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.2006年8月9日；25(15):3605-17.
doi:10.1038/sj.emboj.7601243。 Epub 2006年8月3日。

Keap1:Nrf2接口的结构提供了对Nrf2信号的机械洞察力

石清洛 1, 李旭初, 迈克尔·T·亨兹尔, 莱萨·J·比默, 马克·汉宁克
附属公司

Keap1:Nrf2接口的结构提供了对Nrf2信号的机械洞察力

Shih-Ching Lo公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

Keap1是一种BTB-Kelch底物适配器蛋白，调节Nrf2（一种bZIP转录因子）的稳态水平，以应对氧化应激。我们已经确定了Keap1的Kelch结构域的结构，该结构域与Nrf2中包含高度保守DxETGE基序的16肽结合。Nrf2肽包含两条短的反平行β链，由两条重叠的I型β-圈连接，由天冬氨酸和苏氨酸残基稳定。β-回转区位于Kelch结构域顶面上的结合囊中，谷氨酸残基与Keap1中高度保守的残基形成多重氢键。突变实验证实了单个氨基酸在Nrf2与Keap1结合以及Keap1介导的Nrf2依赖基因表达抑制中的作用。我们的结果提供了BTB-Kelch底物适配器蛋白如何与其同源底物结合的详细图片，并将有助于合理设计新型化学预防剂。

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数字

图1
图1
(A类)五种不同物种（人类、小鼠、斑马鱼、，黑腹果蝇、和冈比亚按蚊)图中显示了三种人类BTB-Kelch蛋白、mayven、gigaxonin和ENC1的序列。β螺旋桨结构的六个叶片显示在对准上方，组成每个叶片的四条β链（A–D）以灰色突出显示。叶片I的A链位于蛋白质的末端C末端。Keap1、神经轴突蛋白和ENC1蛋白的疾病相关突变用粗体（Bomont等, 2000, 2003; 布鲁诺等, 2004; 库伦巴默等, 2002; 梁等, 2004; 帕德马纳班等, 2006). 定义Kelch重复序列的高度保守残基用星号表示。Keap1中侧链与晶体结构中的Nrf2衍生肽接触的氨基酸以蓝色突出显示，而仅使范德瓦尔斯与Nrf2派生肽接触的那些氨基酸以绿色突出显示。(B类)图中显示了人类Nrf1和Nrf2蛋白的Neh2结构域，以及斑马鱼和D.黑腹果蝇显示了与Keap1结合有关的两个保守基序。DxETGE基序的谷氨酸残基以蓝色突出显示。显示了我们实验中使用的三个Nrf2衍生肽的序列。
图2
图2
(A类)将Keap1-CBD和HA-Nrf2表达载体以及甲壳素珠分离的Keap1:Nrf2复合物转染COS1细胞。将珠与所示肽孵育，清洗，并用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析与珠结合的蛋白质。添加到每个样品中的肽的量为10ng（泳道3、7、11）、100ng（泳道4、8、12）、1μg（泳道5、9、13）和10μg（泳道6、10、14）。(B类)（上面板）显示了代表性等温量热实验的热像图，其中用50μM肽滴定Kelch结构域的5μM溶液。（下面板）显示了四个实验的拟合结合等温线。通过将50μM肽溶液滴定到5μM Kelch结构域溶液中，进行了三个实验（圆形、方形和三角形）。第四个实验（钻石）是通过将88μM的肽溶液滴定为6.25μM的Kelch结构域溶液来进行的。
图3
图3
(A类)Kelchβ螺旋桨（红色）和结合Nrf2肽（黄色管）的带状图。肽的末端标记为N-ter和C-ter；Kelch域的叶片标记为N和C。β螺旋桨的六个叶片标记为I–VI，每个叶片中的四条β链标记为A–D（白色字体）叶片VI(B类)Kelch域侧视图，带β螺旋桨的表面表示。(C类)Kelch螺旋桨（灰色）和肽（黄色管）的表面表示。选定的残留物显示为蓝色（基本）、橙色（极性）和绿色（非极性）。
图4
图4
(A类)Nrf2肽侧链原子与Kelch结构域残基之间的接触。(B类)肽的主链原子和Kelch结构域残基之间的接触。(C类)Nrf2肽的棒状模型，突出显示分子内氢键。一个F类o个−F类c（c）肽附近2.5σ处的电子密度省略图以蓝色显示。在将肽纳入模型之前，在分子替换后立即确定图的相。E78的侧链在电子密度图中排列不整齐，显示为半透明。(天)示意图显示了Kelch结构域中相互作用残基与Nrf2肽（黄色/蓝色）的主链和侧链接触。
图5
图5
(A类)如图所示，用HA-Nrf2和突变Keap1蛋白的表达载体共转染COS1细胞。用抗HA和抗Keap1抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹分析（底部两个面板）。使用抗HA抗体对抗Keap1免疫沉淀物（IP）进行免疫印迹分析（顶面板）。(B类)如图所示，用HA-Nrf2（100 ng）和突变Keap1蛋白（50 ng）的表达载体转染MDA-MB-231细胞，并用ARE依赖的萤火虫荧光素酶报告基因构建物（100 ng。质粒编码雷尼利亚荧光素酶（10ng）作为转染效率的对照。所示数据表示三个独立实验结果的平均值和标准偏差。(C类)如图所示，用Keap1 CBD和突变HA-Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物（底部两个面板）。将裂解产物与甲壳素珠孵育、洗涤，并用抗HA抗体进行免疫印迹分析与甲壳质珠相关的蛋白质（顶面板）。一个星号(*)表示抗体检测到的非特异性蛋白质。(天)报告者分析如（B）所述。(E类)按（C）所述进行下拉分析。(F类)报告者分析按（B）所述进行。(G公司)如（A）所述进行共免疫沉淀测定，不同之处在于将Keap1和Nrf2表达载体分别转染到细胞中，并在输入量标准化至Nrf2水平后在免疫沉淀前混合细胞裂解物。(H（H）). 报告者分析按（B）所述进行。
图6
图6
(A类)用Keap1和Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗Keap1抗体和抗HA抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹分析（底部两个面板）。将等量的细胞裂解物与甲壳素珠孵育、洗涤，并使用抗HA和抗Keap1抗体进行免疫印迹分析与甲壳质珠相关的蛋白质（顶部两个面板）。(B类)用Keap1和Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗HA、抗Keap1和抗Gal4抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物（底部三个面板）。使用抗Gal4和抗Keap1抗体通过免疫印迹法分析抗-HA免疫沉淀物（前两个面板）。
图7
图7
(A类)将Keap1-CBD和HA-Nrf2表达载体以及甲壳素珠分离的Keap1:Nrf2复合物转染COS1细胞。将珠与所示肽孵育，清洗，并用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析与珠结合的蛋白质。添加到每个样品中的肽量为10 ng（3、7、11道）、100 ng（4、8、12道）、1μg（5、9、13道）和10μg（6、10、14道）。(B类)用Keap1和Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物（底部两个面板）。将等量的细胞裂解物与甲壳素珠孵育、洗涤，并使用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析与甲壳质珠相关的蛋白质（顶部两个面板）。(C类)报告者分析如图5B所示。
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