自噬

WT和WT的关键代谢特征第5天^−/−谷氨酰胺饥饿期间的MEF

为了扩大我们的观察范围，我们比较了第5天^−/−谷氨酰胺饥饿不同时间点的WT MEF(图2,​,3三和​和4）。4). 我们发现，除赖氨酸外，九种必需氨基酸（EAA）的基础水平（0小时）在第5天^−/−MEF比WT MEF(图2). 然而，在停用谷氨酰胺6小时后，所有9种分析的EAA水平在第5天^−/−MEF高于其各自的0h水平，而除赖氨酸外，WT MEF中EAA的水平没有显著下降(图2). WT MEF中EAA水平对谷氨酰胺饥饿6h的不同反应第5天^−/−MEF提高了WT和突变细胞使用不同途径维持EAA水平的可能性。为了研究这种可能性，我们检测了支链氨基酸（BCAAs：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、异戊酰肉碱、异丁酰肉碱和2-甲基丁酰肉碱分解代谢产物的稳态水平。显然，这些分解代谢产物在WT和第5天^−/−谷氨酰胺停药后6小时的MEF与EAA的MEF相同(图3). 观察到的EAA和BCAA分解代谢物的短暂减少似乎代表了对谷氨酰胺缺乏的特征性反应atg5型^−/−MEF公司。

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图2。自噬缺陷导致EAA摄入量增加，谷氨酰胺缺乏时EAA水平降低。WT和第5天^−/−MEFs在不含谷氨酰胺的血清补充DMEM中生长0、6和24小时，共5个重复。相对量化(A类)组氨酸(B)异亮氨酸(C类)亮氨酸(天)赖氨酸(E类)蛋氨酸(F类)苯丙氨酸(G公司)苏氨酸(H（H）)色氨酸和(我)进行缬氨酸试验，并通过将未处理WT MEF中的水平设置为1来确定相对水平*p<0.05**p<0.01***p<0.001；谷氨酰胺；n=15。

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图3。谷氨酰胺戒断和自噬缺陷增加BCAA分解代谢。细胞制备、相对定量和数据分析如图2.亮氨酸代谢物概况：(A类)4-甲基-2-氧代戊酸和(B)异戊酰肉碱；异亮氨酸代谢物：(C类)3-甲基-2-氧代戊酸盐；缬氨酸代谢产物：(天)异丁酰肉碱；(E类)3-甲基-2-氧代丁酸和(F类)2-甲基丁基肉碱*p<0.05**p<0.01***p<0.001；谷氨酰胺；n=15。

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图4。谷氨酰胺消耗影响TCA循环中间产物。细胞制备、相对定量和数据分析如图2.的配置文件(A类)谷氨酰胺(B)谷氨酸(C类)富马酸盐(天)苹果酸(E类)柠檬酸盐(F类)丙酮酸盐和(G公司)显示NAD*p<0.05**p<0.01***p<0.001；谷氨酰胺；n=15。

与自噬通过蛋白质水解提供游离氨基酸供应的概念一致，细胞内的基本谷氨酰胺水平在第5天^−/−完全培养基中的MEFs比WT中的MEFs(图4A).^7,8正如预期的那样，当我们比较它们各自对谷氨酰胺饥饿的反应时，到了24小时，这两种细胞类型中的谷氨酰胺水平几乎都检测不到。为了确保细胞内谷氨酰胺水平受到ATG5水平的影响，我们测试了m5-7细胞的反应，这是一种同基因第5天^−/−稳定表达可诱导四环素的MEF株附件5构造，²³在存在或不存在多西环素（Dox，20 ng/ml）的情况下，退出谷氨酰胺。在m5-7细胞中观察到细胞内谷氨酰胺水平显著降低(图S2A，左面板，第4列与第1列）添加Dox以关闭ATG5表达式时(图S2A，右侧面板）。此外，Dox处理的“ATG5-off”m5-7细胞表现出较低的葡萄糖消耗和降低的乳酸生成能力，而培养基中的钠和钾离子水平在谷氨酰胺停药后保持不变(图S2B–E).

由于谷氨酰胺为合成NEAAs（包括谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸）提供碳和氮源，我们比较了WT和第5天^−/−MEF确定是否与谷氨酰胺合成中的谷氨酰胺共同调节第5天^−/−MEF公司。六分之五的受检NEAA，包括谷氨酰胺，在第5天^−/−MEF比WT MEF(图4B;图S3A). 与富培养基中WT MEF的相应水平相比，NEAA的水平也有类似的下降趋势第5天^−/−MEF保持在全培养基中，WT MEF受到谷氨酰胺限制6小时(图S3A).

关于谷氨酰胺水平第5天^−/−谷氨酰胺饥饿6h的MEF与WT MEF相反。谷氨酰胺在第5天^−/−对谷氨酰胺饥饿反应的MEFs是出乎意料的。我们的解释是谷氨酰胺限制（要降低ATP水平，请参阅图5与Atg5缺乏（以减少游离氨基酸的释放）相结合，最终会损害蛋白质合成，从而增加谷氨酰胺生成中的谷氨酰胺水平第5天^−/−MEF公司。然而，自噬受损阻碍蛋白质合成以增加谷氨酰胺水平的说法并不能完全解释EAA在atg5型^−/−MEF，因为相同细胞中的NEAA水平低于WT细胞中的水平(图S3A).

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图5。谷氨酰胺缺乏抑制细胞增殖并降低细胞内ATP水平。(A类)谷氨酰胺缺乏降低了ATP水平。WT和第5天^−/−MEF在完整培养基中播种，以在处理当天达到50%的融合，然后在收获前的指定时间段内，在添加或不添加谷氨酰胺（4 mM）、2-DG（10 mM）或甲基丙酮酸（10 mM）的情况下，在添加了血清的DMEM（不含谷氨酰胺）中生长。按照材料和方法中所述进行ATP测定。谷氨酰胺缺乏和2-DG处理抑制细胞增殖。WT和第5天^−/−MEF接种在完整培养基中，在处理当天达到10%的融合，然后在添加和不添加谷氨酰胺（4 mM）的血清DMEM中生长，或在含有2-DG（10 mM）全培养基中生长指定的时间段。通过与0h时的相对细胞增殖（通过方法中所述的细胞增殖试验确定）进行比较，计算每个处理的相对细胞增生，设为1。三个独立实验的结果显示为平均值±SD。进行Student t检验以确定（a）对照组（24/48 h）和-Gln（24/48h）之间的差异；（b） 对照组（24/48小时）和2-DG组（24-48小时）。(B)DM-2-KG和NAC均能挽救细胞增殖。WT和第5天^−/−将MEF接种在完全培养基中，在处理当天达到10%的融合，然后在含有DM-2-KG（7 mM）、NAC（2 mM）或两者的谷氨酰胺缺失DMEM中生长。通过细胞增殖试验评估细胞增殖。使用Student t检验计算Gln（-）中的WT MEF（24/48/72小时）和DM-2-KG/NAC/DM-2-KG和NAC组合中的WT-MEF（24/48-72小时）之间的显著性；第5天^−/−Gln中的MEF（-）（24/48/72小时）和第5天^−/−DM-2-KG/NAC中的MEFs/DM-2-KG和NAC的组合（24/48/72小时）；NAC中的WT MEF（24小时）和第5天^−/−NAC中的MEF（24小时）。(C类)补充NAC可以拯救谷氨酰胺分泌细胞的增殖。使用RTCA DP分析仪实时监测细胞增殖。m5-7细胞维持在没有或有Dox关闭的培养基中附件5表达式（右侧面板）。在有无NAC补充剂的情况下提取谷氨酰胺，每30分钟测定并记录细胞生长(天)支持WT增殖所需的最低谷氨酰胺浓度第5天^−/−MEF公司。如材料和方法中所述测定细胞增殖。简单地说，将5000个细胞接种到96-well培养皿中过夜，并在切换到具有指示谷氨酰胺浓度（0、0.5和4 mM）的培养基之前培养过夜，而4 mM代表完整的培养基。在24、48和72小时后测定细胞存活率，并将相对细胞增殖百分比计算为72小时的100%。Gln（-），在不含谷氨酰胺的DMEM中生长；Gln（+），在含有谷氨酰胺的DMEM中生长；DM-2-KG、二甲基-2-酮戊二酸；2-DG，2-脱氧葡萄糖；NAC，N-乙酰半胱氨酸；强力霉素。(A和B)结果显示为三个独立实验的平均值±SD*p＜0.05。

因为γ-谷氨酰氨基酸是氨基酸运输到细胞的中间产物，通过γ-谷胺酰环转移酶转化为各自的氨基酸，²⁴我们分析了四种γ-谷氨酰氨基酸的水平：γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰异亮氨酸、γ-谷氨酰苏氨酸和γ-谷氨酰缬氨酸。所有四种γ-谷氨酰氨基酸在第5天^−/−谷氨酰胺耗尽后6小时的MEF(图S3B). 谷氨酰胺缺乏6小时后，几种代谢物的水平也发生了变化，但其中一些变化在饥饿24小时后才有统计学意义。例如，WT和第5天^−/−谷氨酰胺耗尽后，MEF显示丙酮酸和TCA循环中间产物（包括富马酸、苹果酸和柠檬酸）水平降低(图4C-F). 这些减少伴随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的增加⁺) (图4G)TCA循环的氢受体。有趣的是，NAD⁺水平较高第5天^−/−6小时的MEF比6小时的WT MEF(图4G).

谷氨酰胺对细胞增殖和维持细胞ATP和核苷酸水平至关重要

在这些变化中，我们进一步重点研究了ATG5的存在与否是否影响谷氨酰胺饥饿条件下的细胞增殖和ATP生成，以了解ATG5依赖性代谢的本质并探索其潜在机制。我们首先评估了WT和第5天^−/−MEF公司。正如我们从中发现的较低谷氨酰胺水平预测的那样第5天^−/−MEF与WT MEF相比，检测到的ATP水平第5天^−/−MEF细胞也低于WT细胞，并且两种细胞系中的ATP水平在细胞外谷氨酰胺耗尽后下降(图5A，左侧面板）。糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）的治疗导致WT MEF中细胞ATP的显著降低(图5A，右图），这是因为葡萄糖和谷氨酰胺是细胞生长和增殖所需的主要营养素。然而，2-DG在atg5型^−/−MEF公司。添加甲基丙酮酸（一种膜渗透性代谢中间体）可以部分延缓谷氨酰胺保护的WT MEF中ATP的减少，但饥饿的WT ME中没有第5天^−/−MEF公司(图5A，左面板与中面板）。与在全培养基中生长的细胞相比，谷氨酰胺剥夺抑制了WT和第5天^−/−MEFs，2-DG治疗也是如此(图S4A)这表明ATG5依赖性自噬不能支持细胞增殖，而对谷氨酰胺可用性或葡萄糖利用的限制延长了。

我们怀疑抗氧化剂谷胱甘肽水平的降低（氧化和还原）可能是谷氨酰胺饥饿抑制细胞增殖的原因第5天^−/−和WT电池(图1C，下部面板）。为了测试这种可能性，我们补充了WT和第5天^−/−含N-乙酰半胱氨酸（NAC）（谷胱甘肽的前体）的谷氨酰胺衍生MEF。此外，我们评估了谷氨酰胺酶生成的α-酮戊二酸（TCA循环的关键中间产物）在通过补充α-酮戊二酸的膜透性形式二甲基-2-酮戊二酸酯（DM-2-KG）支持细胞增殖中的作用。虽然与未经处理的WT细胞相比，添加NAC或DM-2-KG可以减少谷氨酰胺缺乏条件下的细胞死亡，但NAC和DM-2-KG的组合可以在功能上替代谷氨酰胺，有效地挽救细胞增殖(图5B). 使用实时生长监测系统在m5-7细胞中进一步证实了这些观察结果。尽管细胞生长不受添加Dox以关闭全培养基中ATG5表达的影响(图5C（右面板），Dox-未经治疗的“ATG5-on”m5-7细胞比Dox-处理的“ATG-off”m5-7cells增殖更好，尽管当谷氨酰胺耗尽时要慢得多(图5C，左侧面板）。一直以来，NAC治疗部分挽救了谷氨酰胺受限细胞的增殖，与Dox治疗/ATG5表达无关。综上所述，这些数据表明，尽管生成ATP和其他大分子需要谷氨酰胺，但通过补充NAC来保持足够还原的谷胱甘肽水平是有益的。

为了进一步评估ATP和核苷酸在谷氨酰胺缺乏期间维持细胞增殖的个别作用，我们检测了WT和第5天^−/−MEF细胞在有无联合补充剂的情况下遭受谷氨酰胺饥饿。细胞增殖试验表明，停药后6小时和24小时补充谷氨酰胺，但48小时不补充谷氨酰胺可以挽救WT和第5天^−/−MEF公司(图S3B). 然而，添加甲基丙酮酸或/和脱氧核苷一磷酸或脱氧核苷三磷酸未能引起类似反应。由于谷氨酰胺饥饿24小时后用谷氨酰胺重建可以挽救WT和第5天^−/−我们得出结论，谷氨酰胺饥饿诱导的细胞增殖抑制在24小时内是可逆的，与ATG5环境无关(图S4B).

最后，我们测试了第5天^−/−用于增殖的细胞与WT细胞所需的浓度不同。异步WT和第5天^−/−细胞在正常生长培养基（4 mM谷氨酰胺）、中等浓度谷氨酰胺（3、2和1 mM谷氨酸）和无谷氨酰胺培养基中培养。所有培养基都补充了25 mM葡萄糖，并对所有细胞培养进行了长达72小时的随访第5天^−/−细胞在1 mM谷氨酰胺中培养时观察到，WT细胞在0 mM谷氨酸中培养时也观察到（数据未显示），这表明atg5型^−/−细胞增殖需要比WT细胞更高浓度的谷氨酰胺。我们进一步以0.1 mM的增量滴定细胞培养基中0至1 mM的谷氨酰胺浓度。我们的结果表明，0.5 mM谷氨酰胺足以支持WT，但不能第5天^−/−MEF细胞增殖(图5D).

ATG5缺乏和谷氨酰胺缺乏对线粒体氧化磷酸化的调节

根据减少的TCA循环中间产物和第5天^−/−细胞与WT细胞的比较(图4C-E和​和5A），第5页)我们推测，谷氨酰胺保护细胞增殖受阻的一个可能原因是线粒体功能的干扰。为了测试在完全培养基和谷氨酰胺缺乏培养基下，自噬缺陷是否也会导致线粒体呼吸受损，用解偶联剂[对三氟甲氧基羰基氰化物苯腙（FCCP）]和不加解偶联剂的情况下检测耗氧量（OCR），以评估剩余呼吸能力（SRC），²⁵它是细胞生物能量功能潜在储备能力的指标，使用上述实验装置(图5D).²⁶在0.5 mM谷氨酰胺条件下，具有自噬能力的WT细胞显示出明显的OCR，FCCP升高了OCR(图6A). 因此，自噬活性细胞有效地调节线粒体呼吸以满足ATP需求和底物可用性。相反，第5天^−/−细胞显示OCR水平降低，在0.5 mM谷氨酰胺下FCCP反应减弱。因此，自噬缺陷第5天^−/−当谷氨酰胺的可用性降低到0.5 mM时，细胞线粒体呼吸功能基本受损(图6A).

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图6。自噬缺陷和谷氨酰胺限制对线粒体功能的类似影响。(A类)WT和atg5型^−/−使用海马细胞外通量（XF-24）分析仪在NAC（10 mM）存在或不存在的情况下，测定维持在不同谷氨酰胺浓度（0.5和4 mM）下的MEF。依次添加寡霉素（5μg/ml）、FCCP（1μM）和鱼藤酮（1μM）以测定线粒体功能。追踪显示，WT MEF和自噬受损MEF在不同谷氨酰胺浓度下保持着不同的基础OCR（上面板），并且在与细胞数量标准化后对NAC添加的不同反应（下面板）。(B)NAC刺激OCR第5天^−/−MEF维持在0.5 mM谷氨酰胺。条形图表示三个独立实验的平均值±标准差。使用双尾Student t检验计算统计显著性*p<0.01

我们的数据表明，补充抗氧化剂NAC可以克服谷氨酰胺缺乏诱导的细胞死亡(图5B). 我们假设添加NAC可以通过以下方式改善耗氧量第5天^−/−谷氨酰胺缺乏的细胞。WT和WT基础耗氧量的比较第5天^−/−细胞显示，NAC的添加改善了谷氨酰胺生成的线粒体氧化磷酸化第5天^−/−单元格(图6A，下部面板，总结于图6B). 综上所述，我们的结果表明，自噬缺陷细胞中的活性氧（ROS）水平高于自噬活性细胞，并且可能在谷氨酰胺缺乏时干扰正常的线粒体功能。此外，尽管细胞内ATP下降(图5A)可能是由于ATP利用率增加第5天^−/−MEF细胞的耗氧率研究结果表明情况并非如此。

ATG5缺乏和谷氨酰胺限制对基因表达的调节

识别受附件5敲除或谷氨酰胺限制，我们分析了参与TCA循环和谷氨酰胺代谢及转运途径的关键酶在WT和第5天^−/−对MEFs进行谷氨酰胺限制（0.5mM）6和24小时(图7). 在20个选择的转录本中，定量RT-PCR分析显示附件5淘汰赛导致Aco1公司,铯,Flnb公司,奥格德,苏格拉·斯达2,Gpt2公司,同上1和Myc公司mRNA水平和Ldhb公司mRNA水平(图7A). 转录水平的平行变化Gpt2公司,甲1,奥格德,苏格拉2,Slc1a5系列和Slc3a2系列WT和第5天^−/−观察到谷氨酰胺限制时间过程中的MEF(图7A). 相反，我们注意到Aco1、Flnb,同上1/2和Ldhb公司WT和第5天^−/−谷氨酰胺限制延长的细胞（0.5 mM，24小时）(图7A). 结合我们的观察结果，谷氨酰胺缺乏6小时后，WT MEF中观察到的许多代谢参数与第5天^−/−MEF保存在全介质中(图1——三)，我们假设ATG5缺乏会激活一些与WT MEF中激活的调节通路相同的调节通路，以响应谷氨酰胺限制或剥夺。

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图7。谷氨酰胺和自噬重编程转录水平。(A类)谷氨酰胺减少调节选定的基因表达。WT和第5天^−/−将MEF接种在完整培养基中，在处理当天达到50%的融合，然后在RNA分离之前的指定时间段内，在添加或不添加谷氨酰胺的血清DMEM中生长。如材料和方法中所述进行RNA分离和通路聚焦定量RT-PCR分析。将WT MEF（0 h）中的每个转录水平归一化为Gapdh公司，被设置为1。结果显示为三个独立实验的平均值±SD*p＜0.05。Aco1公司,乌头糖1;铯,柠檬酸合成酶;Flnb公司,富马酸水合酶1;Gapdh公司,3-磷酸甘油醛脱氢酶;Gpt2公司,谷氨酸丙酮酸转氨酶;同上1/2,异柠檬酸脱氢酶1/2;Mdh1公司,苹果酸脱氢酶1;甲1/2,苹果酸酶1/2;Myc公司,骨髓细胞瘤病癌基因;奥格德,酮戊二酸脱氢酶;斯达,屋檐的拮据,复合体;Slc7a5系列,阳离子氨基酸转运体;Slc1a5系列,中性氨基酸转运蛋白;Slc3a2系列,二元和中性氨基酸转运激活剂;Slc7a5系列,阳离子氨基酸转运蛋白;Suclg1号机组,Suclg2号机组,苏格拉2,琥珀酸-CoA连接酶. (B)我们提出的模型说明了自噬、谷氨酰胺利用和TCA循环之间的串扰。通过定量RT-PCR分析研究的TCA循环和谷氨酰胺代谢中编码酶的mRNA被装箱。(C类)谷氨酰胺限制诱导Cdkn1a型(第21页）和Bbc3（美洲狮）中的表达式附件5^−/−，但不是WT MEF。来自的mRNA对(A类)用于测定促细胞周期阻滞基因的转录水平(Cdkn1a型)和促凋亡调节因子(Pmaip1号机组和英国广播公司3).

为了进一步探讨自噬在应对代谢应激中的作用，WT和第5天^−/−细胞受到谷氨酰胺限制（0.5 mM，持续6小时和24小时），基因的mRNA水平包括促停搏和促凋亡调节因子，如Pmaip1号机组(诺克斯),英国广播公司3(彪马)和Cdkn1a型(第21页)，通过定量RT-PCR进行分析。这三个基因在第5天^−/−谷氨酰胺限制前的细胞(图7C)和Cdkn1a型和Pmaip1号机组转录水平在早期时间点（6小时）迅速诱导，但长期饥饿（24小时）显著降低了转录水平第5天^−/−MEF公司。相反，在0.5 mM谷氨酰胺的WT MEF中，未观察到0.5 mM的谷氨酰胺诱导的促停搏和促凋亡调节因子上调，这支持了自噬在保护细胞抵抗代谢应激中发挥重要作用的假设。综上所述，数据表明自噬和谷氨酰胺选择性地调节代谢、促停搏和促凋亡调节因子转录水平的变化。

细胞增殖试验

约5000 WT和第5天^−/−MEF被植入96个well板或16个E板（ACEA、Roche、DC-16-B-NT）中，并在第1天达到5%的汇合。第2天，将培养基（100µl）切换为DMEM与指示的谷氨酰胺补充剂以及10%牛生长血清、dNMP、dNTPs、甲基丙酮酸、NAC和DM-2-KG的组合。用两种不同的方法测量细胞增殖。首先，使用RTCA DP分析仪（ACEA，Roche）使用16×E板实时监测细胞生长。其次，使用CellTiter 96在指定的培养基后切换期结束时进行MTS分析^®水溶液试剂（20µl，Promega，G3580）。培养后，测量490 nm处的吸光度以计算相对增殖，其表示为三个独立实验的平均值±标准偏差（S.D.），每个实验重复进行。

耗氧量（OCR）

使用Seahorse Bioscience XF24细胞外通量分析仪测量细胞线粒体功能。通过连续注射寡霉素（ATP合酶抑制剂；Sigma 75351）、FCCP（羰基氰化物对（三氟甲氧基）苯腙）、线粒体氧化磷酸化原核和解偶联剂；SigmaC2920]和鱼藤酮（线粒体复合物I抑制剂；Sigram R8875）来测定线粒体功能，以确定基础OCR，与ATP相关的OCR、质子泄漏、最大呼吸容量、储备呼吸容量和非线粒体耗氧量，均符合制造商的说明。其中，基础OCR用于表示线粒体的功能⁴将细胞接种到24孔板中，培养过夜，然后依次添加预先优化浓度的寡霉素、FCCP和鱼藤酮。用1ml海马缓冲液（不含含葡萄糖（4.5 g/l）、丙酮酸钠（1 mM）和谷氨酰胺（0.5 mM）的酚红DMEM培养基）洗涤细胞后，分别自动注入600μl海马缓冲溶液加60μl寡霉素（50μg/ml）、FCCP（10μM）和鱼藤酮（10μM）。在记录期结束时，对细胞进行裂解，并使用Bradford分析测定单个蛋白质浓度。OCR值在与蛋白质浓度标准化后计算，并绘制为平均值±SD。

ATP测定

ENLITEN公司^®根据制造商的说明使用ATP检测系统（Promega，FF2000）。WT和第5天^−/−在实验当天接种MEFs以达到50%的汇合，并且每个实验组重复生长。在指定的时间，对一组细胞进行胰蛋白酶化并用台盼蓝染色以确定细胞数量，用PBS（500μl）采集第二组细胞，然后根据制造商的建议将细胞悬浮液（400μl）添加到5%三氯乙酸（TCA，100μl）中。然后添加TRIS醋酸盐缓冲液（900μl，pH 7.75）以中和TCA溶液（100μl）并将TCA稀释至0.1%的最终浓度。然后将提取物进一步稀释为1:100，并添加到等量的rL/L试剂（Promega，FF2000）中，该试剂含有D-荧光素和重组荧光素酶，然后使用TD-30e光度计（特纳）测量发光。对ATP标准品（Promega，FF2000）进行连续稀释，以生成一条回归曲线，用于计算ATP分子的准确数量，然后除以细胞数，得出每个细胞的ATP分子数量。进行了三个独立的实验，用平均值±标准差表示。

全细胞裂解液的制备和western blot分析

细胞在含有或不含谷氨酰胺的DMEM中生长，并补充10%的牛生长血清或厄尔平衡盐溶液（EBSS；Sigma，E3024），维持指定的时间段。为了检测MAP1LC3-I和MAP1LC3-II，使用裂解缓冲液（20 mM Tris-HCL，pH 7.4，150 mM NaCl，1%Triton X-100）和完整蛋白酶抑制剂混合物（Roche，11836145001）制备全细胞提取物（WCE）。然后将WCE与等量的SDS加载缓冲液混合并煮沸3分钟。然后用SDS-PAGE分离WCE，然后用抗体进行免疫印迹：抗MAP1LC3-I/II（医学和生物实验室，M115-3）、抗SQSTM1（美国研究产品，03-GP62-C）、抗磷酸-PRKAA2（Thr172；细胞信号，2535）、，抗PRKAA2（细胞信号，2532）、抗磷酸化-MTOR（Ser2448；细胞信号，2971）、抗MTOR（Cell Signaling，2983）、抗磷化-RPS6KB2（Ser371；Cell Signoaling，9208）、抗RPS6KB2抗体。免疫印迹通过用增强化学发光检测试剂盒（ECL Plus，Amersham Biosciences，RPN2132）染色和使用VersaDoc 5000成像系统（Bio-Rad）检测来可视化。使用Quantity One软件（Bio-Read）捕获图像的密度追踪并量化。单个样本中的期望信号被归一化为ACTB（肌动蛋白）对照。实验样品中的相对蛋白质水平根据未处理样品集的标准化蛋白质水平计算，如1所示。

全球代谢分析

用于此分析的非靶向代谢谱分析平台结合了三个独立的平台：超高效液相色谱/串联质谱（UHPLC/MS/MS²)针对基本物种进行优化，UHPLC/MS/MS²针对酸性物质和气相色谱/质谱（GC/MS）进行了优化。WT和第5天^−/−MEF（五个重复，三个独立实验）在补充有10%牛生长血清的谷氨酰胺缺乏DMEM中培养0、6和24小时，以在收获前达到50%的融合。简单地说，等号（3×10⁶)WT和第5天^−/−MEF的处理如前所述。^50,53细胞在固定的最小体积水中均质，并取出100μl用于后续分析。使用自动液体处理器（Hamilton LabStar），用甲醇从均质细胞中沉淀蛋白质，甲醇中含有四种用于报告萃取效率的标准。将产生的上清液分成等分，在三个平台上进行分析。对于两个UHPLC/MS/MS，在氮气下干燥并真空干燥的小份样品随后在0.1%甲酸水溶液（50μl，酸性条件）或6.5 mM碳酸氢铵水溶液（pH 8（50μl，碱性条件）中重新配制²使用等量的双三甲基硅三氟乙酰胺和乙腈：二氯甲烷：环己烷（5:4:1）与5%三乙胺的溶剂混合物，在60°C下分析或衍生至最终体积为50μl的GC/MS分析，持续1小时。此外，结合实验样品分析了三种类型的对照：从汇集的实验样品中生成的样品作为整个数据集的技术复制品，提取的水样作为工艺空白，在每一个分析样本中加入一杯标准鸡尾酒，可以对仪器性能进行监测。实验样本和对照品在为期一天的平台运行中随机分配。

对于UHPLC/MS/MS²分析中，使用Waters Acquity UPLC（Waters）分离等分样品，并使用LTQ质谱仪（Thermo Fisher Scientific，Inc.）进行分析，该质谱仪由电喷雾电离源和线性离子阱质谱仪组成。MS仪器扫描99–1000米/z并在MS和MS之间交替²使用动态排除进行扫描，每秒大约6次扫描。GC/MS的衍生样品在5%苯基二甲基硅氧烷柱上分离，氦气作为载气，温度从60°C上升到340°C，然后在Thermo Finnigan Trace DSQ MS（Thermo Fisher Scientific，Inc.）上分析以单位质量分辨率运行，电子碰撞电离，原子质量单位扫描范围为50-750。

通过将实验样品中的离子特征与包括保留时间、分子量在内的化学标准条目参考库进行自动比较，确定代谢物(米/z)优选加合物和源片段以及相关MS光谱，并使用Metabolon开发的软件通过目视检查进行质量控制。⁵⁴

介质生物剖面和细胞谷氨酰胺测量

m5-7细胞（5×10⁵)在有或无多西环素（Dox，20μg/ml；Sigma，D9891）的6孔培养板中培养，并去除谷氨酰胺0、6和24小时⁺和K⁺然后使用BioProfile 100 Plus（Nova Biomedical Corporation）测量培养基中的含量。使用EnzyChromTM谷氨酰胺检测试剂盒（BioAssay Systems）测量细胞内谷氨酰胺水平。通过台盼蓝排除试验测定细胞数，以进行归一化。

定量RT-PCR分析

根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒进行RNA分离。（Qiagen，74104），并使用iScript逆转录为cDNA^TM（TM）cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，170-8891）。合成cDNA和iQ^TM（TM）SYBR公司^®混合Green Supermix（Bio-Rad，170-8882），以便在iQ上进行后续定量实时PCR^TM（TM）单色实时PCR检测系统（Bio-Rad）。PCR程序包括一个95°C循环3分钟，然后是多达40个95°C循环15秒和55°C循环45秒。反应完成后，使用解离曲线确认扩增子特异性。底漆对铯,Aco公司,奥格德,Suclg1号机组,Suclg2号机组,苏格拉2,斯达,屋檐的拮据,Flnb公司,Mdh1公司,同上1,同上2,Gpt2公司,Ldhb公司,甲1,甲烷,Myc公司,Slc7a5系列,Slc1a5系列,Slc3a2系列和Gapdh公司如所示表S2.基因的转录水平标准化为Gapdh公司并使用∆C进行计算_T型公式如下：相对表达式=2^-∆CT，式中∆C_T型=C_T型（基因）−C_T型(Gapdh公司).

荧光显微镜分析

用mRFP-GFP-LC3瞬时转染维持的m5-7细胞，并在有或无Dox的情况下，在完全培养基中培养，或用EBSS、2-DG或谷氨酰胺耗尽培养基处理6和24小时。然后将细胞固定在3.7%多聚甲醛中（Sigma，P6148）并使用Olympus IX81倒置荧光显微镜进行检查。使用蔡司LSM图像浏览器软件采集并保存荧光图像。

通过荧光激活细胞分选仪（FACS）分析测量GFP-LC3强度

在谷氨酰胺耗尽前一天，将稳定表达GFP-LC3的WT-MEF细胞亚融合接种到6孔板中。在指定的处理期后，用胰蛋白酶/EDTA收集细胞，用PBS洗涤，并进行FACS。1×10分析⁵细胞/样品由CyAnTM ADP 9彩色流式细胞仪（DAKO；希望城医疗中心分析细胞测定核心设施）进行检测，活细胞计数由FlowJo软件（Tree Star，Inc.）绘制为GFP荧光强度。将每个处理样品中的GFP荧光强度水平归一化为静息状态下的对照组水平，载体处理的对照组设置为100%。每个处理中GFP-LC3强度的相对水平由至少三个独立实验计算得出。

我们衷心感谢刘志平博士、拉玛·娜塔拉詹博士、郭美玲博士、李保罗博士、魏佳博士和亨利·福曼博士对手稿提出的有益建议和批判性阅读。这项工作得到了国家卫生研究院拨款R01DE10742和R01DE14183（给D.K.A.）、Nesvig基金会拨款奖（给D.K1.A.和M.K.）、希望之城妇女癌症项目奖（给Y.-R.C.）和国家科学委员会（台湾）拨款NSC97-2917-I-002-101（给T.-C.L.）的部分支持。我们还感谢孙桂华博士进行了热图分析，感谢安实验室成员进行了有益的讨论，感谢赵颖茵和迈克尔·里德博士的技术援助，感谢玛格丽特·摩根博士和基莉·沃克博士的编辑。