在体外，胚胎干细胞能够分化为三个胚层，即外胚层、内胚层和中胚层，模拟体内胚胎发育的早期阶段(1). 转录因子Brachury（T）在原肠胚形成过程中在原始条纹中高度表达，是中胚层形成所必需的(2). 的突变Brachyury公司小鼠体内的基因导致后中胚层形成缺陷，脊索形态发生失败，并在妊娠10天左右导致胚胎死亡(2).Brachyury公司在中胚层和ES细胞中，Wnt/β-catenin信号直接调节其表达。Wnt/β-catenin信号传导促进β-catentin的去磷酸化，β-caterin进入细胞核并结合转录因子LEF1/TCF1激活Brachyury公司表达式(三,4). Brachyury还积极调节Wnt/β-catenin信号传导。Brachyury和Wnt/β-catenin信号之间的这种积极的自我调节环维持了中胚层祖细胞，并且对脊椎动物的后中胚层发育至关重要(5).
多囊抑制复合物2（PRC2）对ES细胞的正确分化至关重要。PRC2定位于ES细胞中的大量发育调节基因上。ES细胞中PRC2的破坏显著降低了H3K27二甲基化和三甲基化（H3K27me2和H3K27me3）的整体水平，并导致许多发育调节基因的上调(6,7).
UTX属于JmjC结构域蛋白的一个亚家族，也包括UTY和JMJD3。此前，我们和其他人将UTX和Jmjd3鉴定为组蛋白H3K27去甲基酶(8–12).UTX公司基因位于X染色体上，而丁基该基因位于Y染色体上，因此仅在雄性细胞中表达。UTY是X连锁UTX的同源序列，与UTX蛋白具有88%的序列同源性。与UTX不同，UTY在体外缺乏可检测的组蛋白去甲酶活性(8,12). 男性和女性的生存能力数据UTX公司KO小鼠表明在雄性胚胎发育期间UTX和UTY之间存在大量功能冗余(13).
UTX已被证明可以调节心肌细胞分化、心脏发育和T-box转录因子靶基因表达(13–15). 然而，UTX在ES细胞分化和早期胚胎发育中的作用尚不清楚。使用UTX公司KO、条件KO和酶解敲除ES细胞，这里我们表明，UTX，而不是其H3K27脱甲基酶活性，是ES细胞分化为中胚层所必需的。从机械上讲，UTX和UTY是冗余的，它们直接控制Brachyury公司是中胚层分化的主要调控因子。始终是女性UTX公司KO公司(UTX公司−/−)胚胎，但不是男性UTX公司KO公司(UTX公司−/年)表示丁基通常，在Brachyury公司表达和中胚层发育。
结果
的生成UTX公司雄性ES细胞系中的KO、条件性KO和酶解敲入。
大多数ES细胞系，包括这里使用的细胞系，都是男性，携带一个UTX公司和一个等位基因丁基为了研究UTX在ES细胞分化和动物发育中的作用，我们建立了雄性UTX公司基因靶向条件KO（flox）ES细胞系(). 外显子24两侧有两个液氧flox等位基因中的P位点。Cre重组酶从flox等位基因中删除第24外显子导致KO等位基因。外显子24编码的His1146（H1146）和Glu1148（E1148）对UTX脱甲基酶活性至关重要(11,16). 为了鉴定依赖于其去甲基化酶活性的UTX功能，我们还通过将内源性UTX的H1146和E1148突变为Ala来产生酶死敲除（KI）等位基因(). flox的基因型(UTX公司flox/Y; Y代表UTY），KI(UTX公司KI/Y（开/关）)和KO(UTX公司−/年)细胞系经基因组PCR证实(图S1A类和B类). KI等位基因中的H1146A和E1148A突变通过测序得到证实(图S1C类). UTX在flox和KI细胞中的表达水平相似，但在KO细胞中没有表达(). 组蛋白脱甲基酶体外试验证实H1146和E1148对UTX脱甲基酶活性至关重要(图S1D类). 来自KI ES细胞的内源性UTX也缺乏H3K27脱甲基酶活性(). 定量反转录酶PCR（qRT-PCR）证实KO细胞第24外显子缺失。有趣的是，丁基flox和KI细胞的mRNA水平相似，但在UTX公司KO细胞表明，在男性ES细胞中，UTX蛋白（而非其酶活性）控制着丁基表达式().
的特征UTX公司KO、条件KO和敲除男性ES细胞。(A类)鼠标示意图UTX公司野生型（WT）等位基因、靶向等位基因，条件KO（flox）等位蛋白，酶解敲除（KI）等基因和KO等位基因。FLP重组酶从靶向等位基因中删除新选择盒产生flox等位基因。Cre从flox等位基因中删除第24外显子产生KO等位基因。KI等位基因第24外显子携带H1146A和E1148A突变（以红色星号表示）。(B类)flox核提取物的免疫印迹(UTX公司flox/Y; Y代表UTY），KI(UTX公司KI/Y（开/关）)和KO(UTX公司−/年)使用指定抗体的ES细胞。(C类)KI ES细胞中内源性UTX缺乏H3K27脱甲基酶活性。核提取物由稳定表达FLAG标记PA1的flox、KI和KO细胞制备，PA1是MLL3/4组蛋白甲基转移酶复合物的一个独特亚单位，与UTX密切相关(11,32). 如前所述，通过使用抗FLAG抗体亲和纯化MLL3/4复合物，从核提取物中去除内源性UTX(32)然后使用JMJD3/UTX脱甲基酶活性检测试剂盒（表观酶编号P-3084）进行脱甲基酶检测。(左侧)免疫沉淀内源性UTX和FLAG-PA1的免疫印迹。(赖特)脱甲基酶分析。(D类)UTX，但不是其去甲基化酶活性，控制丁基在男性ES细胞中表达。UTX公司和丁基用qRT-PCR分析mRNA水平。缺席UTX公司KO细胞中的表达用星号表示。(E类)UTX对ES细胞的自我更新是必不可少的。用qRT-PCR分析未分化ES细胞标记物的表达。(F类)删除UTX公司在ES细胞分化过程中，对H3K27me3的整体水平影响不大。将flox和KO ES细胞在无LIF的情况下培养0、1、3或5d。通过免疫印迹分析核提取物。所有图中的定量PCR数据均以平均值±SD表示。
删除UTX公司以及随后的损失丁基不影响ES细胞自我更新关键转录因子的表达，包括Nanog、Oct4、Sox2和Tcl1(17) (). ES细胞中UTX和UTY的缺失对群体倍增时间和克隆形成能力也几乎没有影响(图S2A类和B类). 此外，未分化ES细胞的标记物碱性磷酸酶在flox和KO细胞中的表达水平相似(图S2C类). 从培养基中去除细胞因子LIF将启动在缺乏成纤维细胞饲养细胞的情况下培养的ES细胞的自发分化(18). 碱性磷酸酶染色显示，与flox细胞相比，去除LIF后KO细胞形成了数量相近的分化集落(图S2C类). 这些结果表明，UTX和UTY对ES细胞的自我更新和初始分化潜能是不可或缺的。
我们还检测了在细胞自发分化过程中全球H3K27me3和H3K17ac水平UTX公司KO电池。与之前的报告一致(19)在ES细胞自发分化过程中，Ezh2和H3K27me3水平均下降。然而，删除UTX公司未导致全球H3K27me3和H3K17ac水平发生明显变化(). 有趣的是，UTX蛋白水平随着Ezh2蛋白水平的降低而降低，这表明分化细胞中H3K27me3水平的降低是由于Ezh2水平的降低。
据报道，UTX将监管霍克斯基因以及编码Rb结合蛋白的基因(10–12,20). 然而，我们发现ES细胞中UTX和UTY的丢失并不影响维甲酸（RA）诱导的霍克斯b1表达式，构成表达式霍克斯b7或编码Rb结合蛋白的基因的表达，如HBP1和RbBP6(图S3A–C和E类). 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）也获得了类似的结果(图S3D类和F类). 因此，UTX和UTY对于霍克斯ES细胞和MEF中编码Rb结合蛋白的基因和基因。
UTX独立于H3K27脱甲基酶活性控制ES细胞的中胚层分化。
接下来，我们使用成熟的方案研究了胚胎干细胞分化是否需要UTX(7,19,21–23). 细胞在没有LIF的培养皿上培养，形成三维多细胞聚集物，称为类胚体（EB）。EB的分化重述了胚胎原肠胚形成期间所有三个初级胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的生成(1). 用RA处理EB，以促进ES细胞沿着神经外胚层系分化，并成为表达Nestin和Tubb3（β-III Tubulin）的神经元前体（NP）细胞(21). 免疫染色显示Tubb3在flox和KO细胞中都有强烈表达(图S4A类). 通过检测分化前后的基因表达，我们观察到ES细胞标记物显著减少纳克和10月4日NP标记显著增加内斯汀和管3在flox和KO细胞中(图S4B类). 这些结果表明UTX对RA诱导的ES细胞向NP细胞分化是不必要的。
为了研究胚胎干细胞的中胚层和内胚层分化是否需要UTX，在没有RA的情况下培养胚胎干细胞12天(23)，因为RA强烈抑制中胚层分化(5). 正如预期的那样，从第8天开始，flox细胞形成囊性EB。相反，KO细胞形成更小的EB，没有明显的囊性形态，表明存在严重的分化缺陷(). 与形态一致，在flox细胞分化过程中，ES细胞标记物的表达纳克和10月4日中胚层标记物表达显著降低Brachyury公司和重量3显著增加，第4天达到峰值，然后下降。相比之下，KO EB保留了纳克和10月4日表达和诱导失败Brachyury公司和重量3在分化过程中。内胚层标记物的诱导Gata4公司和Gata6公司基本上不受UTX公司删除(). 使用携带酶死亡的KI细胞重复相同的实验UTX公司等位基因。令人惊讶的是，KI细胞表现出与flox细胞相同的现象，这表明UTX的酶活性对于ES细胞的中胚层分化是不必要的(). 总之，这些结果表明UTX独立于其H3K27脱甲基酶活性控制ES细胞的中胚层分化。
UTX独立于H3K27脱甲基酶活性控制ES细胞的中胚层分化。(A类)分化前flox、KI和KO ES细胞以及分化第4天、第8天和第12天EB的显微照片。(B类)ES细胞标记物的qRT-PCR分析(纳克,10月4日)，中胚层标记(Brachyury公司,重量3)和内胚层标记(Gata4公司,Gata6公司)在指定的分化时间点。D2、D4、D8和D12分别指第2天、第4天、第8天和第12天。
Brachyury公司是ES细胞中的直接UTX靶基因。
了解中胚层分化缺陷的机制UTX公司KO细胞，我们比较了flox和KO细胞之间的基因表达谱。微阵列分析显示UTX公司在ES细胞中，141个基因的表达减少了2.5倍以上(表S1). 基因本体论分析显示，52个基因与发育过程有关，这是最重要的功能类别(). qRT-PCR证实删除了UTX公司发育基因表达减少，如Brachyury公司,Fgf5型,嗯2,坑x2,重量3、和重量1在未分化的ES细胞中。然而，ES细胞标志物的表达纳克和10月4日和内胚层标记Gata6公司和Hnf4a型基本上没有受到影响(). 尽管表达了Brachyury公司和重量3KO细胞中表达节点是中胚层分化的另一个关键调节因子，不受UTX公司删除。通过对flox和KO细胞的染色质免疫沉淀（ChIP）分析，我们观察到内源性UTX在细胞的近端启动子上的特异性富集Brachyury公司但没有检测到任何其他基因(). 因此，UTX直接选择性地调节Brachyury公司ES细胞中的基因。由于Brachyury对中胚层的形成至关重要Brachyury公司作为UTX的直接靶基因，UTX控制ES细胞中胚层分化的可能机制。
Brachyury公司是ES细胞中的直接UTX靶基因。(A类)微阵列中确定的下调基因的基因本体（GO）分析。基因减少2.5倍以上UTX公司KO细胞与flox细胞进行GO分析。深蓝色条表示观察到的特定GO类别中下调基因的百分比。红色条表示MGI数据库中记录的所有GO基因在整个小鼠基因组中的预期百分比。P（P）每个项的值都是通过费希尔精确检验确定的。(B类)通过qRT-PCR确认微阵列数据。(C类)对flox和KO ES细胞中指示基因的近端启动子进行UTX的ChIP分析。
Wnt/β-连环蛋白信号诱导需要UTX和UTYBrachyury公司表达式。
因为Brachyury公司是Wnt/β-catenin信号传导的直接靶基因(三,4)，我们用BIO（GSK3β激酶的小分子抑制剂和Wnt/β-catenin信号的强效激活剂）处理ES细胞，以诱导Brachyury公司表达式(24). 删除UTX公司在ES细胞中严重受损BIO诱导的Brachyury公司表达。相反，BIO诱导Brachyury公司KI细胞表达正常()表明Wnt/β-catenin信号转导需要UTX蛋白，而不是其去甲基化酶活性Brachyury公司在ES细胞中表达。
Wnt/β-catenin信号诱导需要UTXBrachyury公司表达式。(A类–D类)将flox、KI和KO ES细胞在0.1%明胶包被的培养皿上传代两次以去除饲养细胞，然后在明胶包被的培养皿上培养。在没有LIF的情况下，用2μM BIO处理细胞48小时。(A类)BIO诱导的Brachyury公司在ES细胞中表达。Brachyury公司通过qRT-PCR测定表达。(B类)的示意图Brachyury公司包含Wnt/β-catenin信号转导TCF1/LEF1结合位点的近端启动子。(C类)在指定区域进行UTX的ChIP分析Brachyury公司基因。(D类)对UTX、RNA聚合酶II（Pol II）水平的ChIP分析表明，组蛋白修饰和PRC2的Suz12亚单位位于TCF1/LEF1结合位点周围Brachyury公司近端启动子。(E类)UTX和UTY作为TCF1辅活化子发挥作用，与去甲基化酶活性无关。用30 ng TCF1质粒、30 ng TOPFlash或FOPFlash以及150 ng pCS2质粒转染HeLa细胞，这些质粒表达野生型（UTXwt）或酶死亡（H1146A和E1148A）突变型UTX（UTXmt）或UTY。20小时后，用2μM BIO处理细胞24小时，然后使用双荧光素酶检测试剂盒（Promega）进行荧光素素酶检测。
ChIP分析显示UTX在Wnt/β-catenin应答TCF1/LEF1结合位点周围区域富集Brachyury公司发起人(). BIO治疗增加了UTX水平Brachyury公司flox和KI细胞中的启动子，但KO细胞中没有(). 与生物诱导的Brachyury公司中的表达式、BIO诱导的RNA聚合酶II（Pol II）富集以及组蛋白阳性标记H3K27ac和H3K4me3Brachyury公司flox和KI细胞中的启动子，但KO细胞中没有。有趣的是，BIO在Brachyury公司flox和KI细胞中的启动子，但KO细胞中没有，这可能是由于同一启动子上PRC2（以Suz12亚单位表示）的缺失(). 这些结果表明UTX直接调节Wnt/β-catenin信号诱导Brachyury公司ES细胞中的表达与H3K27脱甲基酶活性无关。
接下来，我们询问酶不活跃的UTY是否可以补偿ES细胞中UTX的损失。因为内源性UTY水平在UTX公司KO ES细胞，我们在KO细胞中稳定表达人类UTY(图S5A类). 有趣的是，UTY在UTX公司KO细胞不仅拯救了BIO诱导的Brachyury公司表达式(图S5B类)，但生物诱导的Pol II、H3K27ac和H3K4me3增加，H3K17me3和Suz12减少Brachyury公司发起人(图S5C类). 此外，BIO诱导UTY富集到UTX结合的同一区域Brachyury公司发起人(图S5C类).
接下来，我们使用包含七个TCF/LEF结合位点重复的β-catenin响应荧光素酶报告子TOPFlash，以FOPFlash作为阴性对照，测试UTX和UTY是否可以调节TCF1转录活性。我们发现，不仅野生型和酶死亡的UTX，而且UTY都能够增强BIO诱导的TCF1转录活性(). 总之，这些结果表明，UTX和UTY作为TCF1共激活因子，促进Wnt/β-catenin信号传导诱导Brachyury公司ES细胞中的表达与H3K27脱甲基酶活性无关。
UTX是必需的Brachyury公司小鼠的表达和中胚层发育。
为了验证ES细胞的结果，我们敲除了UTX公司小鼠的基因。因为女性早期胚胎致死UTX公司KO小鼠（见下文），我们首先产生了雄性KO小鼠(UTX公司−/年)通过杂交雄性野生型(UTX公司+/Y（Y）)与女性UTX公司+/−老鼠(图S6A类). 男性UTX公司KO小鼠可以存活到胚胎发育结束，但由于神经管闭合缺陷和无法呼吸，在出生前后死亡(图S6B类和C类). 因此，删除单个UTX公司雄性小鼠的等位基因不影响中胚层发育。与男性ES细胞不同UTX公司在男性胚胎中没有影响丁基表达式(图S6D类)表明UTX和UTY在调节男性胚胎中胚层发育方面存在功能冗余。
接下来，我们删除了UTX公司在雌性小鼠中丁基基因缺失。因为男性的围产期致死UTX公司KO小鼠，雌性UTX公司flox/flox公司小鼠与雄性杂交项目1-在精子特异性控制下表达Cre的Cre小鼠项目1发起人。由此产生的男性UTX公司flox/Y;项目1-Cre小鼠UTX公司精子中的缺失与雌性杂交UTX公司+/−产生女性UTX公司KO公司(UTX公司−/−)胚胎(). 与最近的报告一致(13),UTX公司−/−雌性胚胎在胚胎期E10.5后无法存活，尽管退化死亡UTX公司−/−胚胎在E11.5被发现(). E 9.5–10.5中的绝大多数UTX公司−/−胚胎后体异常或截短(和图S6F类)，哪个表型纯合子Brachyury公司突变小鼠(25). 在其余两个E9.5中UTX公司−/−后体形成相对完整的胚胎，我们观察到明显减少Brachyury公司表达式(和图S6E类).
UTX是必需的Brachyury公司表达和小鼠中胚层发育。(A类)繁殖雌性的交配策略UTX公司KO胚胎(UTX公司−/−)和基因分型结果。括号中显示了患有头脑畸形的胚胎数量。(B类)减少Brachyury公司女性而非男性的表达UTX公司KO E9.5胚胎。Brachyury公司被WISH检测到。黑色箭头表示尾芽和脊索后部Brachyury公司希望能表达。(C类)UTX公司−/−女性胚胎在神经管闭合、心脏发育和造血方面存在缺陷。图中显示了E10.5和E11.5胚胎的代表性图像，这些胚胎具有指定的基因型。在UTX公司−/−胚胎。红色箭头表示主动脉-肾小球-中肾中的红细胞，在UTX公司−/−胚胎。星号表示心脏积液UTX公司−/−胚胎，表现为心包囊肿胀。白色箭头指向神经管闭合的缺陷。
在E10.5野生型胚胎中，在主动脉-肾小球-中肾中可见红细胞，早期造血干细胞在此出现(26). 相反，在UTX公司−/−胚胎，提示UTX在造血中的关键作用(). 大多数UTX公司−/−胚胎在心脏发育和神经管闭合方面也表现出严重缺陷(). 相反，男性UTX公司KO室友(UTX公司−/年)在E 9.5–10.5时，除部分神经管闭合缺陷外，形态正常()这表明UTX和UTY在调节中胚层发育方面在很大程度上是多余的。综上所述，这些结果表明需要UTXBrachyury公司表达和小鼠中胚层发育。
讨论
在本文中，我们展示了UTX控件丁基在ES细胞中的表达与其酶活性无关。删除UTX公司以及随后的损失丁基不影响全球H3K27me3水平，霍克斯基因表达或ES细胞自我更新。然而，UTX（而非其酶活性）对中胚层分化和Brachyury公司在ES细胞中的表达。与ES细胞不同，UTX对于丁基在小鼠中表达。UTX和酶不活性UTY在早期胚胎发育中功能冗余。女性UTX公司KO小鼠，缺乏丁基基因，显示严重缺陷Brachyury公司表达和中胚层发育。总之，这些结果表明UTX蛋白在调节中胚层发育和Brachyury公司表达式。
UTX对ES细胞分化的调节。
最近，Lee等人报告说，UTX对于ES细胞自我更新是必不可少的，并且UTX对于丁基在ES细胞中表达，但在胚胎中不表达(13)，这与我们的结果一致。我们进一步证明UTX控件丁基表达独立于其酶活性。然而，UTX在中胚层分化和Brachyury公司Lee等人未观察到ES细胞中的表达(13). 这种差异的原因是我们在没有RA的情况下诱导EB向中胚层分化(21,22)但Lee等人包括RA。研究表明，类风湿关节炎通过下调基因表达强烈抑制中胚层分化Brachyury公司表达式(5). 我们始终发现RA强烈抑制Brachyury公司ES细胞分化过程中的表达(图S7). 我们的ES细胞数据与我们对UTX在中胚层发育和Brachyury公司在小鼠中表达。
的规定Brachyury公司UTX表示。
我们的发现Brachyury公司是一个直接的UTX靶基因，并且UTX是Wnt/β-catenin信号诱导所必需的Brachyury公司ES细胞中的表达为解释UTX在ES细胞向中胚层分化中的重要作用提供了一种机制。这些结果也与最近的报告一致，即Wnt/β-catenin信号对在适当条件下培养的ES细胞的自我更新是不必要的（即在有LIF存在的饲养细胞上），并且Wnt/？-catenin信号似乎是ES细胞分化期间中胚层形成的选择性所需(27).
我们证实了之前的一份报告Brachyury公司表达伴随着PRC2和PRC2介导的H3K27me3在Brachyury公司发起人(24). 然而，BIO处理降低了H3K27me3Brachyury公司在flox和KI细胞中都有启动子，但在KO细胞中没有，表明UTX调节Wnt/β-catenin信号传导诱导Brachyury公司表达与H3K27脱甲基酶活性无关。因为PRC2和H3K27me3对于BIO诱导的Brachyury公司ES细胞中的表达(24)，无需获得激活所涉及的H3K27脱甲基酶活性Brachyury公司表达式。BIO诱导的H3K27me3减少Brachyury公司启动子可能是由于另一种H3K27去甲基酶Jmjd3，它被募集到Brachyury公司BIO处理后的促进剂(24). 然而，尚不清楚生物诱导的Brachyury公司表达式。
UTX已被证明作为转录辅激活剂发挥作用，并招募Brg1染色质重塑复合体，以促进T细胞和心肌细胞中靶基因的启动子可及性(13,14). UTX是否招募Brg1综合体Brachyury公司该启动子尚待研究。与UTX的共同激活者角色一致，在Pol II招募中需要UTXBrachyury公司发起人。
UTX和UTY对早期胚胎发育的调节。
的突变Brachyury公司在小鼠中导致脊索后部组织异常和后部截断(25). 符合UTX对Wnt/β-catenin信号诱导的要求Brachyury公司在ES细胞中表达，UTX公司−/−胚胎出现后部截断和减少Brachyury公司表达。有趣的是，击倒UTX公司斑马鱼的脊索后部也会被截断，后部结构异常，表明背部中胚层的形成有缺陷(12). 总之，这些结果表明UTX在中胚层发育中具有进化保守的作用。
除了先前报道的女性心脏发育缺陷外UTX公司KO小鼠与雌雄神经管闭合缺陷UTX公司KO小鼠(13,28)，我们观察到女性贫血UTX公司KO小鼠。因为造血细胞和心肌细胞都来自中胚层(1)，中胚层发育缺陷可能导致贫血和心脏发育受损UTX公司−/−胚胎。UTX在调节造血和心脏发育中是否发挥直接的组织特异性作用需要删除UTX公司以组织特异的方式。UTX可能调节其他Wnt靶基因的表达，这也可能有助于调控中胚层发育。然而，Brachyury是中胚层发育的主要调控者。的规定Brachyury公司UTX的表达可能代表UTX在中胚层发育中作用的主要机制。
我们的数据表明UTX和UTY是多余的，它们独立于去甲基化酶活性来调节早期胚胎发育。与我们的结果高度一致，最近的一篇论文报道说秀丽隐杆线虫UTX以非甲基化酶活性依赖的方式对正常发育至关重要(29). 然而，事实上UTX公司+/−小鼠表现正常，而雄性UTX公司−/年小鼠表现出围生期致死性，表明UTX和UTY在围生期/产后发育中具有不同的功能。已知UTY缺乏可检测的脱甲基酶活性(8,12)，UTX的H3K27脱甲基酶活性可能参与胚胎晚期和/或出生后发育。生成酶解UTX公司KI小鼠将有助于理解UTX去甲基化酶活性的生理作用。
材料和方法
质粒、抗体、化学品、细胞培养和分化。
有关详细信息，请参见SI材料和方法.UTX公司flox/flox公司从E12.5中分离出一级MEFUTX公司flox/flox公司雌性胚胎。MEF的3T3永生化和逆转录病毒感染如所述进行(30).
的生成UTX公司KO、flox和KI ES细胞系。
基因靶向构建物的设计及其基因分型UTX公司KO、flox和KI ES细胞系在SI材料和方法（另请参见和图S1A类). 对于flox、KO和KI ES细胞系，通过PCR筛选鉴定出三个单独的菌落，并用于表征和分化实验。
的生成UTX公司KO和条件性KO小鼠。
UTX条件性KO阳性的产生(UTX公司弗洛克斯/Y)和女性(UTX公司flox/flox公司)小鼠，以及繁殖的交配策略UTX公司KO公(UTX公司−/年)和女性(UTX公司−/−)小鼠，如中所述SI材料和方法（另请参见图S6A类和). 所有小鼠实验均获得了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）动物护理和使用委员会的批准。
