晶体学报第F节结构生物晶体通讯。2013年6月1日;69(第6部分):592-596。
晶体控制工程,以获得适合于配体浸泡实验的人类Keap1 Kelch结构域的晶体形式
,a、,* ,一 ,一 ,一和一
斯特凡·霍勒
一德国Biberach,88400,Birkendorferstrasse 65,Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co.KG,铅识别和优化支持部
德克·雷内特
一德国Biberach,88400,Birkendorferstrasse 65,Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co.KG,铅识别和优化支持部
卡贾·奥斯特曼
一德国Biberach,88400,Birkendorferstrasse 65,Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co.KG,铅识别和优化支持部
伊维特·霍夫尔斯
一德国Biberach,88400,Birkendorferstrasse 65,Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co.KG,铅识别和优化支持部
赫伯特·纳尔
一勃林格殷格翰制药有限公司,德国比伯拉赫,伯肯多夫大街65号,88400号,铅识别和优化支持部
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2012年12月20日收到;2013年4月24日验收。
- 补充资料
PDB参考:Keap1,E540A/E542A突变,3zgd
人类Keap1蛋白Kelch结构域的突变体已被设计用于浸泡小分子配体。该突变体的载脂蛋白结构以1.98μ的分辨率报道,晶体系统的适用性已通过突变的Keap1-Kelch结构域与Nrf2衍生的环状肽复合物的结构来证明。
关键词:Keap1、Kelch、晶体触点
摘要
Keap1是Cul3依赖的泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白,在细胞对氧化应激的反应中起重要作用。它将Nrf2与其Kelch结构域结合,从而触发Nrf2的泛素化和降解。氧化应激可阻止Nrf2的降解,并导致细胞保护基因的激活。因此,Keap1是一种很有吸引力的治疗炎症疾病的药物靶点。通过结构研究支持药物化学研究需要一个坚固的结晶系统,其中晶体最好适合进行浸泡实验。这有助于以常规和高通量的方式生成蛋白质-配体复合物。人类Keap1的结构已在前面描述过。然而,在这种晶体形式中,Nrf2的结合位点被晶体接触阻断。分析了这种相互作用,并引入突变来破坏这种晶体接触。一个双突变(E540A/E542A)以新的晶体形式结晶,其中Nrf2的结合位点未被阻断,可被小分子配体所利用。报道了突变的Keap1-Kelch结构域的载脂蛋白形式(1.98μl分辨率)和通过浸泡获得的Nrf2衍生肽的配合物(2.20°分辨率)的晶体结构。
关键词:Keap1、Kelch、晶体触点
1.简介
Cullin–RING泛素连接酶复合物是真核生物中最大的多亚单位E3连接酶家族(Zimmerman等。, 2010▶). 特异性是通过大量的衔接蛋白和底物结合蛋白实现的。Keap1是底物结合蛋白之一,由几个结构域组成:与Cul3相互作用的N末端BTB结构域、包含氧化敏感性半胱氨酸残基的干预区域(IVR)和与底物Nrf2结合的C末端Kelch结构域。在对氧化应激的反应中,IVR中半胱氨酸的修饰导致构象改变,从而阻止Nrf2的泛素化。Nrf2转位到细胞核并诱导细胞保护基因。Tong提出的模型等。(2007▶)提出两个Keap1蛋白二聚通过BTB结构域和该复合体中的两个Kelch结构域识别出Nrf2 N末端的两个不同位点,从而固定了Nrf2在泛素连接酶复合体内的取向。Nrf2上的这两个结合位点对Keap1的结合亲和力相差200倍。人类Keap1-Kelch结构域的结构已被描述为apo形式(Beamer等。, 2005▶; 锂等。, 2004▶; PDB条目1千克和1 u6天)并且与包含Nrf2的高亲和力结合位点的肽复合(Lo等。, 2006▶; PDB条目2平方英尺). 利用小鼠(Tong)的Keap1对低亲和力结合位点进行了结构表征等。, 2007▶; PDB条目第2天). 人类Keap1的任何晶体形式都不能用小分子配体浸泡,因为结合部位要么被晶体接触物(以载脂蛋白形式)占据,要么被Nrf2衍生肽占据,后者以高亲和力结合,而且自身也参与晶体接触。我们分析了Nrf2结合位点的晶体接触,并设计了几个突变来破坏这种晶体接触。其中一个结构体(E540A/E542A)在不同条件下结晶为野生型蛋白质,结构测定显示了不同的晶体形式,其中不对称单元中两个晶体学独立的原聚体之一具有可访问的Nrf2结合位点。
2.方法
2.1. 克隆、诱变、表达和纯化
使用Nde公司我和巴姆HI限制位点获得带有N末端六组氨酸标记的构建物。使用QuikChange多位点定向突变试剂盒(Stratagene),以序列5′-GCGCTAGTGTGGCAAGCGACGAGAGGTGGACTTTCG-3′为引物进行突变,获得两个突变E540A和E542A。该蛋白表达于大肠杆菌在303 K温度下培养BL21(DE3)pLysS细胞。通过离心收集细胞,再悬浮20 mM(M)Tris–HCl,500米M(M)氯化钠,5米M(M)pH值为7.9的咪唑,并被超声波破坏。将清除的裂解液加载到具有5 ml床层体积的Ni–NTA柱(Qiagen)上。用5 ml 20 m清洗柱五次M(M)Tris–HCl,500米M(M)氯化钠,20米M(M)pH 7.9的咪唑,用20 m洗脱M(M)Tris–HCl,500米M(M)氯化钠,250米M(M)咪唑,pH 7.9。透析至20m后M(M)Tris,2米M(M)EDTA,5米M(M)DTT pH 7.9,将蛋白质加载到5 ml HiTra Q HP柱上(GE Healthcare),并用0到0.5的线性梯度洗脱M(M)NaCl超过五个柱体积。蛋白质在250米处洗脱M(M)氯化钠。在结晶之前,将含有Keap1的馏分混合并脱盐。典型产量为每升表达培养基5毫克。
2.2. 结晶和数据收集
使用SaltRx屏幕(Hampton Research)在包含4.0的条件下发现初始水晶点击M(M)醋酸铵,0.1M(M)三水合乙酸钠pH为4.6。使用添加剂筛选(Hampton Research)对该条件进行精制。蛋白质浓度为9.5 mg ml时,最佳晶体在10天内生长−1使用0.01M(M)牛磺酸,0.01M(M)氯化镍、4%γ-丁内酯或0.025%二氯甲烷作为添加剂。本研究中使用的Nrf2衍生肽由人类Nrf2的77-82残基组成,该残基被额外的甘氨酸残基(cycloGD)环化77EETGE公司82; 赛默飞世尔)。将晶体转移到含有结晶贮存器缓冲液和浓度为1 mg ml的肽的溶液中−1然后将晶体在液氮中闪蒸冷却2小时。晶体实验在瑞士维利根Paul Scherrer研究所瑞士光源的X06SA光束线上进行。使用处理数据XDS公司(卡布施,2010年▶)和SCALA公司(埃文斯,2006年▶)在APRV型(克罗默等。, 2004▶).
2.3. 结构解决和细化
Keap1-Kelch结构域的载脂蛋白形式的结构通过用相位器(麦考伊等。, 2007▶)使用PDB条目1 u6天(李等。, 2004▶)作为起始模型,并使用自动BUSTER(布里科涅等。, 2011▶). 模型构建使用库特(埃姆斯利等。, 2010▶). 最终的模型由两个具有570个残基和668个水分子的原生质体组成。此外,结晶缓冲液中存在的十个醋酸盐分子和一个钠离子在电子密度中可见,并被纳入最终模型。这份手稿中的氨基酸编号是根据完整的Keap1蛋白。组成组氨酸标签的蛋白质的前25个残基、凝血酶裂解位点和Kelch结构域的残基321-324在电子密度图中不可见。四条侧链没有很好的定义,它们的占用率被降低和改进。两条侧链以两种构象建模。Keap1–Nrf2肽复合物的结构用差分傅里叶方法测定。手动调整模型时使用库特(埃姆斯利等。, 2010▶). 最终模型的质量通过摩尔概率(陈)等。, 2010▶). 98%的残留物位于Ramachandran图的有利区域,没有异常值。表1给出了数据收集和细化统计数据.
表1
| 阿波·基阿1 | Keap1–Nrf2(77–82) |
---|
数据收集 |
波长(Ω) | 1.002 | 0.979 |
“空间”组 |
P(P)212121
|
P(P)212121
|
单位-细胞参数(Ω) |
一= 75.72,b= 75.77,c(c)= 202.04 |
一= 76.10,b= 76.06,c(c)= 207.54 |
每个不对称单元的分子数 | 2 | 2 |
分辨率(Ω) | 38.00–1.98 (2.08–1.98) | 76.88–2.20 (2.27–2.20) |
马赛克风格(XDS公司) (°) | 0.2 | 0.13 |
观察次数 | 534488 (77292) | 249285 (22520) |
独特反射次数 | 82414 (11878) | 61950 (5482) |
多重性 | 6.5 (6.5) | 4.0 (4.1) |
R(右)
合并(%) | 5.2(48.4) | 10.1(49.5) |
平均值我/σ(我) | 22.9 (3.4) | 14.1 (2.9) |
完整性(%) | 100 (100) | 99.8 (99.9) |
精炼统计(自动总线) |
分辨率范围(Ω) | 37.86–1.98 | 40.00–2.20 |
R(右)
晶体
†(%) | 16.4 | 17.2 |
R(右)
自由的
†(%) | 18.1 | 18.8 |
R.m.s.d.,粘结距离(Ω) | 0.008 | 0.008 |
R.m.s.d.,粘结角(°) | 0.98 | 1.02 |
不对称单元中非H原子总数 | 5100 | 5012 |
溶剂分子数量 | 679 | 560 |
B类Wilson图中的值(2) | 42.4 | 44.6 |
平均B类值,蛋白质(2) | 44.8 | 40.6 |
平均B类溶剂值(Ω2) | 55.3 | 50.8 |
3.结果
3.1. 总体结构
Keap1-Kelch结构域形成了一个六叶β螺旋桨,每个叶片中有四条β链。遵循Beamer的符号等。(2005年▶),与Nrf2的相互作用位于结构的“底部”侧。这个结合部位是由两个同心圆环构成的。由叶片间D–A环形成的内环形成结合部位的底部,而由B–C环组成的外环形成结合位点的边缘。第二个叶片的B–C环(残基378–394)比其他B–C循环长四个氨基酸,并形成一个额外的反平行β片(图1).
Keap1-Kelch域的体系结构。高度对称β螺旋桨的六个独立叶片(灰色缎带)通过叶片间A–D环(红色)连接;B–C回路为橙色。Nrf2结合位点由叶片间A–D环和B–C环形成。插入第二个叶片B–C环的小β片为蓝色。所有图形都是使用创建的PyMOL公司(薛定谔)。
3.1.1. E540A/E542A双突变体和野生型蛋白的结构比较
E540A/E542A双突变体的结构与野生型蛋白质的高分辨率结构(Beamer等。, 2005▶; PDB条目1千克). 1739个排列原子的r.m.s.d.为0.26Ω。唯一值得注意的变化是在第二个叶片内的B–C回路尖端(残留物385)。该回路涉及不同的晶体接触,因此偏移2.6º。
3.1.2. E540A/E542A双突变体和野生型蛋白质晶体堆积的差异
在野生型形式中,Keap1-Kelch结构域结晶为每个不对称单元一个分子。β螺旋桨第五叶片的C–D环与相邻分子Nrf2结合囊中的残留物之间形成晶体接触。这两个分子以“自上而下”的方式相互作用,其中晶体二聚体的两个Nrf2-结合囊被阻断(图2
b). Glu540与Arg415形成盐桥,与四个水分子形成氢键。其中一个水分子连接Glu540和Ser602。Glu542与Arg380和Arg415形成双齿盐桥,并与六个水分子形成氢键。这两个残基形成的氢键网络几乎涉及Nrf2结合囊中的所有水分子。
晶体填料的比较(一)与Nrf2衍生肽复合的野生型Keap1-Kelch结构域(PDB条目2平方英尺; Lo(低)等。, 2006▶)(b)未标记Keap1(PDB条目1千克; 横梁等。, 2005▶)和(c(c))E540A/E542A双突变体。单体中残留540和542A类和B类分别显示为红色和橙色球体。野生型Keap1阻断Nrf2结合位点的通路(b)并在E540A/E542A双突变体的两个原聚体中的一个中游离(c(c)). 这个结合位点被环状肽占据。
与野生型晶体形式相反,E540A/E542A双突变体的两个原体占据了晶体的不对称单元。两个分子(注释A类和B类)使用三个不同的交互站点,以“自下而上”的方式进行交互。第一个由分子的第二个β螺旋桨叶片的长B–C环组成A类占据邻近分子的Nrf2结合囊B类Asp385与Gln530和Ser555相互作用,Arg415、Asn387的羰基和Thr388的侧链与Arg483相互作用。此外,Nrf2结合囊中的水分子介导了额外的接触。第二次接触是Cys434之间的分子间二硫键桥,位于两个分子的第三个叶片的B–C环内。第三次接触是由第六片分子的B–C环进行的A类分子的第二个β螺旋桨叶片的B–C环B类His575与Asp385形成氢键。由此产生的非晶体学二聚体显示出不适当的局部对称性,导致分子的Nrf2结合囊A类未被占用且可接触到小分子(图2
c(c)).
3.1.3. 载脂蛋白结构与Keap1–Nrf2肽复合物的比较
Keap1 apo蛋白的整体结构与Keap1–Nrf2肽复合物的结构非常相似(图3). C上的r.m.s.dα链的原子数为0.20ºA类链条为0.15ºB类主要变化是链条的刚性运动B类相对于链条A类,可以描述为围绕二硫键连接链的区域旋转6°A类和B类这导致不对称单位含量的伸长约2º,从而导致c(c)轴从202.0°到207.5°。进一步的变化发生在Nrf2结合位点,其中侧链由于肽相互作用而移动。Arg415移动以避免与来自Nrf2的Thr80发生冲突,并与Glu79形成盐桥。Arg380的侧链移动到Glu82形成盐桥。Tyr572从空腔中心向外移动1.6°,以达到与Glu78形成水介导氢键的最佳距离。对于Glu530也观察到了同样的现象,它与Glu78的羰基O原子形成氢键。Nrf2肽的所有侧链都是有序的,并且在电子密度上是可见的。本研究中使用的肽的结合模式与Lo和同事报告的结合模式一致(PDB条目2型流感; Lo(低)等。, 2006▶). Glu79的侧链构象存在差异。最大的Cα可以看出Asp77和Glu78的偏差(1.5º)。这可能是由于我们的肽具有循环性质,它与PDB入口中的线性肽不具有相同的构象自由度2平方英尺(A)69FFAQLQLDEETGEFL公司84). 在Keap1与本文所述的环状肽的复合物结构中,Glu78的侧链在电子密度中定义良好,这与Keap1在与线性肽复合物中的结构形成对比,尽管其分辨率较高(1.5º比2.2º)。这可能是由额外的水介导晶体接触引起的。
Nrf2衍生肽环GD复合物中Keap1-Kelch结构域的结构77EETGE公司82. (一)显示首字母F类
o个−F类
c(c)等高水平5.0σ处的密度。在(b)显示了与环状肽结合所涉及的极性接触。(c(c))描述了本研究中使用的环肽(灰色)和PDB条目中的线性肽的重叠2型流感(黄色)。
4.讨论
野生型Keap1-Kelch结构域中的两个谷氨酸残基突变为丙氨酸,以破坏阻碍Nrf2结合位点的晶体接触。突变的蛋白质不再以野生型晶体形式结晶,而是采用了一种新的晶体形式,其中两个分子占据晶体的不对称单元。在其中一个原生质体中,Nrf2结合位点是空的,可以被小的有机化合物利用。因此,这种E540A/E542A双突变体适合浸泡实验。这极大地促进了蛋白质-配体复合物结构的生成。通过求解Keap1-Kelch结构域与Nrf2衍生的环状肽复合物的结构,证明了这种晶体形式的适用性。将该肽浸泡在载脂蛋白晶体中,可以直接测定复合物的结构,而不会对晶体的质量产生重大影响。
补充材料
PDB参考:Keap1,E540A/E542A突变,3zgd
致谢
我们感谢瑞士光源蛋白质晶体学光束线的工作人员的大力支持。
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