIV的慢病毒构建物pGP中制造的-同步-GCaMP-nls-mCherry-WPRE，源自pCL20cSLFR MSCV-GFP⁵¹前体病毒载体包括一个476 bp的人类突触蛋白启动子GCaMP，一个与mCherry融合的核定位序列，以及土拨鼠肝炎转录后调控元件。通过PCR进行定点突变，并通过基因组装将突变区域并入慢病毒构建物⁵².

在木瓜蛋白酶中解剖并分离海马。将细胞以225000个活细胞/孔的密度放置在24孔玻璃底板（Mattek，#1.5玻璃盖玻片）中，预先涂上Matrigel（BD Biosciences）。细胞在生长培养基中培养（28 mM葡萄糖、2.4 mM碳酸氢钠、100μg/mL转铁蛋白、B-27补充剂（1X，Invitrogen）、500μM L-谷氨酰胺、50单位/mL青霉素、50 mg/mL链霉素、5%胎牛血清MEM）。

慢病毒颗粒是在生物安全2级实验室中通过转染前体病毒构建物、包装和外壳假分型DNA构建物（pCAG-SIVgprre、pCAG4-RTR-SIV、pCMV-VSV-G）制成的^51,53将HEK293T/17细胞（ATCC）放入10厘米的平板中。72小时后，收集上清液（6 mL）并过滤。神经培养物在第3天感染体外。将24孔板的每个孔与0.5 mL慢病毒在条件生长培养基中培养过夜。生长培养基中添加4μM AraC以抑制胶质细胞增殖。在一些实验中，将OGB1-AM加载到细胞中，方法是在1 mL 2μM OGB1-AM（Invitrogen）中培养神经元30分钟，并用成像缓冲液（145 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES pH 7.4、2 mM CaCl）冲洗3次₂，1 mM氯化镁₂).

在含有药物混合物的成像缓冲液中刺激神经元以抑制突触受体（10μM CNQX、10μM（R）-CPP、10μM加巴静、1 mM（S）-MCPG、Tocris）。在这些条件下，细胞内钙的增加可能是由电压敏感性钙通道的开放引起的。

使用Grass Technologies S48刺激装置和定制的24孔帽刺激器（带平行铂丝）通过野外刺激诱发动作电位（83 Hz）。该显微镜为Olympus IX81，带有10×（0.4 NA）空气物镜和EMCCD相机（Andor 897，512×512像素，35帧/秒），凯恩OptoLED照明系统，以及GFP（激发：450-490 nm；双色：495 nm长通；发射：500-550 nm）和TxRed（激发：540-580 nm；双色光：585 nm长通过；发射：593-668 nm）过滤器组。视野为800μm×800μm。图像被减去背景（5%最低像素值的平均值）。荧光变化除以刺激前1秒测得的基线荧光，从而量化每个细胞的反应。信噪比（SNR）量化为峰值ΔF/F₀刺激前一秒钟内信号标准偏差的响应。

控制实验改变刺激电压、频率和脉冲宽度，确保对神经元进行阈上刺激。使用基于ArchWT-GFP古菌毒蛋白酶的电压传感器进行电压成像⁵⁴确认单个脉冲（1 ms，40 V，83 Hz）可靠触发单个AP。成像和刺激系统由MetaMorph软件（版本7.7.5，Molecular Devices）和Ephus软件中编写的自定义脚本控制⁵⁵（ephus.org）。详细的神经元培养筛选方法将在其他地方介绍（T.J.W.、T.W.C.、E.R.S.、R.A.K.、V.J.、L.L.L.、K.S.和D.S.K.，手稿正在编写中）。

标记V1神经元

用于生产包括pGP-AAV在内的AAV的结构-同步-GCaMP-WPRE和Cre重组酶激活的构建物pGP-AAV-同步-flex-GCaMP-WPRE。将病毒缓慢（5分钟内30 nL）注射到250μm深度的初级视觉皮层（两个部位，距离lambda缝合线2.5和2.9 mm）。用于人口成像和电生理(图2-​-3),三)，AAV2/1-同步-GCaMP-WPRE病毒（滴度：～10¹¹-10¹²基因组/mL）注射到C57BL/6J小鼠（1.5-2个月龄）的视皮层⁶用于树突成像(图4,​,55和第6a-f页)，通过注射稀释的AAV2/1混合物实现稀疏标记-同步-Cre颗粒（滴度：～10¹²基因组/mL，在PBS中稀释8000-20000倍）和高滴度依赖性GCaMP6s病毒（～8×10¹¹基因组/mL）。这会在一小部分神经元中产生强烈的GCaMP6表达（约3-5个细胞，体积为250μm×250μm x 250μm），由Cre表达定义⁵⁶.两个金字塔(图4-​-5)5)和GABAergic(图6)用这种方法标记神经元，但它们可以根据树突棘的存在与否进行区分。后hoc免疫标记进一步鉴定了成像细胞。用于小白蛋白中间神经元的特定标记(图6g和补充图12)向PV-IRES-Cre小鼠的视皮层注射Cre依赖的GCaMP6s AAV⁵⁷.个体躯体(补充图12)树突状片段可以被识别(图6 g，h成像树枝晶的总长度：2.86mm），但标记密度高，难以长距离追踪单个树枝晶。

窗户手术

表达2-4周后，使用异氟醚（3%用于诱导，1.5-2%用于手术）对小鼠进行麻醉，并在V1上方（中心距lambda缝合线2.7 mm外侧）进行环形开颅术（直径2-3 mm）。在急性实验中，开颅手术用琼脂糖覆盖（1-1.3%），并将圆形玻璃盖玻片（华纳仪器；直径5mm；厚度#1）粘在颅骨上，以减少暴露的大脑的运动。使用黑色牙科水泥（Contemporary Ortho Jet）将定制的钛合金头柱固定在头骨上。对于同步成像和细胞贴附记录，暴露的大脑覆盖了约1 mm厚的琼脂糖（1.3%），没有盖玻片。对于慢性成像实验，成像窗口由两层显微镜盖玻片构成⁶一块较大的（Fisher，1号厚度）固定在骨头上，一块较小的嵌件（2号厚度）紧贴在开颅手术中。在慢性窗植入术后约1-2周开始成像实验。

视觉刺激

使用心理物理工具箱生成移动光栅刺激^58,59在MATLAB中。每个刺激试验包括4s空白期（平均亮度下的均匀灰度），然后是4s漂移正弦光栅（0.05周期/度，1 Hz时间频率）。通常，使用8个漂移方向（间隔45度），每个方向记录5个试验，每个记录会话总共有40个刺激试验（320秒记录时间）。光栅上有一个液晶显示器（30×40 cm），位于鼠标右眼中心前25 cm处。监视器在水平方向上与鼠标的眼睛成±38°角，在垂直方向上与眼睛成-20°至+38°角。用于细胞连接记录的实验(图3)，移液管需要使用一个较小的LCD监视器（12×16 cm），放置在右眼前方～10 cm处。在同步成像和电生理过程中，重复播放最佳光栅刺激（持续时间2s，间隔4s空白期），但在线调整刺激光栅的对比度，以保持适度的尖峰频率。

用于树突棘种群分析(图5)，刺激对比度降低，以减少动作电位相关的树突状信号（平均ΔF/F₀在枝晶轴中，择优取向分别为32%、80%。细胞1至5的16%、15%、12%，对应刺激对比度10-40%、5-20%、10-40%、20-40%、20-40%）。树突轴的取向偏好与体细胞相同，与反向传播动作电位一致（数据未显示）。GABA能树枝晶的取向调整(图6)使用完全对比度下的标准刺激集绘制。刺激持续时间为2s；因为钙瞬变的缓慢衰减⁴¹我们采用了6秒的试验间隔。

小鼠V1神经元和树突成像

将小鼠放在温暖的毯子上（37°C），用0.5%异氟醚麻醉，并用氯丙噻嗪（20-40μL，0.33 mg/ml，i.m.）镇静³⁰使用定制的双光子显微镜（可在research.janelia.org/Svoboda上获得设计）进行成像，该显微镜配备由ScanImage（ScanImage.org）控制的共振振镜扫描模块（Thorlabs）⁶⁰光源为运行于940 nm的Mai Tai飞秒脉冲激光器（光谱物理）。目标是一个16×浸水透镜（尼康，0.8 NA，3 mm工作距离）。全场成像所用功率为35-50 mW(图2)和20-40毫瓦，实现更高的变焦成像(图3-​-66).

图像采集频率为15 Hz（512×512像素，250μm×250μm；图2)或60 Hz（256×256像素，30μm×30μm；图3)，或15 Hz（512×512像素，30μm×30μm；图4-​-5),5)，或15 Hz（512×512像素，30μm×30μm-100μm×100μm；图6). 用于树突成像实验(图4-​-6),6)，选择视野，使延伸的树突状节段位于一个焦平面上。在每个成像会话结束时，采集记录细胞的z堆叠（1μm步长）。记录成像树突相对于母体的坐标。树突的方向、曲率和分支模式以及脊椎星座有助于在长期成像实验中准确识别相同的视野。

电生理学

体内使用玻璃移液管（～5-7MΩ）进行细胞附着记录，玻璃移液管填充含有以下物质的溶液（单位：mM）：125 NaCl、5 KCl、10葡萄糖、10 HEPES、2 CaCl₂，2 MgSO₄和0.1 Alexa Fluor 594；pH值7.4）。使用AxoPatch 200B放大器（分子器件）放大信号，在5 kHz下过滤，在10 kHz下数字化。使用电流钳模式记录峰值。ScanImage 4.0的帧触发脉冲也被记录下来，并离线用于将各个帧与电生理记录同步。在建立低电阻密封（15-50 MΩ）后，使用记录的尖峰信号快速优化单个神经元的刺激方向、空间和时间频率。在降低对比度的情况下重复最佳光栅刺激，以保持适度的峰值速率。

图像分析

使用ImageJ中的TurboReg插件校正成像平面中的机械漂移⁶¹所有剩余分析均在MATLAB中进行。使用半自动化算法选择与可视可识别细胞体相对应的感兴趣区域（ROI）(补充图14). 对于GCaMP，环状ROI位于细胞的胞质区域（不包括细胞核；GCaMP的表达通常局限于细胞质¹¹). 对于OGB1-AM，使用覆盖整个躯体的圆形ROI。对于长期GCaMP成像，手动检查多个疗程的基线荧光图像，分析中仅包括在所有成像疗程中可以清楚识别的细胞。通过平均ROI内的所有像素来测量每个细胞的荧光时间进程，并校正神经膜污染⁴¹。细胞体的荧光信号估计为F类_{单元格_真实}（t）=F类_{测量的单元格}（t） -r*F_神经纤维（t），r=0.7。神经膜信号F类_神经纤维（t）通过平均距离细胞中心20μm区域内所有像素的信号来测量每个细胞周围的信号（不包括所有选定的细胞）。细胞贴附记录证实，神经白细胞介素补偿的荧光变化反映了单个神经元的动作电位(补充图15). 为了确保稳健的神经膜减法，只包括比周围神经膜至少亮3%的细胞。神经膜校正不适用于树突成像实验，因为稀疏标记提供了可以忽略不计的低背景。ΔF/F₀计算为（F-F₀)/如果₀，其中F₀是视觉刺激开始前2秒钟内平均的基线荧光信号。每次试验的视觉反应测量为ΔF/F₀，在刺激期内平均。视觉反应神经元被定义为具有显著刺激相关荧光变化的细胞（空白和八个方向周期的方差分析，p<0.01）⁵平均ΔF/F₀优选取向大于6%。

计算视觉反应细胞的取向选择性指数（OSI）^16,30首先，首选方向（θ_首选)被确定为产生最强反应的刺激物。通过测量平均ΔF/F来构建定向调谐曲线₀，每个方向的刺激期平均值。然后，我们用以θ为中心的两个高斯数之和拟合调谐曲线_首选和θ_首选+π，宽度σ（限制在>15°），振幅A1和A2，以及恒定基线B。OSI定义为OSI=（R_首选-R（右）_正交的)/（右_首选+R（右）_正交的)，其中R_首选和R_正交的是首选（θ）处的响应振幅_首选)和正交方向（θ_首选+π/2）。

为了同时成像和细胞贴附记录，将环形ROI放置在细胞的细胞溶质区域。体细胞的荧光瞬变是由动作电位引起的，而阈下活性的贡献很小⁶²(补充图15). 量化检测单个AP的效率(图3)，我们确定了距离附近AP至少1秒的单个AP事件。荧光痕迹由前10帧（0.17 s）和后60帧（1 s）组成我^第个1个AP事件以70维向量进行组合，（f）_我.噪声轨迹段，n个_我取自无AP的时期。所有1条AP记录道的平均值用作模板向量，（f）_模板=Σ_我（f）_我/N个。在减去平均值后对向量进行标准化，以创建单位向量$\stackrel{<trans\; data-src="̂">̂</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="f">（f）</trans>}}$_模板.的投影（f）_我或n个_我沿着…的方向$\stackrel{<trans\; data-src="̂">̂</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="f">（f）</trans>}}$_模板计算以获得标量（f）_我或n个_我分别是。AP检测阈值定义为99^第个所有百分比n个_我值(即，1%假阳性），以及（f）_我高于检测阈值的值是AP检测效率。

对于脊椎图像(图4-​-5),5)，将圆形ROI放置在单个树突棘上，以测量棘荧光并计算ΔF/F_{0_脊椎}为了最大限度地减少反向传播动作电位（BAP）的污染，我们要么从“沉默细胞”（约40%的细胞）中记录，在对一组标准光栅刺激的反应中显示很少或没有AP(图4)或使用刺激对比度降低的刺激(图5).

使用减法去除侵犯成像脊柱的偶尔BAP相关钙信号，分三步实施(补充图11). 首先，为每个记录的树突段绘制一个覆盖整个母树突轴的区域（约30微米的树突长度；不包括所有棘），以估计BAP相关的全局树突信号ΔF/F_{0_陨石}由于树突轴的体积比调谐树突棘的体积大得多（100倍），焦平面上方和下方的棘预计对ΔF/F的信号贡献可以忽略不计_{0_陨石}。这是通过主成分分析进行验证的（未显示数据）。绘制ΔF/F_{0_松}相对于ΔF/F_{0_陨石}揭示了脊椎信号的两个成分，即BAP相关成分和脊椎特异成分。其次，通过减去树突轴信号的缩放版本ΔF/F，从脊柱信号中去除BAP相关成分_{特定于0轴}=ΔF/F_{0_松}-α·ΔF/F_{0_陨石}使用ΔF/F的稳健回归（MATLAB函数'robustfit.m'）确定_{0_松}对比ΔF/F_{0_陨石}（拟合线的斜率补充图11b). 第三，视觉反应性（ΔF/F₀>10%），并在去除BAP信号的情况下计算单个脊柱的OSI。活动脊椎(图4f)被定义为至少显示三种脊椎特异性的脊椎(即在5分钟的成像过程中，BAP无关）钙事件，事件定义为钙信号的一个插曲，该插曲至少连续三帧（～50 ms）跨越基线噪声的3 s.d。

接下来我们确认了BAP去除算法的有效性。首先，与V1兴奋性神经元相比，BAP去除的脊椎信号显示出明显的方向调谐（OSI=0.84±0.14，平均值±s.d.，n=190个脊椎）(补充图9，p>0.05，Wilcoxon秩和）。这甚至适用于与体细胞相比倾向于正交方向的脊椎（OSI=0.82±0.16，n=24个脊椎），表明BAP污染已被清除。其次，大多数（79.7%）视觉反应性脊柱在BAP减影后与树突状轴信号的试验-试验相关性很小。与试验打乱的对照组相比，20.3%的脊柱仍然显示出与轴反应的显著相关性（p<0.01）。这可能反映了同步激活的突触前细胞，或不完美的BAP动作电位信号减除。由于我们无法区分这些可能性，这些脊椎被排除在进一步分析之外。在两个单元格中（单元格4和单元格5；图5)，我们收集了大量试验（每个方向15个试验），这使得进一步排除具有可检测树突状反应（ΔF/F）的试验成为可能₀> 6%). 结果(即，脊柱反应总和的首选方向）与单独使用减法程序相同。

用于分析GABA能细胞(图6)，使用ImageJ中的“简单神经突示踪剂”追踪树突⁶³程序输出一个穿越树枝晶的一维坐标序列和一个覆盖追踪树枝晶的二维掩模，用于定义沿树枝晶的ROI（尺寸，树枝晶长度1.5μm；间距，1μm）。计算单个ROI的视觉反应性和方向选择性指数。如果树突区域对至少一个刺激方向的反应与其他方向显著不同，则认为该区域具有方向选择性（p<0.01，8种条件下的方差分析）。由于突触和BAP信号混合在同一树突状隔室中，因此没有尝试从BAP相关成分中分离突触信号。我们没有分析整合突触信号与GABA能细胞输出调谐之间的关系。

我们感谢J.Akerboom和L.Tian的建设和建议；J.Hasseman、M.Ramirez、G.Tsegaye，用于分子克隆；B.神经元培养屏蔽；A.Hu代表组织学；B.Fosque、R.Behnam、K.Ritola，用于病毒生产；J.Macklin和R.Patel，光谱学；B.Coop和L.Ramasamy，用于多阱电极制造；K.Smith用于小鼠病毒转导；K.Hibbard用于饲养苍蝇；J.Yu、C.Niell、M.Stryker、J.Trachtenberg和A.Kerlin为视觉皮层实验提供建议。