p63人类生殖的守护者

摘要

介绍

p63是p53基因家族中最古老的成员，除p53外，还包括p73。p63和其他两个成员一样，在基因的5′端使用一个替代启动子来表达两种不同的N末端亚型，其中一种包含N末端反式激活域（TA亚型），另一种包含缺少该域的N末端截断亚型（ΔN亚型）。¹此外，C-末端序列经历了选择性剪接，产生了具有不同C-末端组织的广泛TA和ΔN亚型。^2-4p53家族中的DNA结合域（DBD）是不同蛋白质成员之间以及整个进化谱系中保存程度最高的区域，因此，所有家族成员都与启动子DNA中的保守p53反应元件（p53RE）结合。然而，不同家族成员对RE中精确的核苷酸序列也可能有一些微妙的偏好。

这三个基因对细胞功能的全球影响突出了p53家族的重要性。p53是第一个被鉴定的家族成员，主要起到抑癌作用^5-10在维持脊椎动物基因组中体细胞的完整性方面起着关键作用。^11-15DNA损伤后，p53的激活^16-19导致细胞周期停滞，^20-22凋亡，^23-29衰老或分化的诱导。^30-39p63与p53在DNA损伤反应中部分共享共同功能。⁴⁰在灭活了50%以上人类癌症中发现的p53基因突变后，^41-44p63和p73至少可以部分补偿p53的功能丧失。^45-55然而，p63有其独特的作用。两组于1999年独立建立的第一个p63基因敲除小鼠模型揭示了p63在表皮发育中的基本作用。p63-null小鼠因缺乏表皮屏障和随后的脱水而在出生后不久死亡。它们还显示出其他发育缺陷，包括四肢和其他表皮附属物的缺失。这一表型导致了两种不同的解释：缺乏适当的表皮分层和表皮胚胎前体的承诺，或者尽管承诺和分化能力正常，但未能维持表皮干细胞的全部储备。^56-62然而，越来越多的数据支持这样一种假设，即皮肤中的主要亚型ΔNp63对于维持表皮干细胞生态位和增殖承诺前体至关重要。^34,63-67条件性ΔNp63-null小鼠显示出一些角质形成细胞斑块，这些细胞能够分层并经历一个末端分化程序，如分离的紊乱上皮细胞簇中lorisrin、filagrgin和involucrin的表达所示。⁶⁸这一发现支持了p63缺失导致皮肤角质形成细胞祖细胞耗竭的假说。ΔNp63-null在很大程度上复制了完整的p63-null（缺乏所有p63亚型），表现出严重的发育异常，包括前肢截短、后肢缺失和表皮分层。⁶⁸相反，TAp63亚型在确定表皮发育中的作用一直存在争议。McKeon小组培育的TAp63-null小鼠没有表现出任何明显的形态缺陷，⁶⁹而弗洛雷斯实验室中设计的TAp63-null小鼠，尽管发育正常，但仍表现出加速衰老、水疱、皮肤溃疡、毛囊衰老和脱发。⁶⁹这种复杂的表型依赖于皮肤和表皮前体细胞的缺陷增殖和衰老，并表明TAp63也可能在皮肤干细胞的维持中发挥作用。然而，McKeon的工作清楚地表明，由p63基因编码的TA亚型在卵母细胞核中强烈表达，并在减数分裂阻滞期间负责保护雌性生殖系。⁶⁹在这篇综述中，我们将讨论p63在生殖系保护中的作用机制，并将分析与p63为完善其功能而遭受的进化压力有关的一些方面。

p63对雌性生殖系的保护作用

体细胞基因组完整性的保存源自生殖系保护机制的进化；事实上，这最后一个过程对于物种在进化过程中的维持至关重要。来自雌性生殖系的细胞进行减数分裂，以产生有性分裂所必需的单倍体细胞。减数分裂是一个多步骤的过程，在胚胎发育期间开始，当细胞达到四倍体状态时暂时停止。在雌性生殖系中，这一时间窗口会异常延长很长一段时间，直到特定的激素信号在排卵期间诱导卵母细胞成熟。这个阶段的延长时间（小鼠超过1年，人类超过数十年）使未成熟卵母细胞处于潜在的脆弱状态；因此，维持基因组完整性和保护相关物种需要有效的机制。

虽然p63对于卵子发生似乎是完全不必要的，但原始卵泡和初级卵泡显示TAp63的强表达。高含量的TAp63通过抑制的二聚体形式保持在非活性状态，这表现出极低的DNA结合亲和力。磷酸化触发构象变化，释放二聚体内的抑制性相互作用，并允许TAp63三甲基化，增加对DNA和转录机制的亲和力(图1).^70-72这种对p63的严格控制对于TAp63在控制卵母细胞死亡中发挥关键作用是必要的。事实上，TAp63在电离辐射或顺铂治疗诱导的DNA双链断裂（DSB）后被磷酸化和激活。⁷³TAp63-null小鼠的卵母细胞对高剂量γ射线照射表现出抵抗力，而WT卵母细胞或p53-null卵母细胞被完全杀死。⁶⁹磷酸化似乎不可逆地触发TAp63四聚体状态。然而，经λ-磷酸酶处理后，p63完全去磷酸化，不会影响四聚体构象，从而保持TAp63的DNA结合亲和力。然而，与二聚体相反，这种活性形式显示出高的降解敏感性。一直以来，研究表明，有效的降级需要TA域的可访问性。^74-77因此，E3连接酶ITCH⁷⁸或MDM2^79-82可以控制TAp63活性形式的细胞内浓度，而二聚体隐藏了E3连接酶的氨基酸共识，^16,83保持较高的蛋白质稳定性。这些生化特性保证了非活性TAp63的持续高水平，处于准备好但非活性的状态，必要时可以补充。同时，一旦该途径被不可逆转地触发，这使得活性TAp63的半衰期很短，可以微调卵母细胞的死亡调节。最近，仅BH3-促凋亡BCL-2家族成员PUMA^84-89和NOXA，^90-94已被确定为DNA损伤的关键下游靶点，⁹⁰TAp63介导的卵母细胞凋亡。^95,96事实上，TAp63-null小鼠的原始卵泡卵母细胞在γ射线照射后未能诱导PUMA和NOXA。一直以来，PUMA或NOXA-null小鼠都能防止γ射线诱导的细胞凋亡，并产生健康的后代，类似于TAp63-null鼠。⁹⁷

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图1。TAp63a从非活性二聚体转换为活性四聚体的示意图。TAp63a二聚体内的相互作用将转录因子保持为非活性形式：来自一个单体的TA结构域分别与来自相反单体的TI结构域相互作用。需要磷酸化来打开二聚体，并允许四聚体相互作用。C-Abl是能够触发活化磷酸化的激酶之一。TA，交易激活域；TI，反式激活抑制域。

在秀丽线虫，CEP-1^98,99和来自D.黑腹滨鹬，Dmp53型¹⁰⁰是唯一存在的p53成员，它们都是生殖系保真度所必需的。哺乳动物TAp63在DNA损伤诱导的凋亡中的作用很可能与其功能相似。此外，考虑到该功能无脊椎动物的p53依赖性，Mckeon提出了一个模型，其中p63代表p53家族的祖先成员。因此，虽然p63保留了维持雌性生殖系的祖先功能，但p53在脊椎动物生物体的体细胞中获得了基因组稳定性控制的“现代”作用。

谁触发TAp63激活？

TAp63的磷酸化似乎是激活卵母细胞DNA损伤反应的关键步骤。酪氨酸激酶c-Abl^101,102Gonfloni等人报告称，这至少是导致p63磷酸化的上游因子之一。Gonfloni和同事们表明，在顺铂治疗后的出生后第5天（P5）小鼠中，TAp63稳定并磷酸化（酪氨酸残基Tyr149、Tyr171和Tyr289），与c-Abl核积累一致，导致卵母细胞死亡(图2). 伊马替尼抑制c-Abl，¹⁰³一种BCR-ABL抑制剂，设计用于临床治疗CML（慢性粒细胞白血病），消除TAp63激活并保护小鼠卵母细胞免受cysplatin化疗。^73,104,105这一观察强调了c-Abl在调控原始卵母细胞死亡中的中心作用，并部分阐明了卵母细胞DNA损伤反应中TAp63募集的分子途径。此外，这将意味着重要的医学考虑：抑制c-Abl/TAp63轴，例如使用伊马替尼，将开辟新的选择来对抗卵母细胞死亡，以防止癌症化疗期间女性不育。然而，受损卵母细胞是否应该死亡仍存在争议；防止不孕症导致胎儿畸形是不可行的。相反，最近的一份报告建议谨慎使用抗-Abl治疗来预防cysplatin诱导的不孕。在致自然医学编辑、克尔和同事展示了如何在两种不同的小鼠菌株（CD1和C57BL6）中共同给药伊马替尼和cysplatin并没有挽救原始卵泡的耗竭。²⁴此外，他们还表明，单独使用伊马替尼会增加凋亡卵母细胞的数量，因此可能会对卵母细胞存活的关键因子c-kit产生依赖伊马替尼可的抑制作用。¹⁰⁶这些结果破坏了c-Abl对DNA损伤诱导的卵母细胞凋亡的真正必要性。此外，他们还提出了伊马替尼特异性低的问题，这可能会影响其他一些酪氨酸激酶的酶活性，如c-kit。Gonfloni及其同事为他们的假设辩护，通过使用与酪氨酸激酶c-kit无亲和力的替代化合物GNF-2抑制c-Abl，重复了关键实验。^107,108通过GNF-2，他们证实了c-Abl在TAp63激活中的作用。他们用其他研究中使用的cysplatin溶液的不同等效性解释了伊马替尼结果的差异。显然，当Kerr等人使用医院级cysplation溶液时，Gonfloni及其同事使用的是Sigma的cysplotin溶液。制备过程中的差异可能会影响化合物的溶解度，从而在相同浓度下产生不同的功效。然而，争论仍在继续。c-Abl对p63磷酸化在DNA损伤诱导的卵母细胞凋亡中的作用有多重要？多种激酶表现出磷酸化p63的能力，包括ATM、Cdk2、p70s6K、p38^{地图,109,110}，Iκβ，Plk，¹¹¹(图2). 他们中的任何人都可以部分克服c-Abl抑制吗？也许解决条件c-Abl-null卵母细胞是否对cysplatin诱导的凋亡敏感以及TAp63是否被激活的问题将有助于澄清这一点。

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图2。DNA损伤通过触发TAp63磷酸化激活卵母细胞死亡。DNA损伤导致TAp63活化，通过不同的激酶诱导其磷酸化。激活的TAp63通过诱导BH3-only促凋亡家族成员PUMA和NOXA的转录介导卵母细胞死亡，后者可以抑制促生存BCL-2蛋白（BCL-2、BCL-w、A1、MCL-1、BCL-XL）。

“GTA”p63减轻TAp63对Hominoid雄性生殖系的保护作用

尽管TAp63作为女性生殖系的守护者发挥着基本作用，但还没有证据表明TAp63参与了生精前体的DNA损伤反应。的确，尽管在小鼠雄性生殖细胞中检测到TAp63 mRNA，^112,113如女性原始卵泡所示，特异性抗体无法清楚检测蛋白质水平。⁶⁹此外，照射后，小鼠p63^−/−与WT相比，睾丸的凋亡反应没有任何显著差异。^112,113

最近，在人类睾丸中发现了一种新的p63亚型，该亚型是Hominoide（人类和类人猿）特有的。^114,115这种亚型称为GTAp63（生殖细胞编码的反式激活p63），来自人类更复杂的5′区TP63型基因。事实上，这里有三个额外的上游外显子（U1、U2、U3），它们可以通过选择性剪接与前面描述的外显子2融合，产生不同的N末端剪接变体(图3A). 最丰富的剪接变异体起源于外显子U1和外显子2的融合，与之前描述的19个残基长N末端的TAp63亚型不同(图3B). GTAp63在人类男性生殖细胞前体细胞中高度表达，而在所有其他组织中大多检测不到。在基因毒性应激下，它显示出诱导凋亡p53反应基因（PUMA、NOXA、CD95L）的能力，因此可能有助于维持精子基因组的完整性。虽然生殖细胞基因组的保护机制通常对所有物种的维持至关重要，但这在Hominoid的精子发生中似乎尤为关键,因为人类每天生产1亿个精子，寿命很长。事实上，GTAp63的表达仅在最近的灵长类进化中才被允许，因为插入了一种内源性逆转录病毒ERV9，这与人类与其他灵长类的血统分离相一致。外显子U1的5′部分确实与ERV9的LTR序列重叠，ERV9主要转录于睾丸。因此，GTAp63的表达很可能是ERV9 LTR启动子活性的结果。这种插入代表了进化过程中的一个积极事件，加强了基因组守护者的表达。事实上，这使得对雄性生殖系的基因组进行了更严格的监测，这可能与这些物种更长的生育寿命的要求相吻合。

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图3。人类睾丸特异性p63亚型由独特的上游外显子编码。(A类)人类p63基因的基因结构显示存在独特的上游外显子U1、U2、U3（天蓝色）。GTAp63睾丸特异性亚型由外显子U1通过premRNA剪接直接融合到外显子2编码。黑色箭头表示，从第一个外显子开始，GTA（外显子U1，天蓝）、TA（外显字1，棕色）和ΔN（外显码3′，灰色）的三个转录起始位点。下游外显子10和14进行选择性剪接，编码最丰富的亚型α和较少丰富的β和γ。ERV9-LTR插入物显示了GTAp63的转录起始位点（TSS）。(B类)GTAp63和TAp63的N-末端氨基酸序列。外显子U1编码的GTAp63的19个氨基酸长N末端以绿色突出显示，而蓝色突出显示的是外显子2编码的氨基酸序列。红色“M”表示GTAp63或TAp63平移起始处的蛋氨酸。

此外，GTAp63也是睾丸肿瘤潜在的新型抑癌候选药物。HDAC抑制可恢复睾丸癌中GTAp63的表达，其中p63的表达经常丢失。¹¹⁴因此，使用HDAC抑制剂治疗，^116,117就像目前临床使用的SAHA，¹¹⁸可能会从能量上提高常规化疗化合物的抗癌能力，^117,119与顺铂一样，通过恢复GTAp63的表达

然而，对GTAp63功能的完整理解仍有待澄清。由于Hominoide的限制“实验系统，“许多问题仍然难以捉摸。例如，一个重要问题涉及精子前体中DNA损伤反应对p53的依赖性。GTAp63是否有助于p53依赖性细胞凋亡或完全独立地发挥作用，模仿卵母细胞中的TAp63？另外的19-氨基酸N末端尾部是否允许与p53至少部分不同的启动子反应？对这种新型亚型的进一步研究对于完全阐明p63在人类生殖保真度中的作用将极为重要。

结束语

许多无脊椎动物，例如秀丽线虫和黑腹果蝇只有一个p53家族成员，在结构和功能方面与p63和p73相比更相似。p53成员来自秀丽线虫、CEP-1、，^98,99和来自D.黑腹滨鹬，Dmp53，¹⁰⁰两者都是专为种系保真度而需要的。因此，目前最受认可的理论是，从生殖系保真度控制来看，p53成员随着时间的推移在不同组织中调整其功能，控制不同的过程，包括肿瘤抑制和发展。从结构角度来看，CEP-1通过C末端结构域形成二聚体，类似于哺乳动物TAp63采用的二聚体四聚体策略，也支持了这一点。祖先的生殖作用主要由p63作为二聚体维持，而随后的肿瘤抑制作用在p53中演变为四聚体，^120,121表明了一种平行的结构-功能进化。

致谢

脚注

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