原发性乳腺癌患者循环肿瘤细胞中干细胞和上皮-间质转换标记物的表达

摘要

介绍

骨髓（BM）中的播散性肿瘤细胞（DTC）和血液中的循环肿瘤细胞（CTC）被认为是微小残留疾病（转移性疾病的前兆）的潜在替代标记物。它们在原发性乳腺癌患者的血液和BM中的存在是降低无病生存率和总生存率的一个强有力的独立预后因素[1-4]。此外，已经证明肿瘤细胞经常能在化疗后存活[5，6]并且在常规辅助化疗后持续存在于骨髓和血液中与预后不良相关[7-9].

目前讨论的关于这些细胞持续存在的一个假设是，一些DTC或CTC是癌症干细胞，被认为是原发性肿瘤转移扩散的活跃来源[10，11]。对于DTC，至少有一项研究证实了一种假定的干细胞表型，显示CD44⁺CD24型^-在所有细胞角蛋白（CK）阳性患者的骨髓中检测到细胞，而其在DTC总数中的平均发病率为72%[12].

在转移性乳腺癌患者中发现的CTC中，32%具有干细胞样表型CD44⁺CD24型^-17%的CTC对另一个最近提出的干细胞标记物醛脱氢酶1（ALDH1）阳性[13]这与不同类型乳腺癌的预后不良有关[14，15]。此外，原发性和转移性乳腺癌患者的CTC表达EGFR/HER2/PI3K/Akt通路的受体和激活的信号激酶[16]被描述为调节乳腺干/祖细胞、促进增殖和抑制凋亡的主要途径之一[17]。我们最近证明，原发性乳腺癌患者的CTC通常为三阴性[18]，这与癌症干细胞理论一致[19，20].

为了能够从原发肿瘤扩散和转移，肿瘤细胞必须经历表型变化，即上皮-间充质转化（EMT），这使得它们能够在不受常规治疗影响的情况下转移到形成转移的部位。对于CTC，EMT和干细胞特征最近在92例乳腺癌患者的所有阶段都有记录[21]。在转移性乳腺癌中，我们能够表明，癌症患者血液中发现的CTC的大部分具有EMT和肿瘤干细胞特征，表达EMT和癌干细胞标记物的CTC是耐药细胞群的指标，因此预后较差[22].

到目前为止，还没有大量原发性乳腺癌患者的数据。假设转移需要肿瘤干细胞或显示EMT的肿瘤细胞的传播，我们研究了（1）EMT标记物Akt2、磷脂酰肌醇激酶-3α（PI3K-α）和转录因子TWIST1的表达，以及（2）干细胞标记物ALDH1在502例原发性乳腺癌患者分离的CTC中的表达。数据与BM中DTC的存在和患者的临床病理数据相关。

材料和方法

结果

CTC和EMT标记物/ALDH1的相关性

进一步检查所有样本的ALDH1和EMT标记，并与CTC的存在相关。在446/502例患者中可以确定CTC检测的完整数据集、ALDH1的表达以及EMT标记物。至少有一个EMT标记在29%的样本中表达（Akt2 27%；PI3K 17%；TWIST 1%），ALDH1分别存在于14%的样本（图​（图1）。1). 在CTC中⁺组，92名患者中有66名（72%）至少一种EMT标志物呈阳性，92名患者中有42名（46%）ALDH1呈阳性。在反恐委员会^-组中，百分比分别为18%（354名患者中的63名）和5%（353名患者中有19名）（图​（图2）。2). 表​表22显示了对CTC中单个标记分布的更详细分析⁺和CTC^-组。在反恐委员会⁺EMT标记的表达率为1%（TWIST）、70%（Akt2）和52%（PI3Kα），CTC中的表达率^-组的百分比分别为1%、16%和8%（表​（表2）。2). EMT标记物或ALDH1阳性与任何临床病理因素无关。

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图1

EMT标记和ALDH1的表达至少有一个EMT标记分别在29%和14%的样本中表达。

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图2

EMT标记物和ALDH1在CTC+和CTC-患者中的表达.在反恐委员会⁺组中，92例患者中66例（72%）至少一种EMT标记物阳性，92例中42例（46%）ALDH1阳性。在反恐委员会^-组为18%（354例中63例）和5%（19/353例）。

表2

CTC阳性和CTC阴性患者EMT标志物和ALDH1的表达

	N个	电子病历	AKT公司	PI3K系列	扭转	N个	ALDH1位置
CTC阴性	354	63 (18%)	57 (16%)	28 (8%)	2（1%）	353	19 (5%)
CTC位置	92	66 (72%)	64 (70%)	48人（52%）	1（1%）	92	42 (46%)
总计	446	129 (29%)	121 (27%)	76 (17%)	3 (1%)	445	61 (14%)

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讨论

在几项临床研究中，使用美国食品药品监督管理局批准的CellSearch技术对乳腺癌中CTC的计数已经得到了很好的证实，表明在治疗开始前，原发性和转移性乳腺癌的无进展生存率和总生存率下降相关[28-31]。监测研究为乳腺癌患者的管理提供了有价值的临床信息，目前正在进行的一项前瞻性随机临床试验正在解决是否在治疗三到五周后根据CTC的持续性改变现有治疗方案的问题，而不是等待临床和转移性乳腺癌患者进展的放射学证据[SWOG S0500，clinicaltrials.gov，标识符：{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT00382018”，“term_id”：“ncT003820118”}}NCT00382018号].

尽管CTC计数对乳腺癌的预后有影响，主要是使用基于EpCAM的捕获方法，但已有研究表明，该方法无法检测到CTC的全部高度异质性人群[32，33]。此外，对其生物学特征了解甚少，据推测只有少数CTC能够发展为临床上明显的转移瘤[34]。此外，目前的观点是，EMT过程，也在原发肿瘤中，在与所谓乳腺癌干细胞生成有关的转移级联的侵袭步骤中起着关键作用[35].

考虑到所有这些因素，我们应用多标记RT-PCR分析鉴定CTC相关转录物，使用抗体“鸡尾酒”捕获上皮来源的CTC。该测试程序已成功应用于妇科癌症中CTC的检测和表征，并显示出对转移性乳腺癌患者和近期原发性卵巢癌患者的预后价值，这些患者在手术前和基于铂的化疗后检测CTC与总生存率降低显著相关[18，22，36，37]。有趣的是，最近的一份出版物表明，AdnaTest通过提高整体检测率和允许评估转移性乳腺癌患者CTC中的基因组标记物来补充CellSearch系统[38]。通过对502例原发性乳腺癌患者的分析，我们利用这项技术证明，一部分患者表现出EMT和干细胞特征，而目前使用的CTC检测方法无法有效识别经历EMT的CTC亚型或显示肿瘤干细胞表型。据我们所知，这是迄今为止公布的最大的患者队列，分析了这些CTC特征。

至少有一个EMT标记分别在29%和14%的样本中表达。最近在较小患者群体中发布的数据支持我们的数据。雷蒙迪等。研究了92例乳腺癌患者在疾病各个阶段EMT和干细胞标记物的表达。使用CTC的标准定义为EpCAM+/CK+/CD45-，作者在31/92（34%）名患者中没有发现。CTC的缺失被定义为富集的EpCAM阳性部分缺乏表达。然而，在12/31（38%）的CK阴性细胞中，他们发现EMT标记物的表达，特别是波形蛋白和纤维连接蛋白。他们得出结论，目前的CTC检测方法低估了参与癌症传播的CTC中最重要的亚群，这些亚群通常具有EMT和干细胞特征[21]。这些数据与我们的研究结果相一致，表明根据CTC阳性的临界值，ALDH1阳性的5%和EMT阳性的18%患者为CTC阴性AdnaTest乳腺癌.

鲁本等。评估原发性乳腺癌患者BM中Aldeflour+上皮细胞（CD326+CD45dim）是否存在CD44+CD24lo表型。他们报告称，具有高危肿瘤特征的原发性乳腺癌患者骨髓中CD44+CD24lo癌干细胞的百分比较高。此外，接受新辅助化疗的患者比最高水平的健康献血者更有可能获得Aldeflour+上皮细胞百分比[11].

在一项包括292名转移性乳腺癌患者在内的回顾性研究中，在患者使用CellSearch系统开始新的治疗路线之前，对CTC进行了计数。36%的患者未检测到CTC。在多变量分析中，脑转移和骨受累仍是与未检测到的CTC状态相关的独立变量。此外，荷尔蒙受体阴性、肿瘤分级高、三阴性疾病和炎性乳腺癌患者检测不到CTC的可能性增加。作者认为，这些发现可能是由于CellSearch对CTC的估计不足，部分原因是CTC正在接受EMT[39]。本研究的第二个观察结果是，骨转移的缺失与CTC状态的检测不到有显著相关性。

这再次提出了一个经常被问到的问题，即检测DTC的BM分析是否可以被检测CTC的血液采样所取代。在我们目前的研究以及我们最近发表的研究中，对431名原发性乳腺癌患者的DTC和CTC进行了比较，我们记录了骨髓和血液中存在这些细胞之间的微弱一致性，结论是这些细胞的生物学可能不同[18]。这些数据与其他比较研究一致，一般来说，DTC和CTC之间的相关性很低[40-43]。简言之，CTC的检测似乎不太敏感，预后较差，原发性乳腺癌患者的预后取决于DTC而非CTC。然而，最近发表的另外两项研究发现，RT-PCR测定CTC状态所传达的临床相关信息并不亚于乳腺癌中的DTC状态[44，45]。总之，血液分析可以为BM分析提供补充信息。

对这种现象有不同的解释。1） 梅戈所述的CTC缺席等。也可能取决于反恐委员会标准选择程序的不足。大多数选择程序仅基于EpCAM，这可能会在EMT过程中丢失。2） EMT细胞降解周围基质，也允许非EMT肿瘤细胞的分离和扩散。因此，DTC和CTC可能反映原发肿瘤的异质性肿瘤细胞群，包括分化的和更多的干细胞样肿瘤细胞。3） 人们还可能推测，骨转移需要不同的播散或上皮分化机制。

PTEN/Akt/mTOR途径已被描述为：1）作为调节乳腺干/祖细胞的主要途径之一，2）对常规治疗产生耐药性，3）在乳腺癌干细胞的生存和维持、促进增殖和抑制凋亡中发挥中心作用[17，46]。此外，接受EMT治疗的细胞对抗癌药物产生耐药性[47].

只有少数研究涉及反恐委员会的这些方面。通过使用共焦激光扫描显微镜分析28例CK阳性和17例CK阴性患者的外周血单个核细胞胞浆，在17个CK阳性样本中的15个样本中记录到磷酸化PI-3激酶（phosphoto-PI3K）[48]。在最近的一项研究中，作者分析了32例细胞角蛋白-19 mRNA阳性的早期乳腺癌患者和16例转移性乳腺癌患者的外周血单个核细胞，并报告了磷酸化PI3K/Akt在CTC中的显著比例[16]。这些数据支持本研究的数据以及我们最近发表的转移性乳腺癌的数据，这些数据表明，CTC的大部分表达PI3K、Akt2以及转录因子TWIST和ALDH1，这与治疗耐药和预后不良有关[22].

总之，CTC中干细胞和EMT标记物的表达与常规抗癌治疗的耐药性和治疗失败有关，这突显了改进检测和消除微小残留疾病工具的紧迫性[49]。因此，对于治疗和诊断意义，强烈建议检测干细胞样细胞。维持癌症干细胞的信号通路是这些治疗的诱人靶点。临床前，依维莫司（RAD001）是一种作用于PI3K/AKT通路下游的mTOR口服抑制剂，已被证明可逆转对三苯氧胺的耐药性。在一项II期研究中，与单独使用他莫昔芬相比，RAD001联合他莫昔芬可显著提高6个月的临床受益率[50]。此外，RAD001对肿瘤干细胞具有有效的抑制作用在体外和体内并且，与RAD001和多西紫杉醇或Herceptin联合治疗^®可能对难治性转移性乳腺癌有效[51]。此外，针对Shh和mTOR信号抑制的联合治疗，以及标准化疗，证明能够选择性地消除癌症干细胞[52].

锂等。证明化疗后剩余的致瘤细胞具有增强自我更新的独特特性，如乳房球的形成和肿瘤形成倾向的增加。此外，拉帕替尼并没有导致这些致瘤细胞的增加，因此，结合常规治疗，特异性通路抑制剂可以提供消除这些细胞的治疗策略，以减少复发和提高长期生存率[53]。另一种有希望的药物是盐霉素，其全球基因表达分析表明，盐霉素治疗导致乳腺癌干细胞表达缺失[54].

结论

癌症干细胞假说是一种新的范式，通过提出癌症治疗的新靶点，可能对疾病的治疗产生重大影响。目前的癌症治疗方法已显示出在去除大部分分化癌细胞的同时未能消除导致肿瘤复发的癌干细胞的有效性。以具有干细胞自我更新特性的残留细胞为靶点，结合常规化疗，可能提供一种预防癌症复发和提高长期生存率的具体方法。

缩写

AdnaGen股份公司：AdnaTest乳腺癌; AdnaGen是一家公司：AdnaTest BreastCancer是一家商业公司；CTC试验ATCC：美国组织培养文集；BM：骨髓；CK：细胞角蛋白；CTC：循环肿瘤细胞；DTC：播散性肿瘤细胞；EMT：上皮-间充质转化；MPC：磁性粒子集中器；PI3Kα：磷酸肌醇激酶-3α。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

SKB、OH和TF对研究的概念和设计、数据采集、数据分析和解释做出了重大贡献。TF和SKB参与了手稿的起草或修订。所有作者阅读并批准了最终手稿。

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