小化合物APR-246/PRIMA-1可挽救外胚层发育不良相关患者诱导的多能干细胞上皮分化受损^遇见

摘要

外胚层发育不良是一种罕见的综合征，其特征是皮肤和外胚层衍生物（如牙齿、头发、角膜和指甲）发育异常。在这些综合征中，一些与转录因子p63（TP63）的突变有关，并代表一组与口腔面部裂伤和肢体异常相关的常染色体显性外胚层发育不良。严重的表型第63页-null小鼠强调了p63在胚胎发育中的主要作用，特别是在外胚层谱系的发育中(1,2). 已检测到p63突变的五种综合征包括肛门直肠畸形、外胚层发育不良和唇腭裂综合征（EEC）、强直性脊柱炎、外胚叶发育不良和唇裂/腭裂综合症（AEC）、肢体乳腺综合征、肢端-趾-唇-唇-齿综合征和Rapp-Hodgkin综合征。EEC突变集中在DNA结合域，AEC突变在不育的α-基序或反式激活抑制域(3). 尽管这些综合征之间存在一些临床相似性和重叠第63页基因不同结构域的突变显示出强烈的基因型-表型相关性，因此不同的分子机制第63页-相关综合征。观察到相同突变的临床和外显率变异，这表明p63患者的数量可能被低估(3,4). 此外，综合征之间表型的变异可能是单一突变的特定功能后果的结果。例如，两个热点突变体R304W和R204W都位于第63页代表EEC综合征的基因，但根据其与p53突变的相似性，其作用可能不同，因为R304W干扰DNA结合，R204W干扰p63的整体蛋白结构/稳定性，从而不同地影响靶基因的转录(5,6).

除了皮肤缺陷外，EEC患者还患有视觉疾病，进行性角膜缘干细胞缺乏导致严重的视觉损伤和失明(7,8). 因此，这些疾病的建模对于识别涉及p63的分子过程中的异常、其对细胞生长和皮肤发育的影响以及药物筛选至关重要。通过使用患者获得罕见皮肤和角膜疾病的体外细胞模型-来源于原始表皮细胞。鉴于p63是上皮发育胚胎步骤的主要调节器，因此有必要建立细胞模型，以重现体外皮肤和角膜上皮发育的主要步骤。最近发现的人类体细胞相对容易重编程为胚胎干细胞样多能干细胞（iPSC）的能力，通过按需提供患者特定的分化细胞和针对特定病理的新型细胞模型，为治疗提供了众多前景。iPSC技术提供携带患者遗传特征的多能干细胞。这些细胞具有在体外重述人类胚胎发育主要步骤的显著能力，并为生成患者特定的器官型疾病模型提供了迫切需要的工具。这些细胞模型可用于以灵活且高度特异的方式发现新药，因为它们有助于高通量化合物筛选和毒性分析。最后，与患者原代细胞不同，源自患者细胞的iPSC为研究人员提供了无限增殖能力的细胞。临床外显率第63页基因是高度可变的，显然是由于其他遗传和表观遗传因素(9,10). 因此，通过敲除插入单个EEC突变的动物模型可能无法再现人类病理。在这里，我们从健康对照组和EEC患者中获得iPSC系，并评估其分化为表皮和角膜上皮细胞的能力。我们的研究表明，他们表现出受损的上皮细胞承诺，而一种小的治疗化合物可以部分挽救这种承诺。

结果

EEC iPSC细胞系的表皮分化受损。

EEC患者的皮肤发育受损。为了确定EEC-iPSC株是否能够模拟这些缺陷，我们优化了将人类iPSC分化为表皮细胞的方案。BMP-4可诱导胚胎干细胞的表皮结合，抑制神经分化并促进神经外胚层细胞的表皮命运(12–14). 骨形态发生蛋白-4和抗坏血酸长期治疗结合角质形成细胞生长条件已被证明可有效促进人胚胎干细胞分化为成熟角质化细胞(14). 然而，将该协议应用于多能干细胞系似乎效率低下，因为大多数细胞以异种方式分化，很少有外胚层样细胞，并且具有大的囊状结构(图S2A类). 我们发现，表达CDX2和CGHα的胚外细胞是由iPSC产生的，以响应高剂量的BMP-4(图S2B)这表明iPSC与人胚胎干细胞相反，不能有效地分化为外胚层谱系，因为它们未能首先自发地进入神经外胚层(15). 因为TGF-β/淋巴结途径的抑制促进了多能性和神经外胚层承诺的丧失(16)，我们测试了TGF-β抑制剂SB431542对iPSC表皮分化的影响。SB431542显著改善了iPSC的外胚层分化。形态学上，菌落更快地失去多能性，并在7天内获得了同质外胚层表型(图S2A类). 多能性标记物（Oct4和Dnmt3b）和滋养层标记物（CDX2和CGHα）减少，但角质形成细胞标记物K14增加(图S2B). 用BMP-4、AA和SB431542处理30天的iPSC分化导致成熟的角质形成细胞(图S2C类我)如K14和K10的表达所示(图S2C类ii和iii），自发分层的迹象(图S2C类iv和v），以及在分裂时形成典型角质形成细胞集落的能力(图S2C类不及物动词). 这一过程表明，TGF-β的抑制显著提高了iPSC系表皮细胞的生成。

iPSC公司^{欧洲经济共同体}根据上述方案接受表皮承诺。为了在前10天内响应SB431542和BMP-4，iPSC^{欧洲经济共同体}启动外胚层承诺，如与iPSC类似的典型外胚层细胞形态所示^重量单元格(图S2A类). 然而，尽管iPSC^重量细胞从第13天到第15天经历表皮转变，产生角质形成细胞样区域，在接下来的10天内增殖，iPSC^{欧洲经济共同体}继续显示相同的外胚层形态(图S3A类). 偶尔只能发现少量角朊细胞样细胞。免疫荧光染色(图1A类)流式细胞术定量(图S3B)确认两个iPSC^R304瓦/+和iPSC^R204瓦/+可以生产K18⁺与iPSC相似程度的外胚层祖细胞^重量（分别为42.5%和46%）。然而，iPSC^R304瓦/+无法进一步区分为K14⁺表皮细胞（2.2%），与iPSC相比^重量（27.5%）(图1和图S2B). iPSC也获得了类似的结果^R204瓦/+(图1B). 值得注意的是，在WT和突变iPSC的表皮结合期间，p63的表达上调到了相同的程度(图S3C类).

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图1。

EEC-iPSC的表皮分化受损。iPSC公司^+/+、iPSC^R204瓦/+和iPSC^R304瓦/+细胞在BMP-4和SB431542的存在下进行表皮分化，分化15天后对K18和K14进行免疫荧光(A类)或分化25天后通过流式细胞仪分析K18和K14(B). 数据是K14百分比的平均值⁺来自两个独立的iPSC克隆的细胞±SE*P（P）< 0.001. （比例尺：20μm）

APR-246/PRIMA-1挽救EEC-iPSC角膜分化受损^遇见.

EEC患者因角膜缘干细胞缺乏导致角膜受损而患上视觉疾病(7). 通过对Lako及其同事为hESC设计的方案稍作修改，诱导诱导多能干细胞系达到角膜命运(17). 简言之，iPSC系在由人角膜成纤维细胞（COF）调节的培养基中接种在IV型胶原上，并在第0天到第3天用BMP-4处理。如实时qRT-PCR分析所示，人类iPSC系经历了向外胚层前体细胞（K18）的顺序分化⁺/第6页⁺)第4天，角膜祖细胞标记物（K14⁺/第63页⁺/乘客6人⁺)在第8天出现，并且最终分化的角膜上皮（Pax-6）标记物⁺/K3公司⁺/K12号公路⁺)细胞在第14天表达(图2A类). 值得注意的是，免疫荧光染色检测到，在第14天，大多数细胞变成了角膜上皮细胞(图2B)和FACS分析(图2C类). p63是角膜干细胞的假定标记物，位于角膜缘，角膜缘是角膜周边的一个明确区域(18). 接下来我们挑战iPSC^{欧洲经济共同体}与iPSC相比，他们接受适当角膜上皮细胞承诺的能力^重量外胚层祖细胞（K18）的产量相似⁺/E类-钙粘蛋白⁺)在第10天观察到iPSC^重量、iPSC^R204瓦/+、和iPSC^R304瓦/+(图2D类). 然而，K14和K3染色显示iPSC的无能^{欧洲经济共同体}与iPSC相比，进一步承诺分别生产角膜缘细胞和角膜细胞^重量同时，在承诺的第10天通过qRT评估几个p63依赖基因的表达-聚合酶链反应(图2E类). 这些基因包括仅在p63存在时在胚胎期（E）14.5增强的基因(GJA1公司,GJB6型,KRTDAP公司、和14韩元) (19)以及p63靶基因，在上皮发育过程中，这些基因的失调与外胚层发育不良有关[DLX5（DLX5）,DLX6（DLX6）、和CDH3型（P-钙粘蛋白）](20,21). 有趣的是，与对照细胞相比，这些基因中的大多数在突变细胞中的表达显著减少(图2E类).

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图2。

iPSC细胞系的角膜上皮结合受损。iPSC公司^+/+将其接种在角膜成纤维细胞条件培养基中的IV型胶原涂层培养皿中，在分化的前3天补充BMP-4。在指定的时间点采集细胞，并对外胚层标记物（pax6和K18）、角膜上皮前体标记物（K14和p63）和最终分化角膜上皮细胞标记物（K3和K12）进行实时PCR分析(A类). 在分化第14天收集细胞，并进行p63和K14或pax6和K3的联合免疫荧光染色(B). iPSC的流式细胞术分析^+/+分化第7天和第14天收获并用K18或K14抗体染色的C类.iPSC^+/+和iPSC^{欧洲经济共同体}将细胞系分化为角膜上皮细胞10天(E类). 在荧光显微镜下进行免疫染色，以确定指示蛋白的表达(D类)，并进行实时PCR分析，以确定所示上皮转录物的相对表达(E类). （放大倍数：B, 40×;D类, 20×.)

由于iPSC的角膜上皮结合似乎比表皮转移更有效、更快，我们使用该系统测试小化合物APR-246/PRIMA-1是否^遇见最近研究表明，它可以恢复p63诱导的人类肿瘤细胞凋亡(22)，可以挽救iPSC的角膜上皮承诺^{欧洲经济共同体}因此，iPSC^重量、iPSC^R204瓦/+和iPSC^R304瓦/+从第3天到第14天，用APR-246（20μM）处理细胞，并在第14天监测角膜吸收。246年4月/PRIMA-1^遇见对iPSC的分化没有显著影响^重量单元格(图S4). 值得注意的是，iPSC部分恢复了上皮标记物的表达^{欧洲经济共同体}在APR-246的存在下观察到(图3A类). iPSC对这些因子的平均表达^{欧洲经济共同体}与iPSC相比为~15%^重量然而，在iPSC中，APR-246的存在显著增加至43±12%^R304瓦/+以及24±15%和iPSC^R204瓦/+，与iPSC相比^重量(图3B). 同样，如流式细胞术分析所示，APR-246处理显著提高了K14蛋白的表达(图3C类). 246年4月/PRIMA-1^遇见对细胞增殖无明显影响(图S5)，排除了这种效应是iPSC细胞增殖增强的结果的可能性^{欧洲经济共同体}细胞。值得注意的是，突变体R304W的救援效果系统性更强。因此，我们得出结论，患者iPSC细胞能够在体外重现EEC的主要分子缺陷，APR-246治疗可能会修复这些缺陷。

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图3。

APR-246拯救EEC-iPSC的角膜分化。在有（+）或无（−）APR-246治疗（详见材料和方法). (A类)实时PCR分析显示所示上皮转录物的相对表达。(B)基因表达数据的平均值A类结果表明，数据来自两个独立的实验±SD(C类)流式细胞术分析K14的表达。结果显示三个独立实验的平均数据±SD。星号表示统计显著性(*P（P）<0.01**P（P）与对照组（未经处理的细胞）相比，APR-246处理的样品之间的差异小于0.05）。

讨论

先天性疾病，如外胚层发育不良综合征，缺乏能够在体外重现胚胎事件的实验模型。已经尝试在小鼠胚胎干细胞中表达外源性突变形式的p63，这为分子信号通路提供了有趣的见解(23). 然而，这种方法不能再现突变和野生型等位基因之间等摩尔浓度的病理生理条件。在这里，我们将从EEC患者分离的成纤维细胞重新编程为多功能iPSC细胞系，并刺激其进行体外表皮和角膜上皮发育的主要步骤。iPSC公司^{欧洲经济共同体}重述受损上皮细胞的承诺，证明该模型对先天性皮肤或角膜疾病的实用性。我们观察到p63突变的多能干细胞未能从K8/K18外胚层前体细胞过渡到K14表皮细胞，证实了p63在控制早期胚胎表皮转换中的关键作用，正如人类胚胎干细胞模型所提示的那样(23,24)和p63缺乏小鼠(19).

已建立基于BMP-4的方案，从多能干细胞中获取角质形成细胞(12,14,25)最近，Itoh等人在有限的时间内使用BMP-4和维甲酸，从营养不良性大疱性表皮松解症患者的iPSC中生成角质形成细胞，达到K14的30-40%⁺只有在传代或细胞分选后才能富集的细胞(26). 尽管有可能进行浓缩并具有令人满意的3D潜力(14,26)在考虑细胞治疗时，仍需要改进从多能干细胞高度均质生成角质形成细胞的方案。我们观察到BMP-4诱导的iPSC的表皮承诺与人类胚胎干细胞的报告相比显著降低(14)，显然是因为有限的自发神经外胚层承诺导致了BMP-4诱导的滋养细胞的产生。我们发现TGF-β抑制能有效促进神经外胚层的结合，同时添加BMP-4可增加K14的生成⁺细胞。这些发现可能有助于优化人类iPSC角质形成细胞的生成，以用于未来的细胞治疗。

相比之下，角膜上皮细胞的结合似乎更有效、更均匀(27). 因此，对APR-246对角膜命运的影响进行了测试。小分子APR-246，也称为PRIMA-1^遇见（p53依赖性激活和诱导大量凋亡）可以恢复p53诱导的几种癌症细胞的凋亡(28). APR-246最近在一项I/II期临床试验中进行了测试。此外，APR-246还被证明靶向p73和p63的突变形式，这种效应可能是由三种p53家族成员蛋白之间高度同源的结构元素引起的(22). 我们的研究独特地表明，APR-246可以部分恢复p63下游的分子电路，这在EEC患者衍生细胞的胚胎谱系承诺中受到影响。四个基因先前在WT小鼠中显示升高，但在E14.5时p63-null小鼠中没有升高(GJA1公司,GJ6B型,14韩元,KRTDAP公司) (19)于246年4月获救。此外，三个p63靶基因的表达水平(DLX5（DLX5）,DLX6（DLX6）、和CDH3型/P-Cadherin）与EEC综合征相关(20,21)APR-246显著增强。有趣的是，我们发现APR-246对R204W和R304W突变体的作用不同。虽然这两种突变都是在DNA结合域内发现的，但R304W位于锌结合囊中，这被认为会影响p63与DNA磷酸部分的直接结合，但R204W可能会导致p63蛋白更剧烈的构象变化和错误折叠(5). 事实上，Rökaeus等人也报道了APR-246对TAp63γR204W和TAp63βR304W突变体的差异作用：APR-244在TAp63αR304W存在时导致细胞死亡，但主要在TAp63-R204W的细胞中诱导生长停滞(22). 通过体外试验，研究APR-246与两种突变p63形式的结合是否存在差异，将是一件有趣的事情。可以假设APR-246的假定结合位点在p63中暴露较少^R204瓦蛋白质与p63的比较^R304瓦这可以解释p63的轻度恢复^R204瓦活性，或R204W诱导的构象变化对APR-246结合或APR-246-介导的重折叠不太敏感。动物模型有助于在转化为患者之前确认治疗功能。然而，EEC突变敲除小鼠尚不可用，可能无法忠实再现人类病理学。因此，我们的研究为p63相关疾病的未来治疗铺平了道路，因为APR-246已经在血液系统恶性肿瘤或前列腺癌患者的临床试验中进行了测试，可以较快地发展。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类