循环细胞和有丝分裂细胞动态染色质环境中应激的转录反应

HSF1和HSF2识别相似的共有DNA序列，但在人类基因组中显示不同的结合谱。

HSF2与应激靶基因的结合被认为是以HSF1依赖的方式发生的(16,17). 然而，我们确定了HSF1或HSF2的特异性靶基因(图1E类和如果;图S2A类;数据集S1). 在热处理的循环细胞中，HSF1和HSF2共享其大多数靶位点，但在最佳生长条件和有丝分裂中，它们对人类基因组的定位显示出显著不同(图S2A类). 尽管HSF1和HSF2具有不同的结合位点，但它们在循环细胞和有丝分裂细胞中识别出相似的HSE(图S2B类)证明仅DNA序列不足以确定HSF1与HSF2的结合位点。

鉴于启动子和外显子占人类基因组的<2%（人类基因组计划），HSF1和HSF2富含基因启动子和蛋白质编码序列(图S3A类). 例如，在热处理的循环细胞中，19%的HSF1和22%的HSF2目标基因座位于启动子内(图S3A类). 平均而言，HSF1和HSF2在启动子区的富集程度高于编码序列(图S3B)，但在内含子、外显子和基因间区域也发现了显著的HSF1和HSF2靶点，如图所示PRKCA公司和PRKCB公司（分别为蛋白激酶Cα和β），KCNN1号机组（钙激活通道N1）和热休克蛋白B1/热休克蛋白27(图S3C类).

HSF1和HSF2结合选定的伴侣基因启动子。

HSF1和HSF2因其对某些伴侣基因的应激相关调节功能而广为人知，例如热休克蛋白A1A/HSP70.1,热休克蛋白C/热休克蛋白90,热休克蛋白B1/热休克蛋白27、和DNAJB1号机组/热休克蛋白40(4,17,26,27). ChIP-seq能够对人类基因组中编码的每个伴侣基因进行HSF1和HSF2的无偏分析，并揭示HSF在70%热休克蛋白，90%伴侣蛋白和13%挪威船级社基因(表1;表S1). 大多数HSF靶向伴侣基因在含有暂停RNPII的启动子上同时与HSF1和HSF2结合(表1;表S1). 小HSP除外热休克蛋白B2/热休克蛋白27-2,热休克蛋白B5/CRYAB公司、和热休克蛋白B9其发起人缺乏暂停的RNPII(表1). 为了解决HSF1和HSF2对转录的影响，我们通过shRNA-介导的降解来耗尽HSF1或HSF2，或两者同时耗尽，并分析了一组HSF-靶向伴侣基因在热休克期间的mRNA表达(图2A类和B类;图S4A类). 在自由循环的细胞中，热休克蛋白1/热休克蛋白110,热休克蛋白2、和DNAJB6号机组被鉴定为独特的HSF调节基因，其热诱导表达严格依赖于HSF1(图2B类;图S4A类).CCT1（CCT1）（伴侣蛋白1）先前已被证明受HSF调节(44)我们在K562细胞中证实了这一点(图2B类). 在急性热应激期间，HSPH1/HSP110 mRNA的表达迅速增加至7倍，而DNAJB6和CCT1 mRNA的水平增加了一倍(图2B类). DNAJB6是抑制蛋白质聚集的最有效伴侣，HSPH1/HSP110重塑HSP70-HPS40机制，以溶解和重新折叠后生动物细胞中聚集的蛋白质(45,46). 这些结果表明，HSF诱导的伴侣的种类比先前预期的要广泛得多，并强调了在蛋白毒性条件下管理聚集蛋白的重要性。

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图2。

HSF定义了急性热应激诱导的伴侣和耳蜗的集合。(A类)扰乱转染（Scr）、HSF1-depleted（shHSF1）和HSF2-depletted（shHSF2）循环细胞在2小时热应激期间的HSF1和HSF2蛋白水平。如前所述，热应激导致HSF2水平下降(25). (B类)在存在或不存在HSF1或HSF2的热应激过程中，伴侣蛋白HSPH1、HSPH2、DNAJB6和伴侣蛋白CCT1的mRNA水平。(C类)循环细胞中与HSF1和HSF2结合的辅酶A基因。显示ChIP-seq检测到的输入上的折叠富集。(天)在有或无HSF1或HSF2的未处理和热处理循环细胞中，HSP90耳蜗蛋白AHA1、CDC37和p23的mRNA水平。在B类和天显示了至少三个生物复制品的SD。统计分析由双尾独立学生进行t吨测试和星号表示所示的乱序转染细胞和HSF缺失细胞之间的统计显著性*P（P）< 0.1; **P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.01.

热诱导共抑素表达需要HSF1。

如所示图2C类和数据集S1，HSF1和HSF2占据了许多共同基因，这些基因以前没有被证明受HSF控制。大多数耳蜗蛋白具有固有的伴侣活性，但由于它们决定HSP70和/或HSP90蛋白复合物的活性，因此被称为耳蜗酮(47,48). 总结如下图2C类HSF1和HSF2表现出强烈的结合包含暂停RNPII的cochaperone基因启动子的倾向。我们测定了HSP90耳蜗的mRNA水平AHSA1型（编码AHA1），CDC37型、和PTGES3型（编码p23）是否存在HSF1或HSF2(图2天). AHA1刺激ATP酶循环，是HSP90蛋白复合物的最有效激活剂(49)，显示出需要HSF1存在的三倍热诱导表达(图2天). CDC37和p23参与客户蛋白的招募和成熟，并抑制HSP90 ATP酶循环(48,50,51). 在2小时热休克期间，我们没有检测到CDC37 mRNA水平的任何显著变化，但发现p23 mRNA的HSF1依赖性增加了两倍(图2天). 奇怪的是，HSF1和HSF2结合了AHSA1型和PTGES3型，但不可约的第一个内含子CDC37型(图2C类). 我们的结论是，除了控制急性热应激诱导的伴侣蛋白集外，HSF还决定了耳蜗蛋白的表达模式，这对客户的识别和命运以及伴侣效应至关重要。

HSF1依赖性泛素表达可缓解应激产生的蛋白质清除需求。

在热应激时，受损和聚集的蛋白质积累，产生对蛋白质清除的增加需求。绝大多数注定要降解的蛋白质都以泛素为标志，泛素由人类的四个基因编码(52). 如ChIP-seq所示，HSF1和HSF2选择性地结合到多泛素基因的启动子上UBB公司和UBC公司但在单泛素基因上缺失RPS27A型和UBA52型(图3A类). 的转录UBB公司或UBC公司由于相应的mRNA分别编码三种和九种泛素蛋白的前体，因此泛素水平迅速增加(图3B类). 相比之下RPS27A型或UBA52型每产生一个泛素就会产生一个核糖体蛋白(图3B类). 在热处理的循环细胞中，UBB和UBC的mRNA水平分别迅速增加到2倍和4倍，而RPS27A和UBA52 mRNA水平保持不变(图3C类和天). HSF1的耗竭严重影响了循环细胞中热诱导泛素的表达(图3天)揭示了HSF1定位于多泛素基因的启动子是细胞在蛋白毒性应激下产生足够水平泛素mRNA所必需的。

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图3。

HSF1诱导循环细胞中的多泛素基因表达。(A类)HSF1和HSF2与多泛素结合(UBB公司和UBC公司)而不是泛素(RPS27A型,UBA52型)基因如ChIP-seq所示。(B类)人类基因组中四个泛素编码基因的示意图。(C类和天)热应激导致循环细胞中多泛素而非单泛素基因的表达增加，热诱导的泛素表达在HSF1-depleted细胞中被取消。mRNA水平和统计意义分析如下图2。

HSF1和HSF2驱动的转录编程延伸到编码转录和翻译调节因子、细胞周期决定因子和核心信号成分的基因。

为了研究急性应激中与HSF1和HSF2靶基因相关的生物过程，我们使用注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）进行了基因本体分析(53). 由于热休克导致快速转录反应，我们试图了解HSF是否被招募到应激前携带RNPII的基因组位点（wgEncodeEH000529；德克萨斯大学Iyer实验室），以及RNPII是否是与特定功能相关的HSF靶基因的特征。有趣的是，启动子上90%的HSF1或HSF2靶向位点被RNPII占据，在基因体上，大约一半的HSF1和HSF2目标位点含有RNPII(图4A类).

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图4。

HSF在应激期间控制广泛的细胞过程。(A类)热处理循环细胞中HSF1和HSF2靶基因的基因组区域和RNPII的存在与否的基因本体分析。启动子定义为TSS中的−1200到+300 bp，基因体是从+301 bp到基因末端的编码序列。HSF1特异性靶基因组用红色表示，HSF2特异性靶基因组用绿色表示，并且它们共享的靶基因组用蓝色表示。(下部)本地化到RNPII占用站点的HSF1或HSF2目标站点的分数。从ENCODE项目（wgEncodeEH000529；德克萨斯大学Iyer实验室）中回收未处理循环细胞中含有RNPII的位点。(B类)热休克期间HSF靶基因的mRNA水平。mRNA水平和统计意义分析如下图2。

在热休克循环细胞中，HSF1和HSF2共同占据伴侣和耳蜗的启动子、转录和翻译调节因子以及细胞周期进展的介质(图4A类;数据集S2). 在基因体上，HSF1占据了含有RNPII的基因座，这些基因座介导转录抑制、甲基化和抑制mRNA代谢。相比之下，HSF2定位于参与不同细胞过程激活的基因编码序列，特别是在缺乏RNPII的位点(图4A类;数据集S2). 在启动子靶向基因中，我们验证了转录调节因子的mRNA水平TAF7型（TATA-box相关因子7）和MLL公司，平移组件EEF1G公司（真核生物延伸因子1γ）和MRPS6型以及有丝分裂因子NUDC公司（核分布C同源物）和带1（阻碍自动积分因子1）。在编码序列中含有HSF的基因中CTCF公司（CCCTC-结合因子）和PRKCA公司进行了调查。为了应对热应激，TAF7的HSF1依赖性增加到3倍，EEF1G的HSF1增加到2倍，NUDC的HSF1则增加到1.5倍(图4B类). HSF2的缺失并没有阻碍任何研究基因的热诱导表达，但它破坏了MLL的表达动力学(图4B类). 此外，在最佳生长条件下，HSF2的缺失导致BANF1和PRKCA的mRNA水平增加了两倍以上(图4B类).

HSF1和HSF2的功能紧密相连，但它们对启动子的影响是显著不同的。

以前的酵母全基因组研究(69)，飞(70,71)、和人类(8,72)确定了HSF1的HSE，表明HSF1识别的DNA序列在进化过程中具有显著的保守性。我们的分析证实了在循环细胞和有丝分裂细胞中反向nGAAn五聚体对HSF1结合的重要性(图S2B类). 通过在全基因组范围内揭示HSF2靶向HSE，我们预计会发现HSF1和HSF2首选的DNA序列之间的主要差异。尽管它们在人类基因组中具有独特的靶点(图1B类,E类、和如果和​和5B类;5B类;图S2A类)HSF1和HSF2认识到一个惊人相似的HSE(图S2B类). 早期足迹研究表明，HSF2能够结合比HSF1短的HSE(19,37). HSF2结合较小范围HSE的能力在接触致密染色质区域中的HSE时具有优势。HSF1和HSF2在共享靶位点的重叠基因组坐标和高度相似的结合谱(图1C类和天和​和3A类;三A类;图S3C类;数据集S1)表明它们在转录调控中的密切相互作用。然而，我们的ChIP-seq分析的分辨率无法区分HSF1-HSF2异三聚体和相同或附近HSE的相邻五聚体上的同源三聚体。

由于蛋白质毒性应激的改善，癌细胞对HSF1表现出非癌基因依赖性(5,73). 此外，HSF1在非转化细胞中的结合模式与在高恶性潜能癌细胞中的完全不同(8). 由于K562细胞是一种红白血病细胞系，表达高水平的HSPs，HSF1也可能在这些细胞中含有癌特异性靶基因。然而，非应激K562细胞中HSF1靶点的低倍富集和数量有限(图1B类)与非转化细胞和低恶性潜能细胞中的HSF1结合谱一致(8).

对靶基因表达的详细分析表明，HSF1是一种对压力作出即时反应的强有力的反式激活因子(图1B类和​和22–4). HSF2也快速本地化到目标站点(图1B类)，但在热应激2h期间没有增强转录(图2–4). HSF1和HSF2的招募动力学与热休克蛋白70启动子，但热应激30分钟后HSF2从HSE中逐渐降解(25)，表明需要在启动子处对HSF1-HSF2组成进行精细调节。我们的初步结果表明，当HSF2水平已经下降时，HSF2介导的转录作用在持续应激期间发生(图S4如果)(25)并表明HSF2改变了转录反应的染色质景观。当细胞的表观遗传特征被确定时，HSF2也参与许多发育过程(10,12,61)，并已被证明会影响染色质的压实和完整性(10). 这些结果支持HSF2介导的转录环境的建立，并表明HSF1和HSF2在驱动基因表达的动态相互作用过程中有着深刻的不同机制。由HSF1和HSF2指导的细胞过程的多功能性强调了建立其特定激活物和抑制剂、PTM特征和染色质相关因子的重要性，这些因子将HSF导向其各自的靶位点。

更改IP。

使用之前描述的方案，通过ChIP分离HSF1和HSF2结合的DNA片段(11,17)以及以下经ChIP验证的抗体：HSF1（Spa-901；Enzo）和HSF2(17). IgG（sc-2027；Santa Cruz）用作阴性抗体，AcH4（06-866；Upstate）用作阳性抗体。PCR引物列于表S2。

高通量排序和数据分析。

对于测序，每个样品收集10个ChIP重复。使用新英格兰生物实验室NEBNext试剂盒生成测序文库，适配器和引物来自Bio Scientific AIR DNA条形码试剂盒。使用cBot和Truseq SR cluster试剂盒对cBot v进行模板扩增和聚类生成，并使用v5 Truseq SBS测序试剂盒使用Illumina Genome Analyzer IIx对36个核苷酸进行测序。经过质量调整和删除重复数据后，用Bowtie将读取数据映射到人类基因组（hg19）(79). 峰被称为MACS 1.4(80)，并将五倍于输入的最小折叠富集度设定为目标位置的截止标准。任何超过阴性IgG样本截止值的位点都被丢弃。

HSF1和HSF2靶向DNA序列和基因组区域的鉴定以及靶基因的功能注释。

通过大DNA数据集的模体分析（MEME-ChIP）鉴定HSF1和HSF2的一致性DNA序列(81)使用以顶点为中心的120-bp区域。使用RefSeq提供的外显子和内含子坐标，并通过定义一个核心启动子，将HSF1和HSF2靶位点注释到基因组区域，该启动子跨度从转录起始点（TSS）的−1200 bp到+300 bp。百分之五十的峰长集中在顶点上，位于外显子-外显子边界上的峰表示为外显子。用DAVID分析循环细胞和有丝分裂细胞中与HSF1或HSF2靶基因相关的生物过程(53)，使用Fisher精确测试计算P（P）丰富的基因本体术语的价值。用Integrative Genomics Viewer显示人类基因组上HSF1、HSF2和RNPII的密度信号(82).

shRNA通过RNAi耗尽HSF1和HSF2。

如前所述，使用连接到pSUPER载体（Oligoengine）的shRNA构建物从细胞中去除HSF1和HSF2(17). 载体编码的寡核苷酸对HSF1（GCT CAT TCA GTT CCT GAT C）或HSF2（CAG GCG AGT ACA ACA GCA T）具有特异性。使用一个加扰序列（GCG CGC TTT GTA GGA TTC G）作为对照。通过电穿孔（970µF，220 mV）将shRNA构建物转染到细胞中，并在收获前培养细胞72小时。转染恢复7小时后，启动细胞与有丝分裂的同步，以便同时制备循环细胞和有丝分裂细胞的样品。

定量实时RT-PCR。

使用RNeasy试剂盒（Qiagen）分离RNA，1μg总RNA经DNaseI处理（Promega）并用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶RNase H（-）（Promeca）逆转录。如前所述，制备并运行实时RT-PCR反应(17)使用ABI Prism 7900（应用生物系统公司）。引物购自Oligomer（赫尔辛基），探针购自Roche Applied Science。底漆和探针序列列于表S3.目标基因mRNA的相对数量标准化为GAPDH公司，并根据未处理细胞中各自的mRNA水平计算折叠诱导。对于来自至少三个生物复制品的样品，所有反应均一式三份。计算了SDs，并显示在图表中。一个独立的双尾学生t吨测试用于确定P（P）比较打乱转染细胞和shHSF1或shHSF2转染细胞之间的mRNA水平时的值。

西方印迹法。

用缓冲液C[25%（vol/vol）甘油、20 mM Hepes、pH 7.4、1.5 mM MgCl溶解细胞₂0.42 M NaCl、0.2 mM EDTA、0.5 mM PMSF和0.5 mM DTT]，并使用Bradford分析测量可溶性部分中的蛋白质浓度。将20微克总蛋白在Laemmli样品缓冲液中煮沸，然后进行SDS/PAGE，然后转移到硝化纤维素膜（Protran硝化纤维素；Schleicher&Schuell）。用抗HSF1（Spa-901；Enzo）、HSF2（3E2；Upstate）和β-管蛋白（ab6046；Abcam）的一级抗体分析蛋白质。二级抗体是HRP偶联的（GE Healthcare），印迹是使用增强化学发光法（ECL试剂盒；GE Healthcare）开发的。

寡核苷酸介导的下拉试验。

如前所述进行寡核苷酸介导的下拉试验(83)使用生物素化寡核苷酸（寡聚物）。双链HSE包含序列5′-生物素-TCG ACT AGC AGC TTC TAG AAG CTT CTA G-3′和加扰控制序列5′–生物素-AAC GAC GGT CGC TCC GCC TGG CT-3′。将100–400μg总蛋白的缓冲液C提取物在含有鲑鱼精子DNA（0.5μg/μL）的结合缓冲液[20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，2 mM EDTA和10%（vol/vol）甘油]中退火为寡核苷酸（0.5μM）。对样品进行预筛，并用50%（vol/vol）UltraLink链霉亲和素珠（Pierce）浆液沉淀寡核苷酸。结合组分用含有0.1%Triton X-100的结合缓冲液洗涤三次。DNA结合蛋白用Laemmli缓冲液洗脱，并用SDS/PAGE和Western blotting检测。

我们感谢Michael J.Guertin进行了富有洞察力的讨论，并分享了他在生物信息学方面的专业知识。赫尔辛基大学功能基因组学组（University of Helsinki）因执行高通量测序而获得认可，朱卡·莱顿（Jukka Lehtonen）在计算分析方面提供专家协助，戴安娜·托伊沃拉（Diana M.Toivola）、约翰娜·比约克（Johanna K.Björk）和伊娃·亨里克森（Eva Henriksson）在手稿准备期间提供建设性建议。这项工作得到了芬兰科学院、Sigrid Jusélius基金会、芬兰癌症组织、奥博阿卡德米大学基金会、Tor、Joe和Pentti Borg基金会、Finland生物中心以及Turku生物医学博士项目（A.V.和A.N.E.）的资助。