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氨基酸的双向转运调节mTOR和自噬
,1,5 ,2,5 ,三 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2,6 ,2 ,三 ,4 ,2和2,*
保罗·尼克林
1英国西苏塞克斯温布尔赫斯特路诺华霍舍姆研究中心诺华生物医学研究院呼吸疾病研究区，RH12 5AB
5这些作者为这项工作做出了同等贡献。
菲利普·伯格曼
2发育和分子途径
5这些作者为这项工作做出了同等贡献。
张百林
三美国马萨诸塞州剑桥马萨诸塞大道250号诺华生物医学研究院分析科学研究所，邮编：02139
杰弗里·麦凯根
2发育和分子途径
6现住址：美国密歇根州49503大急流城博斯特维克大道东北333号范安德研究所。
Y.卡伦·王
三美国马萨诸塞州剑桥马萨诸塞大道250号诺华生物医学研究院分析科学研究所，邮编：02139
刘易斯·坎特利
4哈佛医学院系统生物学系和美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心信号转导部，邮编02115
1英国西苏塞克斯温布尔赫斯特路诺华霍舍姆研究中心诺华生物医学研究院呼吸疾病研究区，RH12 5AB
2发育和分子途径
三美国马萨诸塞州剑桥马萨诸塞大道250号诺华生物医学研究院分析科学研究所，邮编：02139
4哈佛医学院系统生物学系和美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心信号转导部，邮编02115
5这些作者为这项工作做出了同等贡献。
6现住址：美国密歇根州49503大急流城博斯特维克大道东北333号范安德研究所。
- 补充资料
文件S1。补充实验程序和六个数字。
GUID:79F055F9-5B03-4553-A9BE-70B516D8D72A
总结
氨基酸是激活雷帕霉素（mTOR）激酶的哺乳动物靶点所必需的，该靶点调节蛋白质翻译、细胞生长和自噬。允许氨基酸进入细胞并向mTOR发送信号的细胞表面转运体尚不清楚。我们表明，细胞摄取L-谷氨酰胺及其在必需氨基酸（EAA）存在下的快速外排是激活mTOR的速率限制步骤。L-谷氨酰胺的摄取由SLC1A5调节，SLC1A5-功能的丧失抑制细胞生长并激活自噬。L-谷氨酰胺敏感性的分子基础是由于SLC7A5/SLC3A2，这是一种双向转运蛋白，调节L-谷氨酰胺同时流出细胞和L-亮氨酸/EAA进入细胞。某些基础细胞水平较高的肿瘤细胞系绕过了L-谷氨酰胺摄取的需要，并为mTOR激活做好了准备。因此，L-谷氨酰胺流量调节mTOR、翻译和自噬，以协调细胞生长和增殖。
简介
雷帕霉素（TOR）Ser/Thr激酶的靶点在真核生物进化过程中一直保持不变，以介导细胞对细胞外氨基酸和生长因子的反应(黄和曼宁，2008;Wullschleger等人，2006年)。在富含氨基酸的环境中，TOR是活跃的，可以调节蛋白质翻译，但也可以抑制大分子自噬（以下简称自噬）。当细胞外氨基酸受到限制时，自噬会回收细胞内成分，作为氨基酸的替代来源(水岛等人，2008年)。研究使用酿酒酵母对TOR作为氨基酸信号积分器的作用提供了关键见解。例如，TOR抑制剂雷帕霉素模拟了氨基酸饥饿对蛋白质翻译、细胞周期阻滞、核糖体生物生成和自噬的影响(克雷斯波和霍尔，2002年)。TOR活性对首选氮源（如L-谷氨酰胺或L-天冬酰胺）的可用性特别敏感，因此，在缺乏这些氮源的情况下，吸收这些氨基酸所需的通透酶被下调，而利用尿素和氨等替代氮源所需的基因被上调(Cardenas等人，1999年;Hardwick等人，1999年)。TOR通过调节氮依赖性生长所需的转录因子（Gln3和Rtg1/Rtg2）的细胞分布来控制这种代谢开关(克雷斯波和霍尔，2002年)。众所周知，氮饥饿也会激活体内的自噬酿酒酵母(Takeshige等人，1992年)与TOR作为自噬抑制剂的功能一致。L-谷氨酰胺如何调节TOR活性目前尚不清楚。
在迄今为止研究的所有真核生物中，TOR被分为至少两个不同的信号复合物(Wullschleger等人，2006年)。在哺乳动物细胞中，雷帕霉素敏感性mTOR复合物（mTORC）1对70kDa核糖体蛋白S6激酶（S6K）1和2的磷酸化和活化至关重要。S6K1通过调节蛋白质翻译先驱轮和真核生物起始因子3（eIF3）翻译复合体直接影响细胞生长(Holz等人，2005年;Ma等人，2008年)。mTORC1还通过直接磷酸化和抑制真核翻译起始因子4E（eIF4E）结合蛋白（4EBP1）来控制5'端mRNA的翻译(Gingras等人，2004年)。mTORC2对雷帕霉素不敏感，调节AKT-Ser/Thr激酶的激活，并能改变肌动蛋白细胞骨架(哈辛托等人，2004年;Sarbassov等人，2004年, 2005).
调节mTORC1途径的两个关键生长因子信号来自胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF）1/磷脂酰肌醇-3-OH激酶（PI（3）K）和细胞外信号调节激酶-p90核糖体蛋白S6激酶（ERK-RSK）途径(黄和曼宁，2008)。这些途径汇聚在由TSC1类和TSC2系统结节性硬化综合征（TSC）肿瘤综合征中突变的肿瘤抑制基因(Crino等人，2006年)。TSC1和TSC2蛋白在物理上结合并抑制富含脑的RAS同源物（Rheb），这是激活mTORC1所需的一种小G蛋白。TSC1/TSC2蛋白复合物可以被磷酸化，从而被PI（3）K和ERKRSK信号失活(Anjum和Blenis，2008年)允许Rheb激活mTORC1。在缺乏氨基酸的情况下，生长因子信号对mTORC1信号几乎没有影响(Hara等人，1998年)表明mTOR上游存在关键选通机制。必需氨基酸（EAA），如L-亮氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-精氨酸激活mTORC1途径(Blommaart等人，1995年;Hara等人，1998年;Wang等人，1998年)。最近的观察表明，Rag GTPases可以与mTORC1发生物理相互作用，并调节其对L-亮氨酸的亚细胞重新分布(Sancak等人，2008年)。氨基酸如何进入细胞调节mTORC1激活目前尚不清楚。
在本研究中，我们确定了L-谷氨酰胺控制mTOR信号的机制。细胞摄取L-谷氨酰胺是调节mTORC1的EAA和生长因子的限速步骤。摄取后，向细胞中添加EAA后1-2分钟内，L-谷氨酰胺流出，导致L-亮氨酸的相互摄取和S6K1的快速激活。溶质载体家族1成员5（SLC1A5）是一种高亲和力的L-谷氨酰胺转运体，其抑制作用可阻止L-谷氨酰胺的摄取，从而抑制mTORC1信号传导并激活自噬。溶质载体家族7成员5（SLC7A5）/SLC3A2是一种异二聚体双向反转运蛋白，调节细胞内L-谷氨酰胺与细胞外L-亮氨酸的交换。这些数据表明，L-谷氨酰胺和EAA的逆向转运控制着mTORC1和自噬。
结果
L-谷氨酰胺是雷帕霉素敏感性mTOR信号转导所必需的
mTORC1信号传导在生长因子和氨基酸剥夺后受到抑制。向饥饿的HeLa细胞中添加无血清DMEM可重新激活S6K1，并导致S6K1的磷酸化（导致SDS-PAGE迁移转移）以及核糖体蛋白S6（S6K1关键下游靶点）()。相反，以DMEM中发现的相同浓度的EAA孵育细胞不会调节S6K1，这表明DMEM内存在的成分是激活mTORC1所必需的。DMEM中发现的其余成分包括丙酮酸钠、碳酸氢钠、硝酸铁、非必需氨基酸（NEAA）和L-谷氨酰胺。使用细胞内western磷酸化-S6分析(图S1A我们观察到，向EAA中添加丙酮酸钠、碳酸氢钠、硝酸铁或NEAA并不能重建DMEM对mTORC1活化的影响（数据未显示，见下文）。相反，向EAA中添加L-谷氨酰胺可上调雷帕霉素敏感性mTOR-S6K-S6信号传导(,、和S1（第一阶段）)。重要的是，L-谷氨酰胺和EAA单独作用不大，但它们协同激活mTOR()。1 mM L-谷氨酰胺产生的影响最大，与循环水平（0.5至0.7 mM）相当(Dechelotte等人，1991年;Mittendorfer等人，2001年)。为了确定DMEM中的L-谷氨酰胺是否负责激活mTOR通路，将缺乏这种氨基酸的DMEM添加到饥饿的细胞中。值得注意的是，尽管在无L-谷氨酰胺培养基中存在EAA和其他营养素，但调节的S6磷酸化降低了85%()。谷氨酰胺对mTORC1的作用也是立体选择性的()。由于DMEM含有4.5 g/L的D-葡萄糖，而饥饿和刺激溶液含有1 g/L，我们证实这种变化并不是EAA无法调节mTORC1-S6K1活化的原因(图S1B)。4EBP1的磷酸化和真核生物翻译起始因子4G（eIF4G）随后向eIF4E帽复合物的募集也对L-谷氨酰胺敏感()。在HeLa细胞中的这些观察延伸到其他哺乳动物细胞系，其中雷帕霉素敏感的mTOR活性依赖于L-谷氨酰胺(图S2)以及S2果蝇属单元格()表明这是一个进化上保守的过程。
mTORC1效应器信号转导的谷氨酰胺依赖性调节
（A） 用DMEM或EAA处理缺乏生长因子和营养素（饥饿）的HeLa细胞60分钟。S6K1的磷酸化通过389和S6235/236系列和S6240/244和S6K1的总水平（显示70kDa细胞质和85kDa核亚型）通过蛋白质印迹法进行评估。
（B） 如（A）中所述使HeLa细胞饥饿，然后用指定浓度的EAA和/或L-谷氨酰胺处理60分钟。EAA浓度（x倍）基于DMEM中的最终浓度（1×）。S6的磷酸化235/236系列使用细胞内western分析进行定量，并表示为与饥饿细胞相比的fold-增加。
（C） 将饥饿的HeLa细胞与DMEM或L-谷氨酰胺缺乏的DMEM（DMEM-GLN）孵育60分钟，并将S6磷酸化235/236系列已量化。
（D） 如图所示，将饥饿的HeLa细胞处理60分钟，S6的磷酸化235/236系列进行了定量。使用1 mM L-或D-谷氨酰胺。
（E） 按照指示处理饥饿的HeLa细胞，并磷酸化S6K1通过389按照补充中的描述进行了量化。
（F） 饥饿的HeLa细胞按指示处理60分钟，4EBP1和eIF4G水平与7米使用western印迹分析GTP珠。
（G） S2或S2-R果蝇属然后在有或无L-谷氨酰胺的情况下，用氨基酸处理缺乏血清和氨基酸的细胞。
所示数据代表三个独立实验。带误差条的数据表示平均值±SD。
L-谷氨酰胺对mTORC1激活具有限速作用
为了了解EAA和L-谷氨酰胺之间的关系，用L-谷氨酰胺处理饥饿的HeLa细胞60分钟（预负荷），洗去细胞外L-谷氨酰胺，然后添加EAA不同时间()。在这些条件下，与同时添加EAA和L-谷氨酰胺相比，S6K1活化动力学显著加快，其中60分钟后观察到S6K1磷酸化()。用EAA和L-谷氨酰胺预处理饥饿细胞不会激活S6K1()确认L-谷氨酰胺是EAA输入的上游。这些观察结果表明，L-谷氨酰胺对EAA介导的S6K1激活具有限速作用。接下来，我们评估了在mTORC1上游整合生长因子信号是否需要L-谷氨酰胺。胰岛素调节的AKT激活和EGF调节的ERK1/2激活不受L-谷氨酰胺预处理的影响()。然而，用L-谷氨酰胺预处理可使S6K1对胰岛素和EGF敏感，表明其在信号整合中起着重要作用。().
L-谷氨酰胺整合EAA和生长因子对mTORC1的信号传导并调节S6K1的时间动力学
（A） 在添加EAA或EAA/GLN之前，用L-谷氨酰胺（GLN预负荷）或饥饿培养基（–）预培养饥饿的HeLa细胞1小时，直至达到指定的时间。通过western blotting分析S6K1的磷酸化。
（B） 细胞用L-谷氨酰胺（G）或EAA（E）预处理1小时，并在裂解前用EAA、L-谷氨酰胺或EAA/GLN孵育15分钟。
（C） 除胰岛素（100 nM）或EGF（25 ng/mL）外，其他细胞按（A）处理。
（D） 用L-谷氨酰胺或饥饿培养基预处理1小时的细胞，然后分别用EAA或EAA/GLN培养指定时间。
（E） 用10 mM L-谷氨酰胺、L-谷氨酸（GLU）或α-酮戊二酸（αKG）预处理1小时的细胞进行清洗，然后用饥饿培养基或含EAA的培养基培养15分钟。
（F） 用10 mM L-谷氨酰胺或13种非必需氨基酸（NEAA）预处理细胞1小时，清洗细胞，然后用饥饿培养基或含EAA的培养基培养15分钟。
（G） 将饥饿的HeLa细胞按指示处理1小时并裂解。
所有数据均代表至少三个独立实验。
虽然用L-谷氨酰胺预处理细胞可以在添加EAA的几分钟内支持强大的S6K1磷酸化()，S6K1激活减弱约60分钟()。与同时使用EAA和L-谷氨酰胺处理S6K1磷酸化持续数小时的细胞相比，以这种方式处理的细胞表现出短暂的S6K1激活(和S3A系列)。有趣的是，3小时后添加L-谷氨酰胺可重新激活S6K1(图S3A)表明瞬时活化动力学是由于L-谷氨酰胺限制，而不是EAA消耗或途径脱敏。在某些肿瘤细胞系中，L-谷氨酰胺可以通过谷氨酰胺裂解过程增强代谢通量，谷氨酰胺裂解过程产生三羧酸（TCA）循环中间体(DeBerardinis等人，2007年;科瓦切维奇和莫里斯，1972年)。为了确定L-谷氨酰胺对S6K1的影响是否是由于细胞能量增加所致，我们询问L-谷氨酸和α-酮戊二酸（谷氨酰胺水解产物）是否可以使mTOR对EAA敏感。与L-谷氨酰胺相比，L-谷氨酸和α-酮戊二酸不能调节S6K1的活化()。谷氨酰胺也可促进某些NEAA的生物合成，如L-天冬酰胺和L-精氨酸。NEAA无法在预处理模式下调节S6K1的激活()或与EAA和/或L-谷氨酰胺联合添加时()。综上所述，这些数据表明，L-谷氨酰胺调节的mTOR-S6K1-S6激活是一种近端事件，并非源于谷氨酰胺水解和/或NEAA合成增加。
抑制SLC1A5和SLC7A5/SLC3A2可对抗mTORC1
我们试图确定一种分子机制，解释为什么L-谷氨酰胺对mTORC1激活具有速率限制作用。L-谷氨酰胺流入哺乳动物细胞可由至少四种不同的转运体调节；纳+-依赖系统A、ASC、N和Na+-由低亲和力L-谷氨酰胺转运体组成的独立系统L(McGivan和Bungard，2007年)。有趣的是，已经提出了SLC1A5（也称为ASCT2）和SLC7A5（也称为LAT1）之间的关系(Verrey，2003年)这解释了谷氨酰胺和mTORC1上游EAA之间的相互作用()。SLC1A5是一种高亲和力，Na+-L-谷氨酰胺依赖性转运体(Utsunomiya-Tate等人，1996年)。SLC7A5将支链侧链氨基酸（如L-亮氨酸）运输到细胞内，以交换细胞内氨基酸（如L-glutamine）的流出(Meier等人，2002年;Yanagida等人，2001年)。SLC7A5作为与SLC3A2的二硫键合异二聚体复合物的一部分发挥作用，并位于质膜上(Mastroberardino等人，1998年)。因此，我们假设由SLC1A5转运到细胞内的细胞内L-谷氨酰胺作为SLC7A5/SLC3A2的外排底物，允许EAA的逆向转运。L-γ-谷氨酰对硝基苯胺（GPNA），SLC1A5调节转运抑制剂(Esslinger等人，2005年)剂量依赖性抑制S6磷酸化和eIF4E帽复合物()。为了评估GPNA抑制L-谷氨酰胺输入的特异性，在有或无GPNA的情况下用Lglutamine预处理细胞60分钟，然后在有或没有GPNA的条件下暴露于EAA 15分钟()。在预处理期间，GPNA的存在，而不是EAA的存在，完全抑制了S6K1的激活()。总之，这些数据表明，SLC1A5抑制剂GPNA通过限制细胞摄取L-谷氨酰胺来拮抗mTORC1信号。
SLC1A5和SLC7A5的药理调节抑制mTOR调节
（A） 在GPNA浓度增加的情况下，按指示处理饥饿的HeLa细胞（1小时）。
（B） 将饥饿的细胞处理60分钟，并分析帽翻译复合物。使用10 mM GPNA。
（C） 细胞在存在或不存在GPNA的情况下用L-谷氨酰胺预处理（预载）60分钟，然后在存在或不存在GPNA的情况下用EAA处理15分钟。
（D和E）在没有或存在BCH的情况下，用含有1 mML-谷氨酰胺（EAA/GLN）和100 nM胰岛素的EAA处理饥饿的HeLa细胞60分钟。显示非特异性反应带（*）。
（F） S6的磷酸化235/236系列在含有1mML-谷氨酰胺和D-苯丙氨酸的情况下，用指示浓度（X）的EAA进行处理后进行定量。
（G） 在存在和不存在50 mM D-苯丙氨酸（D-Phe）的情况下，按照指示处理饥饿的HeLa细胞。
（H） 如图所示，将细胞预处理60分钟，然后在有无D-Phe的情况下用EAA处理15分钟。
带误差条的数据表示平均值±SD。
为了询问SLC7A5/SLC3A2的需求，使用了EAA的候选转运体2-氨基双环-（2,2,1）庚烷羧酸（BCH）。BCH，SLC7A5抑制剂(Kanai等人，1998年;Mastroberardino等人，1998年;Yanagida等人，2001年)，抑制S6K-S6磷酸化(,S3B和S3C)。BCH不抑制AKT磷酸化()或佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）对饥饿HeLa细胞S6磷酸化的调节(图S3D)与RSK以mTORC1非依赖性方式直接磷酸化S6的能力一致(Anjum和Blenis，2008年)。因此，BCH特异性抑制mTORC1的氨基酸输入。作为调节SLC7A5/SLC3A2功能的另一种方法，使用了D-苯丙氨酸。与L-苯丙氨酸不同，SLC7A5是一种调节S6K1活化的高亲和力底物(Hara等人，1998年;Kanai等人，1998年;Mastroberardino等人，1998年;Yanagida等人，2001年)，D-苯丙氨酸抑制SLC7A5/SLC3A2介导的转运(Kanai等人，1998年)。D-苯丙氨酸抑制雷帕霉素敏感性S6磷酸化()和帽子翻译复合体()。与GPNA的作用模式相反，D-苯丙氨酸特别抑制EAA而不是L-谷氨酰胺输入()。总的来说，这些结果表明BCH-和D-苯丙氨酸敏感活性负责EAA对mTORC1的调节，并且与之前的研究一致，这些活性抑制双向转运体SLC7A5/SLC3A2。
谷氨酰胺流出和L-亮氨酸摄取先于S6K1激活
上述数据支持SLC1A5介导的L-谷氨酰胺摄取为EAA调节mTOR信号提供信号的模型。由于SLC7A5/SLC3A2能够使用L-谷氨酰胺作为外排底物(Meier等人，2002年;Yanagida等人，2001年)，我们检验了EAA通过量化其在EAA处理后培养基中的存在来调节细胞内L-谷氨酰胺流出的假设。用L-谷氨酰胺预处理饥饿的细胞1小时，并按照上述方法进行清洗()。用EAA处理15分钟后，收集条件培养基并转移至原始饥饿细胞()。这种条件培养基支持S6K1的激活，但不支持EAA直接添加到L-谷氨酰胺供体细胞中()。取自EAA处理的非质控细胞的条件培养基不能激活S6K1()证明条件培养基的效果依赖于L-谷氨酰胺。这些结果表明，EAA存在时会释放一种细胞因子，可能是L-谷氨酰胺，它能够调节mTOR-S6K1活性。在EAA存在的情况下，该因子仅在2.5分钟后释放().
L-谷氨酰胺和EAA的双向转运是mTOR激活的上游
（A） 在添加EAA或饥饿培养基（15分钟）之前，用L-谷氨酰胺或饥饿培养液（-）预培养饥饿细胞1小时。去除条件培养基（CM）并将其添加到未经处理的饥饿细胞中1小时（1-5道），并分析S6K1磷酸化。显示了EAA处理的L-谷氨酰胺激发细胞提取物中S6K1的磷酸化（第6条车道）。
（B） 除添加EAA后收集2.5、5、10和15分钟外，条件培养基的制备如（A）所示。
（C） 在EAA前用饥饿培养基（PBS）预处理的细胞（左迹线）、在PBS前用L-谷氨酰胺预处理的电池（中迹线）或在EAA（右迹线）前用L-谷酰胺预处理过的电池中，在2.5分钟时采集的条件培养基中L-谷酰胺的LC/MS/MS离子色谱图。
（D） 用标记的L-谷氨酰胺预处理饥饿的HeLa细胞1小时，洗涤，然后用含有0.4mM标记的L-亮氨酸的EAA（L-Leu/EAA）处理不同时间（分钟）。使用LC/MS/MS定量条件培养基（黑色符号）和细胞提取物（红色符号）中标记的L-谷氨酰胺的绝对水平。
（E） 如（C）中那样处理饥饿细胞，并定量用PBS、EAA或胰岛素处理2.5分钟后的L-谷氨酰胺流出（培养基浓度的倍数变化）。
（F） 按照（D）中的方法处理细胞，2.5分钟后，定量细胞中流出的标记L-谷氨酰胺（黑色）和标记L-亮氨酸（红色）的绝对水平。
（G） 用10 mM标记L-谷氨酰胺或标记L-谷氨酸预处理1小时的细胞进行清洗，用含有标记L-亮氨酸的EAA处理2.5分钟并提取。
（H） 在缺乏或存在10 mM GPNA的情况下，用标记的L-谷氨酰胺处理饥饿细胞1小时。对细胞提取物中L-谷氨酰胺的绝对水平进行了定量。
（一） 用标记的L-谷氨酰胺处理细胞1小时，洗涤并用0.4 mM标记的L-亮氨酸在无BCH或D-Phe的情况下孵育2.5分钟。
带误差条的数据表示平均值±SD。
为了证明L-谷氨酰胺在EAA处理后流出细胞，使用HPLC-三重四重质谱（LC/MS/MS）分析条件培养基。从EAA处理2.5分钟的细胞中提取的条件培养液中检测不到L-谷氨酰胺()然而，与对照细胞相比，从L-谷氨酰胺激发的EAA处理细胞中提取的条件培养液中检测到L-谷氨酰胺浓度增加了10倍()。该培养基中L-谷氨酰胺的绝对浓度约为最大限度调节mTORC1途径活性所需浓度的100倍()与条件培养基在原始细胞中的次最大效应相一致()。使用稳定同位素标记的L-谷氨酰胺类似物，我们观察到L-谷氨酰胺随时间流出与细胞L-谷氨酰胺耗竭相关()。重要的是，胰岛素治疗不会导致L-谷氨酰胺外排，这表明上述影响是EAA特有的()。这些观察结果证明，L-谷氨酰胺在EAA作用下迅速流出细胞。如果SLC7A5/SLC3A2调节L-谷氨酰胺与EAA的交换，那么L-谷氨酰胺应该会促进L-亮氨酸的吸收。事实上，通过使用标记的L-谷氨酰胺和L-亮氨酸类似物，这些氨基酸发生了相互交换()。L-谷氨酸不能调节L-亮氨酸摄取()与L-谷氨酰胺不同，EAA治疗后其细胞水平不会耗尽(图S5A和B)。这为L-谷氨酰胺代谢物不参与mTORC1激活提供了明确的证据。最后，GPNA抑制标记的L-谷氨酰胺进入细胞()BCH和D-苯丙氨酸抑制了基础和L-谷氨酰胺调节的L-亮氨酸摄取().
SLC1A5和SLC7A5/SLC3A2是氨基酸交换、mTORC1信号传递和细胞生长所必需的
为了确定mTORC1的氨基酸调节是否需要SLC1A5和SLC7A5/SLC3A2，我们为每个基因鉴定了两个siRNAs，它们将靶mRNA敲低80%-90%(图S4A-S4C)。正如预期的那样，用mTOR siRNA抑制S6磷酸化的氨基酸调节，用TSC2 siRNA增加()。每个SLC-靶向siRNA都抑制S6-S6K1磷酸化，类似于mTOR siRNA()。接下来，我们研究了这些RNAi试剂对cap复合物调控的影响。正如预期的那样，mTOR的下调阻止了4EBP1从eIF4E帽复合物中分离，甚至增强了4EBP的基础联系()。敲除SLC1A5、SLC7A5或SLC3A2也会增强4EBP1与帽复合物的基础结合，并在L-谷氨酰胺和EAA存在的情况下将4EBP1s还原为复合物()。在异步循环、血清饥饿或胰岛素处理的细胞中也会出现类似的效果(图S4D)。在SLC3A2下调后，BCH未抑制eIF4G募集(图S3E)证实BCH靶向SLC7A5/SLC3A2。注意，SLC3A2和SLC7A5的表达是相互依赖的(Mastroberardino等人，1998年)解释当SLC3A2和SLC7A5被RNAi靶向时表达减少的原因(和S4D系列)。当SLC1A5被下调导致加入EAA后外排减少时，L-谷氨酰胺摄取显著降低()。下调SLC3A2或SLC7A5阻止L-谷氨酰胺调节的L-亮氨酸摄取()。这些数据证明SLC1A5和SLC7A5/SLC3A2支持HeLa细胞中的氨基酸交换，这是激活mTORC1所必需的。
RNAi介导的SLC1A5、SLC3A2或SLC7A5下调抑制氨基酸转运和mTOR通路活性
（A） 用指示的siRNA转染的HeLa细胞是氨基酸缺乏的（开放条），并用含有1mM L-谷氨酰胺的EAA处理60分钟（红色条）。S6的磷酸化235/236系列使用Delfia读数进行量化。
（B） 在siRNA转染（96小时）后，分析S6K1磷酸化。
（C） 按照指示处理转染siRNAs的细胞（1小时），并分析cap翻译复合物。
（D） 用打乱或SLC1A5_1 siRNA转染的细胞饥饿，并用标记的L-谷氨酰胺预培养（1小时）。提取细胞以定量标记的L-谷氨酰胺摄取（开放条），或用标记的L-亮氨酸/EAA处理细胞（2.5分钟）以定量标记L-谷氨酰胺流出（填充条）。
（E） 用指示的siRNAs转染细胞，饥饿并用标记的L-谷氨酰胺（孵化棒）或饥饿培养基（填充棒）预处理1小时，清洗，然后用0.4 mM标记的L-亮氨酸处理2.5分钟。处理细胞提取物以绝对定量L-亮氨酸。
（F） 用siRNA（非沉默，NS）转染HeLa细胞72小时，并收集用于细胞大小定量。
（G） 显示了三个独立实验的细胞大小数据（平均值±SEM）。
（H） 在存在或不存在TSC2 siRNA的情况下，用打乱、mTOR、SLC1A5或SLC7A5 siRNA转染HeLa细胞，并进行细胞大小定量处理。
（一） 用siRNA转染载体表达（模拟）或RNAi不敏感的GFP-SLC1A5表达的HeLa细胞（克隆L1和L2），并进行细胞大小定量处理。
所示数据（平均值±SD）代表三个独立的实验。
mTOR调节翻译的能力负责细胞和生物体的生长(Arsham和Neufeld，2006年)。因此，我们量化了下调SLC1A5、SLC7A5或SLC3A2后的相对细胞大小。与非沉默siRNA相比，mTOR的下调导致细胞大小减少约10%(和)与之前关于哺乳动物细胞的报道一致(Fingar等人，2002年;Kim等人，2002年)。为了控制目的，使用TSC2下调来显示在这些实验条件下，HeLa细胞也可以生长(图S6A)。转染SLC1A5、SLC3A2或SLC7A5 siRNAs后，细胞大小比对照转染细胞小10%-20%(,、和第6a条)。采用两种不同的方法证明细胞大小表型是由于（1）mTOR路径特异性抑制和（2）靶向RNAi。我们首先确定在存在SLC1A5或SLC7A5 siRNA的情况下，下调TSC2是否会恢复细胞生长。在这个实验范式下，与模拟转染细胞相比，下调mTOR抑制TSC2细胞生长表型并进一步减小细胞大小()与TSC2下游的mTOR一致。相反，TSC2 siRNA存在时SLC1A5或SLC7A5的下调导致细胞生长增加()。这表明SLC1A5和SLC7A5可能作用于TSC2的上游，以调节mTOR的氨基酸信号。然而，值得注意的是，在这些实验中，细胞生长并没有被挽救到与TSC2单独下调相同的水平（即，SLC1A5的挽救率为75%，SLC7A5的拯救率为50%）。这可能是因为TSC2未完全击倒，或者SLC1A5和SLC7A5/SLC3A2可以独立于TSC2向mTOR发出信号。其他报告支持后一种可能性(Kim等人，2008年;Sancak等人，2008年;Smith等人，2005年)以及目前的观察结果，在转染TSC2 siRNA的细胞中，L-谷氨酰胺和EAA显著增加S6磷酸化()。最后，进行细胞大小表型拯救实验，以证明SLC1A5 RNAi表型是靶向的。HeLa细胞稳定表达对SLC1A5_1不敏感但不敏感的GFP-SLC1A5_2 siRNA(图S6B)。与SLC1A5_1相关的细胞大小减少在这些细胞中被完全抑制()证明观察到的表型是由SLC1A5引起的。然而请注意，稳定的HeLa克隆对SLC1A5_2 siRNA仍然敏感()下调外源性和内源性SLC1A5(图S6B).
内源性L-谷氨酰胺原mTORC1激活水平高
在筛选L-谷氨酰胺依赖性mTOR信号的细胞株时，发现了对外源性L-谷氨酰胺无影响的细胞株。例如，在MCF7细胞中，EAA本身足以调节S6K1和S6的D-苯丙氨酸敏感性磷酸化()。有趣的是，S6K1激活动力学()反映L-谷氨酰胺预加载HeLa细胞中发生的情况()表明MCF7细胞已为EAA输入做好准备。向MCF7细胞中添加EAA可将L-谷氨酰胺的中等浓度提高3至4倍()表明这些细胞合成L-谷氨酰胺，可以调节EAA的摄取。在MCF7细胞中很容易检测到L-谷氨酰胺，使用L-亮氨酸/EAA处理后，其迅速减少，与细胞外排相一致()。MCF7细胞中L-谷氨酰胺和标记L-亮氨酸的双向转运在30-60分钟后减弱()符合S6K1灭活()。为了确定L-谷氨酰胺的细胞浓度是否限制了持续的S6K1活性，结合EAA添加外源性L-谷氨酰胺。在这些条件下，细胞总L-谷氨酰胺水平升高（数据未显示），S6K1持续激活长达2小时()。这些数据表明，L-谷氨酰胺和L-亮氨酸在多种细胞类型中发生双向流动，并揭示了某些细胞L-谷氨酰胺水平升高的肿瘤细胞系被激活以调节mTORC1的EAA。
内源性L-谷氨酰胺外流调节MCF7细胞S6K1活化
（A） MCF7细胞缺乏氨基酸，按指示处理（1小时）并进行S6磷酸化定量处理。
（B） 在缺乏或存在50 mM D-Phe的情况下，用EAA处理饥饿的MCF7细胞不同时间。
（C） 用标记的L-亮氨酸/EAA（填充圆圈）或饥饿培养基（星形）处理饥饿的MCF7细胞不同时间，并处理条件培养基以定量L-谷氨酰胺。
（D） 如（C）中那样处理MCF7细胞，并在L-谷氨酰胺定量所指示的时间提取（黑色圆圈）或标记的L-亮氨酸（红色圆圈）。
（E） 按照指示处理饥饿的MCF7细胞，并使用western blotting分析S6K1激活。
带误差条的数据表示平均值±SD。
L-谷氨酰胺和SLC1A5抑制自噬
通过提取氨基酸或添加雷帕霉素抑制mTOR信号激活自噬(Blommaart等人，1995年)。我们假设L-谷氨酰胺的缺乏或SLC1A5的下调也会激活自噬。为了测试这一点，我们开发了一个基于串联荧光图像的系统(Kimura等人，2007年)定量自噬体膜蛋白LC3的再分配。RT112细胞显示S6K1的L-谷氨酰胺依赖性激活(图S6C)并且被工程化以表达mCherry-eGFP-LC3。由于eGFP在pH<6.0的细胞隔室中不稳定，mCherry:eGFP puncta比率增加表明自噬通量增强，并允许区分溶酶体融合前后LC3的分布。在无血清培养基中，LC3共分布于mCherry-和eGFP-阳性点()但也观察到mCherry-和eGFP-LC3的细胞质共分布，表明自噬并没有被最大限度地激活。去除细胞外L-谷氨酰胺后，细胞质定位消失，LC3在mCherry-和eGFP-阳性斑点中的共分布受到抑制()。这表明LC3转移到了对GFP敏感的酸性隔室，如溶酶体。使用单个mCherry和eGFP LC3点的高含量图像分析对这些影响进行量化()。作为对照，雷帕霉素和巴非霉素A分别用作自噬的激活剂和抑制剂()。细胞在无血清（含L-谷氨酰胺）DMEM中孵育可增加自噬的基础水平，这与生长因子调节mTOR的能力一致(Martin和Blenis，2002年)。重要的是，与无血清和L-谷氨酰胺的DMEM孵育会导致更大程度的自噬激活，几乎达到雷帕霉素的水平()。由于EAA仍然存在于无L-谷氨酰胺的培养基中，这一观察结果证明，L-谷氨酰胺对自噬抑制至关重要，并且与EAA单独激活mTOR和抑制自噬的能力一致。最后，使用RNAi下调SLC1A5，与雷帕霉素或mTOR抑制作用一样，增强了自噬通量(和S6D系列)。这些数据表明，L-谷氨酰胺通过SLC1A5进入细胞是抑制自噬所必需的。
L-谷氨酰胺和SLC1A5调节自噬
（A） 显示了谷氨酰胺饥饿前后mCherry-eGFP-LC3a分布的共焦图像。
（B） RT112细胞自噬流量的定量。
（C） 转染单个siRNAs 72小时的RT112细胞被血清饥饿24小时并进行自噬通量定量。饥饿期间，将雷帕霉素添加到打乱的siRNA转染细胞中。
（D） EAA调节mTOR信号、细胞生长和抑制自噬需要细胞内摄取和随后流出L-谷氨酰胺（SLC3A2与SLC7A5二聚体显示为黄色）。
所有数据（平均值±SD）均代表至少三个独立实验。
讨论
氨基酸调节TOR信号的能力在真核生物中功能保守，对于mTORC1整合生长因子信号至关重要(Dann和Thomas，2006年)。据推测，氨基酸转运蛋白在mTORC1的上游起作用，使细胞能够感知氨基酸的可用性并启动合成代谢反应（增加翻译和生长），或者当氨基酸受到限制时，启动分解代谢反应，如自噬。发挥这种作用的氨基酸转运体尚未确定。在这里，我们已经证明：（1）L-谷氨酰胺是一种必需的、能使EAA和生长因子激活mTOR的速率敏感性因子，（2）高亲和力L-谷氨酰胺转运体SLC1A5和异二聚体SLC7A5/SLC3A2双向转运体是氨基酸转运、mTORC1通路活性和细胞生长所必需的，以及（3）L-谷氨酰胺和SLC1A5功能需要抑制自噬。
L-谷氨酰胺调节mTORC1-S6K1信号转导的时间动力学
L-谷氨酰胺介导的mTORC1激活敏化具有明显的剂量依赖性，这表明细胞内L-谷氨酰胺浓度的升高为EAA的摄取提供了一个开关，从而导致mTORC1-信号传导。在用EAA或生长因子治疗之前，用L-谷氨酰胺预加载细胞可加速S6K1激活，这表明SLC1A5调节的L-谷氨酰胺摄取是mTORC1途径激活的速率限制。这一惊人的观察结果可能解释了mTOR-S6K1对氨基酸和生长因子的反应通常先于激活30-60分钟的滞后。重要的是，细胞内L-谷氨酰胺耗尽后，L-亮氨酸摄取停止，mTORC1失活。这些在几种细胞类型中进行的观察结果导致了以下预测：在细胞周期进展过程中，需要L-谷氨酰胺来维持mTORC1-S6K1信号。这可能是至关重要的，因为正常的增殖反应需要细胞分裂的协调和mTOR依赖性的细胞大小控制(Fingar等人，2002年)。此外，在MCF7细胞中进行的观察增加了以下可能性：L-谷氨酰胺水平升高的肿瘤细胞系已准备好接受EAA对mTORC1的调节()。谷氨酰胺合成酶异常上调可能是解释L-谷氨酰胺水平升高的一种可能机制。虽然还需要进一步的研究来确定在什么条件下可能发生这种情况，但已有报道称肿瘤中谷氨酰胺合成酶过度表达(Christa等人，1994年;Gebhardt和Williams，1995年).
实验程序
哺乳动物细胞培养、治疗和提取物制备
如补充信息中所述培养HeLa和MCF7细胞。通过剥夺FBS细胞20小时，然后与含有CaCL的D-PBS孵育，进行氨基酸饥饿2，氯化镁215 mg/L酚红、20 mM HEPES和1 g/L D-葡萄糖（饥饿培养基）培养3小时。饥饿细胞与EAA混合物培养，浓度为DMEM（MEM氨基酸）中发现的浓度，存在或不存在1或10 mM L-谷氨酰胺。在饥饿培养基中稀释L-谷氨酸、α-酮戊二酸和非必需氨基酸（NEAA）溶液（西格玛，圣路易斯，密苏里州），并将所得溶液调节至pH 7.2。将GPNA（γ-L-谷氨酰胺基对硝基苯胺盐酸盐，（MP Biomedicals，Solon，OH）和BCH（2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸，（Sigma，St.Louis，MO）溶解在刺激培养基中，并将pH调节至7.2。对于L-谷氨酰胺预培养实验，在37°C条件下，将缺乏氨基酸的细胞在10 mM L-谷氨酰胺存在下培养1小时。然后取下培养基，用饥饿培养基冲洗细胞单层两次，然后按所示时间添加试验培养基。细胞裂解缓冲液的详细信息，果蝇属补充信息中提供了细胞培养和刺激、抗体、eIF4E-cap复合物分析和细胞内western分析。
L-谷氨酰胺和稳定同位素标记氨基酸类似物的LC/MS/MS测定
使用LC/MS/MS和API4000三重四重MS系统（Applied Biosystems Inc，Framingham，MA）、Agilent 1200 HPLC（Santa Clara，CA）和Leap CTC自动取样器（Carrboro，NC），对培养基中的L-谷氨酰胺浓度进行量化。补充信息中提供了LC条件和稳定同位素标记的氨基酸细节。校准标准品在含有0.5%空白培养基的乙腈/水溶剂混合物（50/50 v/v）中制备。在与细胞孵育后的不同时间点收集的条件培养基样品，用含有内标物的乙腈/水溶剂混合物稀释1:200（v/v）。注入稀释样品（5μL）并通过LC/MS/MS进行分析。为了定量细胞提取物中的L-谷氨酰胺和标记氨基酸，用冰镇PBS冲洗细胞单层两次，刮入PBS（200μL）中，速冻三次，离心（14000 rpm，10 min）以清除细胞碎片。根据总蛋白水平对样品进行归一化后，在添加两等分的乙腈后，通过沉淀和离心去除裂解液中的蛋白质。如上所述，测定培养基样品上清液中氨基酸的绝对水平。
RNAi和细胞大小分析
补充信息中描述了siRNA序列信息和RNAi不敏感的SLC1A5 cDNA的设计。每个实验中siRNA的最终浓度为25 nM。在转染打乱、mTOR、SLC1A5或SLC7A5 siRNA之前24小时转染TSC2或打乱siRNA()。如前所述，进行基于FACS的细胞大小定量(爱丁格尔和汤普森，2002年)补充信息中描述了具体细节。
自噬定量
将稳定表达mCherry-eGFP-LC3a的RT112细胞培养在384孔板（24小时）中。用富培养基（DMEM/10%FBS）、30 nM雷帕霉素、100 nM巴非霉素A、无血清DMEM（含4 mM L-谷氨酰胺）或无血清缺乏L-谷氨酰胺的DMEM重新喂养细胞。18小时后固定细胞，用Hoechst和LC3a puncta染色，使用IN Cell Analyzer 1000（新泽西州皮斯卡塔韦GE Healthcare）进行分析。中显示的每个数据点表示8个视野的平均值，每个视野50-100个单元格。自噬通量根据mCherry-GFP点强度比计算，并表示为雷帕霉素诱导自噬的百分比。代表性图片()使用LSM 510 META共焦显微镜（纽约桑伍德卡尔蔡司显微成像公司）采集。
致谢
我们要感谢斯蒂芬·海利维尔、丹·加尔扎、德米特里·威德斯卡因、格雷格·米绍德、亚历克斯·黄、莱斯利·庞德和约翰·韦斯特维克的支持、评论和建议；以及Alan Abrams在图形方面的帮助；和Akos Szilvasi，帮助共焦成像。所有作者（L.C.C.除外）均为诺华制药公司的员工。
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