在小鼠胚胎发生的第12.5天，外胚层分化为各种上皮谱系。这一步骤的特点是外胚层细胞角蛋白（K8/K18）被上皮细胞角蛋白取代（K5/K14）。因此，分层程序开始，并需要增殖、干细胞再生、分化和凋亡。这一协调过程在3-4天内产生多角上皮（E16.5）().1，2，三，4
WT和p63的角膜发育分析−/−老鼠。(一)表皮（i）和角膜上皮（ii）发育示意图。外胚层与表皮的结合(一（i） ）和角膜(一（ii）谱系发生在小鼠胚胎发生的胚胎第12.5天，以细胞角蛋白K8/K18被K5/K14取代为特征。表皮直接分层，在几天内出现多层表皮，以典型标记为特征，即K5/K14、K1/K10和Loricrin(一（i） ）。然而，角膜保持静止的非增殖单层长达3周，直到出生后2周（P14）眼睑开放时开始角膜分层(一（ii）。WT负责人(第63页+/+)和第63页-不足(第63页−/−)图中为小鼠（C/BALB/C株）(b条)或经过处理用于血色素和曙红染色(c（c）)或标记物的免疫荧光染色(d日和e（电子）)E18.5处。下部面板显示H&E染色放大倍率较高(c（c）). 中的每个面板e（电子）包含同一场的三个频道以及绿色和红色配音的融合。在129sv/C菌株中也发现了类似的结果（补充图S1）。虚线表示皮肤-表皮交界处。的比例尺c（c）和e（电子）是500 μm、 和d日是250 μm.EL，眼睑；五十、 透镜S，基质；E、 角膜上皮
p63基因属于p53家族，是一种主要的上皮转录因子，具有多种功能，包括细胞粘附、细胞增殖、凋亡和衰老。1，2，三，4由两个独立组产生的两个p63敲除小鼠菌株显著证明了p63在上皮发育中的中心作用。5，6尽管这两种小鼠出生时都没有四肢、表皮和皮肤附属物，但Yang等。6已报告第63页−/−胚胎表面显示由重叠（堆积）细胞形成的罕见团块，表皮标记阳性。这一观察结果使作者得出结论，p63对于表皮干细胞更新是必要的。始终，表皮干/祖细胞中ΔNp63的表达水平与其增殖能力相关。7
相比之下，米尔斯等。胚胎皮肤发育过程中表皮分化标志物无表达，5提示p63对表皮分化/分层至关重要。因此，TAp63的异位表达诱导体内单层肺上皮分层8和ΔNp63诱导胚胎干细胞的表皮承诺。9，10这一重大差异导致了对p63在皮肤发育过程中的功能的强烈争议。11有人认为背景菌株的差异，即129sv/C57BL/6（129sv/C）5 与C57BL/6-BALB/c（c/BALB/c）6)可以解释明显的表型差异。
在这项研究中，我们证明了两个p63基因敲除小鼠菌株的胚胎上皮不会因非再生上皮分化而耗尽，但未能发育到外胚层阶段之后。比较转录组分析在体外和体内这些样本强调，ΔNp63是一个外胚层特异性看门人，在抑制中胚层基因的同时，积极控制表皮特异性基因。
结果和讨论
在角膜更新前3周，p63-null小鼠的角膜上皮分化受到阻碍
与表皮一样，角膜上皮也通过类似的分子步骤起源于外胚层，如图所示与所有其他上皮细胞相比，由于角膜分层在出生后2周开始（～P14），角膜承诺和角膜分层是按时间顺序分开的事件。12在这一静止期（小鼠胚胎发生的胚胎期12.5天-P14），由于角膜再生还不需要，该上皮保持单层/双层，没有明显增殖(). 因此，通过研究E14.5–18.5发育中的角膜，我们探讨了p63在外胚层向角膜上皮谱系转化中的作用，与分层/自我更新事件无关。
在E18.5第63页-空白小鼠（C/BALB/C株）连续出现并表现正常()，但未能表达角膜分化标志物K12()，角膜祖细胞标记物，K5()和K14（未显示），外胚层标记物K8/K18保持阳性()，表明第63页-空上皮细胞不能发育到外胚层以后。这种失败不能归因于角膜分层的失败或角膜干细胞更新的丧失。在129sv/C株第63页-缺陷小鼠（补充图S1）。
年眼睑形成开始正常第63页-在E14，空白小鼠的突起脊和眼睑沟结构与野生型（WT）相似。然而，第63页-出生后，有缺陷的眼睑无法融合并保持睁开状态(). 有趣的是，老鼠缺乏FGFR2型是p63靶基因（Candi等。13和)也表现出类似的“出生时睁开眼睑”表型。14这种表型在129sv/C株第63页-缺陷小鼠（补充图S1）。
胚胎表皮组织和转染ΔNp63的ES-衍生外胚层样细胞的转录组分析。E11.5的指示基因型（C/BALB/C菌株）(一)和E14.5(b条)如激光捕获表皮显微切割前所示进行免疫染色（下面板与激光捕获表皮后的区域相同）。组织用于转录组分析(c（c）和d日，左侧面板）。此外，用空载体（Ctl）或ΔNp63转染的小鼠ES-衍生外胚层细胞（ES-EC）α（ΔNp63），进行转录组分析(c（c）和d日，右侧面板）。图中显示了E14.5时WT/KO比率最高的51个顶级基因(c（c），左侧面板）。热图显示了E14.5时KO/WT表达率最高的24个顶级基因(d日，左侧面板）。ES-EC转染体转录组中的相应表达(c（c）和d日，右侧面板）。显示了表达式（Log2）级别（参见下面的颜色代码）。已知的表皮或中胚层基因在c（c）和d日分别为。发现含有p63结合位点的基因用蓝色星号标注(c（c）和d日). 24个表皮基因的平均表达情况见e（电子）(（f）)Venn图对野生型E14.5上调的51个基因进行了分类（灰色），其中包括已知的表皮基因（红色）、ΔNp63诱导的基因（蓝色）或两者（绿色）(e（电子）). 括号中显示了每组中也包含p63结合位点的基因数量(e（电子）). 比例尺一和b条是100 μ米
p63全外胚层未能启动胚胎分层
来自两个独立的小鼠胚胎头部的拼接图像第63页-缺陷小鼠品系5，6图中同时显示了各种上皮(). 检查的其他表皮区域显示出类似的结果（未显示）。
E18.5和E14.5处K5和K8/K18免疫染色的镶嵌图像。WT的横向头部截面(第63页+/+)以及指示的第63页-不足(第63页−/−)在胚胎第18.5天（E18.5）制备小鼠菌株进行免疫荧光染色(一和c（c）)或E14.5(b条和d日)使用抗K5抗体(一和b条)或K8K18抗体(c（c）和d日). 具体第63页-括号中显示了缺陷菌株。下面板是由上面板中的箭头指示的表皮的放大区域。表皮；t、 舌；p、 腭；el，眼睑；c、 角膜；嗅觉；vn、vumeronasal。比例尺一和b条500英镑 μm.在这两个方面都发现了可比较的观察结果第63页−/−菌株（129sv和C/BALB/C菌株）
在E18.5，WT表皮呈现多角化()并表现出K5的强表达()和K14（未显示）。根据以前的报告，6，7在E18.5中发现K5的低而间断染色第63页-无表皮（C/BALB/C株，Yang等。)看起来好像丢了(). 然而，令人惊讶的是，我们在129sv/C菌株（Mills等。)第页，共页第63页-缺陷小鼠()与原始报告相比。5与野生型表皮细胞相比，p63−/−表皮细胞中的K5信号水平相对较低()，Mills可能没有检测到它们等。因为尽管检测灵敏度较低。为了阐明这一特征是否说明了胚胎表皮的消失是由于缺乏自我更新能力第63页，我们系统地研究了表皮形态发生开始的早期阶段（E11.5–E16.5）。在E11.5，两种基因型的外胚层仍然是单层组织，K8/K18呈阳性（如)但不是K5/K14（未显示），而在E14.5，WT表皮由2-4层细胞组成()K5为正()和K14（未显示）。在第63页-无论是哪种品系或阶段的缺陷小鼠，我们从未检测到任何分层表皮区域，而是一个单层的连续体()很少被K5染色打断().
第一次表皮分层过程中增殖和细胞凋亡的检查。(一)在E18.5和E14.5处制备的所示胚胎皮肤（C/BALB/C菌株）的石蜡切片用于血卟啉和曙红染色。使用ki67抗体对胚胎皮肤的组织切片（E15.5处的C/BALB/C菌株）进行免疫染色(b条)或用于Tunel分析(c（c）). 虚线表示皮肤-表皮交界处。Der，真皮；Ep，表皮。比例尺b条和c（c）是100 μ米
接下来，我们对E14.5-18.5处的几个上皮进行染色，以获取外胚层标记(). 与在E14.5时已经失去K8/K18表达的WT表皮相比，第63页-空表皮异常维持K8/K18表达(). 使用额外的K18特异性抗体（未显示）获得了类似的结果。明显的组织脱离(，下部面板）可能是由于p63依赖性粘附分子在第63页-上皮细胞缺乏。15
胚胎分层大约在小鼠胚胎发生的第12.5天开始，需要显著增殖。这一阶段需要p63依赖性增殖，因为只有多分化WT表皮细胞表达ki67，而第63页−/−表皮保持不增殖(). 失去第63页-如前所述，最初形成但未能维持的空表皮，7在第一个分层周期中需要大量的细胞凋亡。如所示，在第63页-E14.5–E16.5的“表皮”缺陷，而凋亡细胞主要出现在WT表皮的基底上层，这一点不出所料。只有在胚胎发生很晚的时候（E18.5-出生），p63缺失的表皮中才发现凋亡细胞16因此，与早期表皮的丧失无关。总之，第一个增殖/分层周期在第63页-使小鼠无效，不管是什么菌株（未显示）。
同样，口服第63页-两种菌株的无上皮组织第63页-缺陷小鼠仍然是连续的单层细胞，无法分层(). 舌和腭的野生型上皮细胞和vumeronasal器官表达上皮祖细胞标记物（K5()和K14（未显示））以及分化标记（K10()). 相反，尽管在较低水平上，K5（和K14，未显示）在p63缺失舌的大区域中与K8/K18均匀共存()但在上颚的大部分区域都没有()和鼻腔的(). 然而，与野生型相比，第63页舌和腭上皮是均匀表达K8/K18的连续单层细胞()和完全缺失的K10()，整合素β4和层粘连蛋白-5（未显示）。这表明，口腔上皮中表达的特定因子能够部分表达K5/K14，但在缺乏p63的情况下，不能表达基底层细胞或分化细胞的其他标记物。总之，K8/K18异常共表达，K10、整合素缺失β层粘连蛋白-5和缺乏分层表明这些细胞不能整合到口腔上皮细胞系中。
口腔上皮的免疫染色。口腔组织（E18.5，C/BALB/C小鼠株）受到指示蛋白质的共染色。合并如所示一，同时b条和c（c）所选区域的放大倍数是否较高一在129sv菌株中发现了类似的观察结果（未显示）。的比例尺一是300和100 μm用于b条–d日.p，上颚；t、 舌头
这些结果的计算机分析（如，和)显示了各种类型的第63页−/−-上皮谱系（角膜、眼睑、舌头和腭）在E18.5时完全保持外胚层表型的表达(). 的补丁第63页−/−表达K5的细胞（如)和K14（未显示）在E14.5或E18.5中基本罕见（定量). 此外，早期分化标记K10或角膜分化标记K12分别罕见或完全缺失(). 我们由此得出结论：第63页-缺乏的上皮细胞不能发育到外胚层阶段之后。
免疫荧光染色定量。免疫染色的计算机分析，和免疫荧光染色的表面强度值是根据材料和方法中所述的计算机分析测定的。将相对表达式标准化为WT记录值的百分比(b条和c（c）)或第63页−/−(一)
罕见的“分化”p63缺陷细胞异常共表达K8/K18，但不表达整合素β4或层粘连蛋白-5
接下来，我们对罕见的K5的表皮性质提出了质疑+在中不常见的单元格第63页-无胚胎(). E18.5胚胎（C/BALB/C株）与K5和K8/K18共染()、K10和K8/K18()或K5和整合素β4种抗体(). 虽然发现很少有细胞表达K5或K10第63页−/−胚胎组织，它们从未分层，但仍为单层原始上皮，K8/K18共存。此外，我们从未检测到两种典型的角质形成细胞标记物，即整合素-β4 (和补充图S2A）和层粘连蛋白-5（补充图S2B），在这种K5-阳性中第63页-缺乏细胞。在129sv/C株第63页-缺陷小鼠（补充图S3）。总之，这些第63页-空的“分化”细胞不是真正的角质形成细胞，而是介于外胚层和表皮表型之间的中间杂种。这些杂交细胞出生后仍被检测到（未显示）。
胚胎表皮的表皮标志物分析。指示的表皮第63页E18.5的基因型（C/BALB/C株）受到指示蛋白的免疫荧光共染(一–c（c）). 每个面板包含同一字段的三个通道，并显示绿色和红色配色的合并(一和b条). 虚线表示皮肤-表皮交界处。比例尺一和b条100和50 μm用于c（c）在129sv菌株中发现了类似的观察结果
Khavari的研究小组一致证明，成人角质形成细胞中ΔNp63的缺失被激活从头开始K8/K18表达并取消分层。17最近的一项研究在该领域产生了相当程度的混淆，因为作者认为Brdm2（129sv/C菌株）第63页-在E15.5处，缺陷小鼠仍在产生一个截短的p63转录物，同时显示由多层表皮组成的斑片状区域。18在本研究中，我们并排使用了JAX分布的原始Brdm2小鼠以及C/BALB/C p63缺陷株。如上所述，我们的数据排除了任何多突表皮的形成，即使是暂时的。因此，沃尔夫的观察等。最有可能代表一个新菌株，该菌株是由原始Brdm2（129sv/C）菌株的自发遗传回复驱动的。事实上，如补充图S4所示，我们确认p63转录物在p63缺陷型Brdm2（129sv/C）菌株中不表达。
表皮基因网络在野生型中被激活，但在p63全外胚层组织中保持沉默
为了证实我们的观察，表皮分化在第63页-为了剖析p63在早期表皮形态发生中的分子机制，我们在第一次表皮分层的早期阶段进行了转录组分析。在E11.5（外胚层表皮附着前）通过激光捕获显微切割分离表皮组织())和E14.5（分层早期()). 已注意限制激光捕捉上皮层，同时避免皮肤组织污染。因此，在我们的样本（未显示）中未检测到各种皮肤标记物（例如，巢蛋白、Dermo-1、Msx-1和纤维连接蛋白）。与E11.5时WT组织相比，E14.5时WT表皮中上调的51个顶级基因如图所示有趣的是，使用DAVID算法对这51个上调基因进行基因注释（GO）分析19表明“上皮分化”和“上皮发育”是重要的GO术语之首，其次是许多其他与发育相关的术语(). 在这些上调基因中，我们发现了24个已知的表皮基因(涉及表皮缝隙连接、紧密连接或粘附（GJB6、GJA1、COL18A1、COL17A1、LGALS7、LGALS3、EMP1、IQGAP和PKP4）、已知表皮干/祖细胞标记（例如K14、K17、LMO4、K15和FGF18）、与表皮分层或分化相关的基因（K10、KRTDAP、DMKN、S100A11、LOR和FGFR2）以及突变导致外胚层发育不良（GJB6）和大疱性表皮松解（COL17A1）综合征的基因。转录组结果的可靠性通过qPCR分析得到证实，如.与阵列数据一致()K14、K10和Loricrin的表达水平仅在野生型组织中在E14.5时增加，而在p63完整样本中保持较低水平(). 此外，在ES-EC细胞中过表达ΔNp63可诱导K14表达，但不影响K10和Loricrin的表达(). 此外，这些数据通过免疫荧光染色在蛋白质水平上得到了证实(). 同样，野生型小鼠的表皮对K14、Loricrin和Galectin7呈免疫反应，而p63全表皮则不呈免疫反应()，共同确认数组数据。
通过qPCR和免疫荧光染色验证转录组分析。(一)进行实时PCR分析，以使用与用于微阵列分析相同的RNA样本扩增所示转录物，如(b条)对指示基因型（C/BALB/C株）的表皮组织进行K14、Loricrin和Galectin7免疫染色。虚线表示皮肤-表皮交界处。的比例尺b条是100 μ米
表1
差异上调基因的Top GO项
| GO条款编号。 | GO条款 | 基因数量 | %分析的基因 | P（P）-价值* | 邦费罗尼 |
|---|
| GO:0030855号 | 上皮细胞分化 | 6 | 11.8 | 261E−05年 | 0.01695848 |
| 电话：0060429 | 上皮发育 | 7 | 13.7 | 1.16E−04号 | 0.73536236 |
| 去：0009888 | 组织发育 | 9 | 17.7 | 4.04E−04版 | 0.23265627 |
| GO:0051094号 | 积极调节发育过程 | 5 | 9.8 | 0.003267 | 0.88311957 |
| 转到：0008284 | 细胞增殖的正向调节 | 5 | 9.8 | 0.008830 | 0.99702754 |
重要的是，与E14.5时WT表皮中各种表皮基因的表达显著增加相反，这些基因的表达在第63页-空“表皮”保持沉默(). 这24个表皮基因在E14.5的表达平均增加倍数为野生型2.7倍，野生型1.1倍第63页-无效组织()，明确确认第63页-缺乏的组织不能发育到外胚层之后。
早期ΔNp63诱导的表皮承诺的胚胎特征
ΔNp63表达诱导ES-EC的表皮承诺。9，10因此，我们分析了ES-EC细胞异位表达ΔNp63后的整体转录组分析(，右侧面板）。由于培养条件不允许ES-EC转染体分层，差异调节基因列表被视为ΔNp63应答基因的一个定义子集，这些基因在分层之前发生了变化，而不是分层的结果。有趣的是，在野生型胚胎中E11.5和E14.5之间激活的18个基因体内在ES-衍生表皮承诺期间也被激活在体外（参见（蓝色和绿色））。ΔNp63转染诱导了已知在表皮基底层表达的基因（如KRT14、KRT17、LMO4和KRT15）以及一些与角质形成细胞分化相关的基因（例如KRTDAP、S100A11和FGFR2）的表达，表明p63也诱导了早期角质化细胞分化。这些基因很可能代表早期ΔNp63诱导的表皮承诺的特定胚胎特征。
可能参与早期表皮发生的新基因列表
此外，这里首次将27个基因描述为表皮因子（参见). 其中包括控制粘附和/或存在于上皮细胞膜中的因子（LYPD3、LY6G6C、整合膜2B、NME2和RAB25），与不同的癌相关（TRIM29、TACSTD2和TPD52），线粒体因子（GLDC和UQCRC1）和3个未知的“RIKEN”序列。此外，CETN3是中心粒复制过程的重要组成部分，在WT中被诱导，并可能与早期分层期间的增殖有关。其中6个新的表皮基因（整合膜2B、糖脂转移蛋白、TPD52、UQCRC1、LYPD和NPM1）在E14.5时增强，也由ΔNp63诱导（比较左、右面板)因此，它们更可能参与表皮的发育。
表皮结合过程中p63潜在直接靶基因的鉴定
接下来，我们研究了这些差异调节基因中哪些可能受p63的直接控制。我们最近在人类原代角质形成细胞（库文霍温）中发现了与p63直接结合的基因等。有趣的是，E14.5上调的基因中约55%（28/51）包含p63结合位点(，以蓝色标注）。在这些p63结合基因中，我们发现9个基因也由ΔNp63转染诱导（参见括号中的数字)强烈暗示这些基因真诚地p63靶基因，参与这一发育步骤。其中一些已知的表皮基因尚未被确定为p63靶基因（例如，KRT17、KRT15、COL18A1和PKP4），而完整膜2B和糖脂转移蛋白尚未与皮肤生物学相关。
p63缺失导致中胚层基因激活
一份由24个基因组成的清单显示，p63缺失组织中的基因表达明显更高(). 有趣的是，大多数基因在第63页-空外胚层和不在WT表皮中（绿色标注）是肌肉特异性基因。最近，德罗莎等。已经表明，非表皮基因是通过Smad-7途径由成人表皮细胞中p63的缺失诱导的，20这是诱导肌肉命运所必需的。21一致的是，ΔNp63被证明可以抑制爪蟾中胚层的命运。22有趣的是，巴比里等。23已经表明p63的缺失导致了几个间充质基因的激活。这些实验与我们的数据一致，尽管p63 siRNA的作用在人类成年癌细胞中进行了检测，而我们的研究包括小鼠胚胎未转化组织。p63表达的间充质基因的两个列表是不同的，这强烈表明我们所鉴定的基因可能代表p63缺乏的外胚层细胞的胚胎特征。
总之，我们积累的证据清楚地表明ΔNp63对表皮形态发生的启动是强制性的。如果没有它，外胚层就无法与表皮谱系承诺、增殖和分化所需的大量基因结合，从而导致中胚层命运。这些观察结果表明，ΔNp63是胚胎发生过程中表皮命运的“看门人”。
材料和方法
老鼠和动物护理
p63恒河猴(第63页+/−)如所述产生小鼠。5，6 第63页+/−129sv/C57BL/6（129sv/C）5购自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME，USA），基因背景为C57BL/6。p63异基因小鼠C57BL/6-BALB/c（c/BALB/c）的小鼠集落6由F McKeon教授善意提供的是通过与从Charles River Italy（Lecco，Italy）购买的纯C57Bl/6小鼠交配而建立的。每一代小鼠都进行基因分型。动物在标准条件下保持12 h光/暗循环，提供食物和水随意.
组织加工和组织染色
为了检查不同发育阶段的胚胎，在E11-16、E18.5和出生时收集胚胎。每个发育阶段的三个胚胎第63页-使用敲除菌株（129sv/C和C/BALB/C）。组织被植入冰冻标本包埋介质（美国伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）和8-10个切片中 μm在丙酮中固定并进行免疫染色。抗体为兔抗K5（法国巴黎柯文斯）、兔抗K14（法国巴黎）、猪抗K8/K18（德国海德堡Progen）、小鼠抗K18（美国马萨诸塞州比列里卡Chemicon）、兔抗K10（柯文斯-β4（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）、山羊抗K12（圣克鲁斯生物技术，巴黎，法国）和山羊抗ki67（圣克鲁兹生物技术）。兔抗半乳糖凝集素7和洛里克林是蒂埃里·马格纳尔多博士赠送的一份礼物。次要抗体为AlexaFluor 488593 nm（Invitrogen，法国巴黎）和荧光素抗豚鼠（Vector Laboratories，加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）。
染色的显微镜和量化
使用成像软件“NIS-Elements AR 3.1”在固定曝光时间下进行荧光显微镜检查（尼康Eclips Ti-RCP，尼康公司，美国纽约州梅尔维尔），为了对表面强度染色进行自动量化，每个条件使用五个独立的切片。
激光捕获显微切割和转录组分析
切片依次在丙酮（1）中培养 min），初级（1/20）和次级（1/40）抗体，70%乙醇（30秒），95%，100%乙醇（重复两次，2 最小值）和100%二甲苯（1 min），并进行显微解剖（Ziess P.A.L.M LCM，法国巴黎）。分离RNA（PicoPure RNA分离试剂盒（Arcturus，Paris，France）），然后进行cRNA扩增（Total prep RNA扩增试剂盒（Illumina；Applied Biosystems，Courtaboeuf，France））。浓缩重复样品，3个 μl含750 将ng的RNA杂交到Illumina芯片上（小鼠WG-6 v2表达BeadChip试剂盒，Illuminia，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。ES-EC转染剂的Agilent微阵列如前所述。24
