基因发育。 2012年9月15日； 26(18): 2009–2014.
TAp73缺失通过代谢失调加速衰老 , 1 , 1 , 2 , 三 , 2 , 4 , 4 , 1 , 1 , 1, 5, 6, 7 和 2, 6, 7
亚历山德罗·鲁菲尼 1 英国莱斯特LE1 9HN莱斯特大学毒理学组医学研究理事会；
玛丽亚·维多利亚·尼基森·奇鲁 1 英国莱斯特LE1 9HN莱斯特大学毒理学组医学研究理事会；
井上佐治 2 加拿大安大略省多伦多市玛格丽特公主医院坎贝尔家庭乳腺癌研究所M5G 2C1；
理查德·托马西尼 三 Stress Cellulaire，Parc Scientifique et Technologique de Luminy，Unite 624，Institute National de la Sante et de la Recherche Medicale，法国马赛13288；
艾萨克·S·哈里斯 2 加拿大安大略省多伦多市玛格丽特公主医院坎贝尔家庭乳腺癌研究所M5G 2C1；
阿里安娜·马里诺 4 意大利罗马大学Tor Vergata内科，罗马00133；
马西莫·费德里奇 4 意大利罗马大学Tor Vergata内科，罗马00133；
大卫·丁斯代尔 1 英国莱斯特LE1 9HN莱斯特大学毒理学组医学研究理事会；
理查德·A·奈特 1 莱斯特大学毒理学部门医学研究委员会，莱斯特LE1 9HN，英国；
格里·梅利诺 1 英国莱斯特LE1 9HN莱斯特大学毒理学组医学研究理事会；
5 意大利罗马大学Tor Vergata生物化学IDI-IRCCS实验室实验医学和外科
麦德华 2 加拿大安大略省多伦多市玛格丽特公主医院坎贝尔家庭乳腺癌研究所M5G 2C1；
1 英国莱斯特LE1 9HN莱斯特大学毒理学组医学研究理事会；
2 加拿大安大略省多伦多市玛格丽特公主医院坎贝尔家庭乳腺癌研究所M5G 2C1；
三 Stress Cellulaire，Parc Scientifique et Technologique de Luminy，Unite 624，Institute National de la Sante et de la Recherche Medicale，法国马赛13288；
4 意大利罗马大学Tor Vergata内科，罗马00133；
5 意大利罗马大学Tor Vergata生物化学IDI-IRCCS实验室实验医学和外科
6 这些作者对这项工作做出了同样的贡献。
2012年6月1日收到； 2012年7月30日验收。
了解衰老的分子途径和生理过程具有普遍重要性。 p53家族成员TAp73含有转录激活域，已知在癌症中起作用。 在此，Rufini等人表明，TAp73通过调节COX多聚蛋白复合物的亚单位Cox4i1的表达，从而影响线粒体呼吸并阻止活性氧物种的积累，在人类和小鼠细胞的衰老中起到保护作用。
关键词： p73、p53、衰老、衰老、代谢、活性氧、线粒体
摘要 衰老与活性氧（ROS）清除受损有关。 在这里，我们证明了TAp73，一个p53家族成员，通过调节线粒体活性和防止活性氧的积累来防止衰老。 TAp73-null小鼠表现出更明显的衰老，氧化损伤和衰老增加。 TAp73缺失降低了细胞ATP水平、耗氧量和线粒体复合物IV活性，同时增加了ROS的产生和氧化应激敏感性。 我们发现线粒体复合体IV亚单位细胞色素C氧化酶亚单位4( Cox4i1公司 )是TAp73的直接靶点，Cox4i1敲除现象复制了TAp73-null细胞的细胞衰老。 结果表明，TAp73影响线粒体呼吸和ROS稳态，从而调节衰老。
关键词： p73、p53、衰老、衰老、代谢、活性氧、线粒体
衰老是一种渐进性的功能衰退，它会损害健康，并易患癌症和神经变性等疾病。 几种机制影响寿命，如胰岛素/IGF信号传导改变、干细胞耗竭以及活性氧清除受损导致的氧化损伤增加( 肯尼亚2010 ). 除了雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶点和叉头盒O（FOXO）的AMP-activated protein kinase（AMPK）调节器外，衰老的代谢途径还涉及AMPK激活的PPARγ辅活化子1α（PGC1α），一种线粒体功能调节器( Sahin和Depinho 2012 ). 事实上，线粒体生物能量学降低，加上活性氧生成增加，与衰老有关( Balaban等人，2005年 )表明进行性线粒体功能障碍在衰老过程中起着重要作用。
p73和p63已被确定为p53家族的祖先成员( Belyi等人，2010年 ); 因此，p73是肿瘤抑制转录因子p53的结构和功能同源物，可以通过调节p53应答基因来调节细胞周期阻滞和凋亡，以应对DNA损伤( Melino等人，2002年 ; Levine等人，2011年 ). 尽管序列和结构高度相似，但小鼠模型揭示了p73的神经发育和p63的表皮形成中的关键作用，这与p53基因敲除小鼠的肿瘤敏感性不同。 这个 Tp73型 基因通过两个不同的启动子表达为带有或缺少反式激活域（TAp73）的蛋白质( Melino等人，2002年 ). 虽然与肿瘤发生的调节和化疗反应有关( Melino等人，2002年 )，p73对中枢神经系统的正常发育至关重要( Yang等人，2000年 ; Tomasini等人，2008年 ; Wilhelm等人，2010年 ). 事实上，选择性TAp73敲除小鼠会发生肿瘤并表现出海马发育不全( Tomasini等人，2008年 )而ΔNp73基因敲除小鼠不会发生肿瘤，但会出现中度神经退行性变的晚期症状( Wilhelm等人，2010年 ).
在这里，我们报道了TAp73通过直接反式激活线粒体复合体IV亚基细胞色素C氧化酶亚基4来调节线粒体呼吸的能力( Cox4i1公司 ). TAp73缺陷小鼠中Cox4i1的减少会导致继发于线粒体功能障碍的过早衰老，ROS生成增加，而TAp73敲除细胞与Cox4i的互补可以挽救线粒体耗氧量的减少。
结果和讨论 我们先前确定TAp73缺乏会使小鼠容易发生肿瘤( Tomasini等人，2008年 ). 为了评估TAp73的缺失是否也会影响衰老过程，我们研究了老年无肿瘤动物的一些与年龄相关的特征。 首先，TAp73基因敲除小鼠的存活率降低（平均19.1±1.2个月，50%的存活率[ n个 =22]，而野生型小鼠为25.0±2.1 mo[ n个 = 18]; P（P） <0.01）（另见 Tomasini等人，2008年 ). 此外，18个月龄的TAp73基因敲除小鼠体重较低，体脂百分比下降，尤其是皮下脂肪( ; 补充图1A）与它们的野生型对照进行比较。 敲除小鼠也有严重后凸的放射学证据( )表皮明显变薄（补充图1B），角膜变性（补充图2C）。 此外，当进行毛发生长试验时，与野生型小鼠的强健生长相比，所有TAp73完整动物在剃须后20天基本上没有毛发生长（补充图1D）。 IGF1血清水平在衰老过程中降低，TAp73基因敲除小鼠的IGF-1血清水平也降低（补充图1E）。 几个器官的蛋白质印迹分析显示p16水平升高，p16是一种公认的衰老生物标志物( ; Krishnamurthy等人，2004年 ; 数据未显示）。 最后，羰基的免疫印迹显示敲除小鼠肝脏、肾脏和肺部的氧化蛋白水平增加( )表明体内氧化应激增加。 总之，这些数据表明，TAp73缺乏会加重与年龄相关的特征，并增加体内氧化应激和衰老标记物的表达。
TAp73缺失加速衰老。 ( 一 )影响TAp73基因敲除（KO）动物体重减轻( n个 = 8). 平均值±标准偏差( B类 )用Lunar PIXImus密度计测量体脂百分比( n个 = 8). 平均值±标准偏差( C类 )射线照相显示18个月龄TAp73基因敲除小鼠的脊柱后凸增强。 ( D类 )用Western blot检测老年动物器官提取物中p16的水平。 采用Tubulin作为负荷控制。 ( E类 , 顶部 )18个月龄野生型（WT）和TAp73基因敲除小鼠指示器官中羰基化蛋白的水平。 ( 底部 )器官提取物考马斯染色显示负载均匀。 ( F类 )与野生型对照相比，晚传代（P8）TAp73敲除MEF的增殖能力降低。 ( G公司 )SA-β-Gal阳性衰老MEF的量化。 平均值±标准偏差( H（H） )衰老标志物p16和p19的蛋白质印迹 农业研究基金 在后期（P8）MEF中。 采用Tubulin作为负荷控制。
为了研究TAp73基因敲除小鼠加速衰老的机制，我们从胚胎第14.5天（E14.5）的空白胚胎和对照胚胎中制备了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），根据标准3T3方案在体外传代，并评估了它们在晚期传代中经历复制性衰老的倾向（P7-P8） 我们发现，与野生型对应物不同，晚传代TAp73敲除的MEFs停止增殖( )并显示β-半乳糖苷酶活性增加（SA-β-gal）( )表明TAp73缺失在体外引发衰老。 由于衰老细胞也显示p19的表达增加 农业研究基金 和p16，我们研究了这些标记的表达。 一直以来，晚传代TAp73敲除MEF表达p19水平增加 自动射频 与野生型细胞相关的p16蛋白( ). 总的来说，这些数据表明，TAp73的缺失会加速体外衰老，支持在基因敲除动物中观察到的与年龄相关的症状。
先前的研究表明，小鼠成纤维细胞的衰老是持续氧化损伤的结果( Parrinello等人，2003年 )在标准培养条件下。 事实上，MEF在大气（即20%）氧气中培养时会积累氧化损伤。 这种“氧气敏感性”减缓了细胞增殖并触发衰老，而衰老可以通过将生长条件转换为3%的氧气来恢复( Parrinello等人，2003年 ). 因此，我们推断TAp73的缺失可能会使细胞对氧化损伤敏感。 为了测试这种可能性，我们用0.5 mM过氧化氢（H 2 O（运行） 2 )并通过碘化丙啶（PI）排除法检测细胞死亡。 值得注意的是，TAp73基因敲除MEF对H的敏感性高于野生型MEF 2 O（运行） 2 -诱导死亡，细胞死亡增加～50%( ). 接下来，我们研究了氧浓度对早期传代MEF（P2）增殖能力的影响。 在20%氧气环境中培养6天后，TAp73敲除细胞较少，尽管敲除细胞和野生型细胞在低氧环境中培养时增殖相同（3%）( ). 通过添加抗氧化剂，TAp73敲除MEF的生长迟缓也得到了类似的补救( ). 值得注意的是，抗氧化剂还能够逆转野生型和TAp73基因敲除小鼠晚期传代MEF中p16和SA-β-Gal的积累（补充图2），进一步支持了氧化损伤导致小鼠成纤维细胞衰老的观点。 总的来说，这些数据表明TAp73可以保护机体免受氧化损伤，其耗竭会减缓细胞增殖，并导致衰老，从而增加对氧相关损伤的敏感性。
TAp73敲除早期传代MEF中线粒体功能降低和活性氧失衡。 ( 一 )野生型（WT）和TAp73敲除型（KO）MEF（p2）未经治疗（CTRL）或用0.5 mM H激发 2 O（运行） 2 （H） 2 O（运行） 2 )PI染色和流式细胞仪检测细胞死亡。 平均值±标准偏差( B类 )野生型和TAp73敲除的MEF在20%和3%氧气浓度下生长。 细胞数量表示为野生型对照的折叠。 平均值±标准偏差( C类 )用载体（CTRL）或30μM Trolox/30μM抗坏血酸抗氧化混合物（AO）处理野生型和TAp73敲除型MEF。 细胞在计数前生长72小时。 细胞数量表示为野生型对照的折叠。 平均值±标准偏差( D类 )ROS荧光团DCFDA对TAp73敲除的MEFs的染色增加。 ( E类 )野生型和TAp73敲除型MEF的状态III耗氧量。 用Oroboros血氧饱和度仪测量耗氧量，并将其归一化为细胞数。 状态III是通过添加ADP诱导的。 ( F类 )用MEF测量NADH水平，并将其归一化为蛋白质含量。 平均值±标准偏差( G公司 )减少野生型和TAp73基因敲除小鼠肺部和肾脏的耗氧量。 数据以野生型对照的百分比表示( n个 = 3). ( H（H） )线粒体O的测量 2 − 与MitoSox Red在野生型和淘汰型MEF中的水平相同。 ( 我 )MEF中的ATP水平标准化为蛋白质含量，并表示为野生型对照的百分比。 ( J )用指定剂量的2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）处理的野生型和敲除型MEF通过台盼蓝排斥法检测存活率。 平均值±标准偏差。
接下来，我们试图研究影响TAp73敲除细胞的氧化失衡是否伴随着细胞内ROS水平的改变。 为此，我们用自由基染料二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）测量了早期传代MEF（P2）中的ROS含量。 重要的是，TAp73缺失细胞对氧化损伤的敏感性与细胞内ROS的强劲增加相关( ).
为了理解这种增加的原因，我们将重点放在线粒体上，因为线粒体已被证明在氧化代谢和衰老中起着基础性作用( Sahin和Depinho 2012 )代表活性氧的主要细胞来源。 此外，已知p53通过多种途径调节线粒体耗氧量( Gottlieb和Vousden，2010年 ). 由于p73是p53超家族的一部分，我们询问TAp73缺失引发的活性氧水平升高是否取决于线粒体活性的改变。 我们评估了TAp73基因敲除和野生型MEF中的有氧呼吸，发现TAp73缺失细胞显著降低了基础和状态III（即ADP驱动的）耗氧量( ; 补充图3A）。 线粒体电子传递链（ETC）酶活性的直接测量表明，复合物IV细胞色素C氧化酶（COX）活性持续选择性降低（补充图3B）。 通过ETC的电子流的减少预计会增加主要ETC电子供体NADH的减少量。 与野生型细胞相比，TAp73敲除MEF中NADH水平持续升高( ). 最后，为了评估TAp73缺失是否影响体内线粒体呼吸，我们测量了TAp73敲除小鼠（在野生型小鼠中，TAp73 mRNA表达相对较高）肺和肾的耗氧量，发现氧通量持续下降( ).
复合物IV活性降低将使上游复合物保持在降低状态，从而有利于电子泄漏并增加线粒体活性氧的产生( Liu等人，2009年 ). 为了测试这种可能性，我们测量了阴离子超氧物（O 2 − )在MEF中使用线粒体超氧化物染料MitoSox Red，并发现在TAp73敲除细胞中它显著增加( )表明线粒体功能障碍确实是TAp73缺失时ROS水平升高的主要原因。 最后，我们研究了TAp73缺失对细胞能量学的影响。 与亲代细胞相比，TAp73敲除细胞降低了基础ATP水平( )进一步提示氧化磷酸化受损（OXPHOS）。 TAp73基因敲除的MEF对糖酵解抑制的敏感性增加，这表明了OXPHOS对能量平衡的贡献减少，而TAp73敲除MEF对葡萄糖的依赖性增加( ).
接下来，我们研究了这些发现是否可以推广到人类细胞。 因此，我们利用siRNA技术选择性靶向TAp73亚型，敲除了人结肠癌HCT116细胞系中的TAp73( ; 补充图4）。 与小鼠成纤维细胞一样，TAp73缺失的人类细胞在H 2 O（运行） 2 处理( ). 此外，TAp73的敲除增加了细胞内ROS( )更具体地说，线粒体O 2 − 级别( ). 为了了解TAp73是否维持HCT116细胞的线粒体功能，我们测量了对照细胞和TAp73缺失细胞的耗氧量。 值得注意的是，TAp73的表达减少导致III状态和基础呼吸频率降低( )伴随线粒体复合体IV活性降低( ). 总之，这些数据表明p73缺乏损害细胞生物能量学和线粒体功能，导致细胞内ROS含量增加。
HCT116细胞中TAp73的敲除重述了小鼠的表型。 ( 一 )Western blot分析显示TAp73敲除的效率。 用siRNA对照（scr）和抗TAp73的siRNA（siTAp73）处理细胞，并在转染后72小时进行评估。 ( B类 )用siRNA控制（scr）和抗TAp73（sip73）的siRNA处理的细胞未经处理（CTRL）或用0.2 mM H激发 2 O（运行） 2 持续8小时（h 2 O（运行） 2 )PI染色和流式细胞仪检测细胞死亡。 平均值±标准偏差( C类 )使用DCFDA分析siRNA处理的细胞。 TAp73缺失细胞染色增强。 ( D类 )线粒体O分析 2 − TAp73缺失HCT116中选择性染料MitoSox红的水平。 ( E类 )用siRNA控制或靶向TAp73的siRNA处理的细胞的状态III耗氧量。 用Oroboros血氧饱和度仪测量耗氧量，并将其归一化为细胞数。 通过注射ADP诱导状态III。 平均值±标准偏差( F类 )细胞的基础呼吸 E类 平均值±标准偏差( G公司 )用siRNA控制或靶向TAp73的siRNA处理的细胞中ETC复合物IV的活性。
据报道，缺乏谷胱甘肽过氧化物酶（GPX-1）的小鼠不能对活性氧解毒，因此可以免受高脂饮食（HFD）诱导的胰岛素抵抗的影响( Loh等人，2009年 ). 为了测试TAp73基因敲除小鼠是否表现出类似的表型，我们用食物（正常饮食[ND]）或HFD（60%kcal来自脂肪）喂养敲除小鼠和野生型同窝小鼠。 HFD 16周后的腹膜内葡萄糖耐量试验（IPGTTs）和腹膜内胰岛素耐受试验（IPITTs）表明，TAp73基因敲除小鼠部分免受葡萄糖耐量和胰岛素抵抗的影响( ). 相同条件下的能量消耗分析表明，基因敲除小鼠的耗氧量显著降低( ).
TAp73缺乏对高热量摄入期间葡萄糖耐量的影响。 ( 一 )与ND相比，经HFD治疗16周后，TAp73敲除（KO）小鼠体重增加减少，胰岛素敏感性和糖耐量改善。 ( B类 )TAp73敲除小鼠的VO降低 2 、VCO 2 和HFD治疗16周后的呼吸交换比（RER）。 ( n个 =每组6人）。 平均值±标准偏差（**） P（P） < 0.01.
接下来，我们试图研究TAp73介导的线粒体功能调节的分子机制。 我们没有观察到野生型和TAp73敲除MEFs之间线粒体结构和质量的任何差异，也没有发现p53靶点PGC1α表达的差异（补充图5A–D）。 然而，COX的酶活性降低表明p73可能调节参与复合物IV功能的基因的表达。 最近使用基因表达谱的研究表明，p53家族可能影响 SCO2公司 和 COX4i1型 ( Matoba等人，2006年 ; Lin等人，2009年 ). ETC的复合物IV包含四个主要核心亚单位：线粒体编码亚单位I、II和III提供COX的催化核心，而核编码亚单位IV调节全酶的动力学特性。 SCO2公司 编码一种调节蛋白，将铜传递到亚单位II的催化位点，而 Cox4i1公司 指定COX亚单位IV的亚型1。 我们未能检测到TAp73敲除细胞中SCO2转录水平的变化（补充图5E）。 相反，TAp73敲除MEF表达Cox4i1的mRNA和蛋白水平降低( ). siRNA介导的HCT116细胞TAp73敲低后，Cox4i1蛋白含量也降低( )TAp73敲除动物的肾脏和肺部( ; 补充图6A）。 此外，p73的异位表达增加了HCT116（补充图6B）和HA标记的TAp73 SaOs-2–Tet-on细胞系中的Cox4i1水平（补充图6 C）。 这些发现以及小鼠和人类内含子1中p53反应元件（p53RE）的鉴定 Cox4i1公司 基因座（见补充材料）表明 Cox4i1公司 可能是p73的靶基因。 在SaOs-2–Tet-on诱导的细胞中进行的染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示TAp73与 COX4i1型 内含子反应元件( ). 我们还克隆了一个400碱基对（bp）的片段 COX4i1型 内含子1包含荧光素酶报告载体上游的p53RE，并证明荧光素酶活性通过TAp73亚型的异位表达而增加( ).
Cox4i1是一个TAp73靶基因。 ( 一 )野生型（WT）和TAp73敲除（KO）MEF中Cox4i1转录物的定量PCR归一化为内源性肌动蛋白。 ( B类 )相同细胞中Cox4i1的蛋白质水平。 Tubulin被用作负荷控制。 ( C类 )用siRNA控制或靶向TAp73的siRNA处理HCT116细胞中的Cox4i1蛋白。 ( D类 )6月龄野生型和TAp73基因敲除小鼠肺和肾提取物中Cox4i1蛋白降低。 ( E类 )ChIP对HA-taged TAp73 Tet-inducible SaOs-2进行检测，显示在Cox4i1的第一内含子中TAp73与p53RE直接结合。 HDM2作为阳性对照。 ( F类 )荧光素酶分析显示，由Cox4i1的400-bp第一内含子片段驱动的TAp73介导荧光素酶活性上调。 使用含有p21RE的荧光素酶载体作为阳性对照。 ( G公司 )用siRNA对照或两种靶向Cox4i1的独立siRNA处理的HCT116细胞中的状态III耗氧量。 平均值±标准差( H（H） )O的MitoSox红染色 2 − HCT116中按 G公司 . ( 我 )HCT116细胞按 G公司 被H挑战 2 O（运行） 2 PI染色检测细胞死亡。 平均值±标准偏差( J )用两种不同的抗Cox4i1的shRNAs（sh1和sh2）或打乱控制（scr）处理野生型MEF，以评估其在传代后期（P7）衰老标记的表达。 报告规范化的表达式级别 在下面 相对斑点。 ( K（K） )用空载体或表达标记小鼠Cox4i1的质粒转染36 h的野生型和敲除型MEF（P3）中的状态III耗氧量。 通过注射ADP诱导状态III。 用抗Flag抗体检测外源性Cox4i1的表达。
为了确定TAp73介导的Cox4i1调控是否与TAp73缺失细胞中观察到的线粒体功能障碍有关，我们使用两个独立的siRNA敲除HCT116细胞中的Cox42i1。 Cox4i1减少的氧通量耗尽( )阴离子超氧物水平增加( ). 最近的研究表明线粒体呼吸本身可以保护细胞免受氧相关损伤，而线粒体活性的抑制会引起培养细胞的氧化应激( Sung等人，2010年 ). 与这个假设一致，Cox4敲除增加了H 2 O（运行） 2 -诱导细胞死亡( )重要的是，在原始野生型MEF中Cox4i1的敲除也再现了TAp73敲除MEF中的衰老表型( ). 最后，在TAp73敲除的MEF中异位表达Cox4i1将耗氧量恢复到与野生型细胞相当的水平( ). 总的来说，这些数据表明 Cox4i1公司 是一个直接的p73靶点，能够导致TAp73缺失引发的线粒体损伤和氧化失衡。
控制衰老的机制仍不清楚，正在进行深入调查( 肯尼亚2010 ). 一种广为接受的理论认为，内源性ROS引起的氧化损伤的逐渐累积会导致组织退化和年龄相关疾病( Balaban等人，2005年 ). 然而，自由基对衰老的影响程度最近受到质疑( Lapointe和Hekimi 2010 )尽管线粒体生物能量学在衰老过程中起着至关重要的作用，这一点越来越明显。 的确，线粒体呼吸随着年龄的增长而减少( Yen等人1989 ). 更直接地说，经过改造表达易出错突变线粒体聚合酶δ的小鼠寿命缩短( Trifunovic等人，2004年 )与线粒体功能下降相关，但与活性氧生成增加无关，这表明线粒体呼吸受损导致的代谢受损可能是衰老表型的原因( Trifunovic等人，2005年 ). 此外，清除酶过氧化氢酶的线粒体靶向过表达通过阻止线粒体活性的年龄相关性下降至少部分延长了寿命( Lee等人，2010年 ). 虽然我们不能排除TAp73通过其他机制影响衰老的可能性，但随着活性氧生成增加，复合物IV活性降低显然是TAp73缺乏导致衰老表型的机制之一。
一些模型表明，衰老、胰岛素抵抗和活性氧之间存在分离，因此，在某些条件下，活性氧可能促进衰老，而不影响葡萄糖代谢。 我们的发现是，长期HFD的TAp73基因敲除小鼠表现出相对增加的胰岛素敏感性，这可能是因为ROS对胰岛素信号的积极作用，正如JunD或GPX-1基因敲除鼠所报告的那样( Laurent等人，2008年 ; Loh等人，2009年 ).
p53家族成员p53和p63在控制机体衰老中起着关键作用，尽管其潜在机制尚不清楚( Keyes等人，2005年 ; Matheu等人，2008年 ; Su等人，2009年 ; Sahin等人，2011年 )p53依赖性线粒体功能障碍在易衰老的端粒酶缺乏小鼠中被描述( Sahin等人，2011年 )以及与年龄相关的心血管和脂肪组织变化( Minamino等人，2009年 ). 在这里，我们报告了选择性TAp73缺失加速体内衰老，与线粒体功能改变相关，至少部分原因是Cox4i1缺失，而Cox4i 1敲除本身会导致体外加速衰老。 总的来说，我们的数据与线粒体功能障碍和ROS体内平衡失衡的活体小鼠模型的最新发现相一致( Trifunovic等人，2004年 ; Laurent等人，2008年 ; Chen等人，2009年 ; Liu等人，2009年 ; Loh等人，2009年 ; Reilly等人，2010年 ; Sahin等人，2011年 )并通过添加新的参与者TAp73和Cox4i1来扩大老化的p53和线粒体轴。
材料和方法 老鼠 TAp73小鼠的产生和基因分型描述于 Tomasini等人（2008年） 血清IGF通过ELISA（R&D系统）定量。 用PIXImus小型动物密度计（月球）测量体脂。 在毛发生长试验中，使用电动剃刀将年龄匹配的野生型和TAp73基因敲除小鼠（18个月）的背部表面刮毛。 剃须后24天拍摄照片。 使用LabMaster（TSE系统）进行间接热量测定。 小鼠驯化24小时，然后每15分钟测量一次，持续24小时。耗氧量（VO 2 )表示为O的毫升数 2 每分钟每公斤体重的消耗量。 通过热量计中每分钟运动诱发的束流中断来表示活性。 通过称量食物料斗来监测每日食物摄入量。 对于饮食诱导肥胖模型，从8周龄的小鼠开始，给小鼠喂食HFD（60%的脂肪热量；研究饮食）或ND（标准食物，10%的脂肪热量，GLP）16周。 之前描述过代谢测试( Menghini等人，2009年 ).
按照安大略省癌症研究所动物护理委员会批准的NIH实验动物护理和使用指南对动物进行治疗。 老鼠是根据内政部颁发的项目许可证繁殖和接受程序的。
ROS测量 为了测定ROS水平，HCT116细胞和MEF在Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中用10μM DCFDA（Invitrogen，M36008）染色10分钟。 为了测量细胞阴离子超氧物含量，HCT116细胞和MEF分别在HBSS中用1μM MitoSox Red（Invitrogen，C6827）染色10和30分钟。 用HBSS洗涤后，通过流式细胞仪对样品进行分析，每个样品至少获得10000个细胞。 每个实验均一式三份，并使用CELLQuest软件进行分析。
呼吸测定和NADH 使用Oxygraph-2k和DataLab软件（Oroboros）在37°C下通过高分辨率呼吸测定法测量耗氧量。 细胞和组织在呼吸培养基（0.5 mM EGTA，3 mM MgCl）中均质 2 ·6小时 2 O、 60 mM乳糖酸钾、20 mM牛磺酸、10 mM KH 2 P04，20 mM HEPES，110 mM蔗糖，1g/L BSA），并通过2秒间隔测量进行分析。 添加2 mM苹果酸、10 mM谷氨酸和5-10 mM ADP可诱导状态III呼吸。
用光谱法测量蛋白质提取物中的NADH（激发波长366 nm；吸收波长460 nm），并将其归一化为蛋白质含量。
鸣谢 我们感谢David J.Read、Jenny Edwards和Lucia Pinon（英国医学研究委员会[MRC]毒理学部门）。 我们感谢Alessandro Terrinoni（无暇皮肤病研究所、Immacolata皮肤病研究院、Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico[IDI-IRCCS]）在ChIP协议方面的帮助，以及Samuel Lunenfeld研究所人类疾病小鼠表型建模中心的筛查服务( 网址：http://www.cmhd.ca ). 这项工作得到了英国MRC的支持； 意大利癌症协会（AIRC）[（2008-2010_33-08）（#5471）（2011-IG11955）]； AIRC 5xmille（#9979）； 此处所述的Telethon Grant GGPO9133 to G.M.Research也得到了Ministro della Salute（Ricerca oncologica 26/07）和IDI-IRCCS（RF06 c.73，RF07 c.57，RF08 c.15，和RF07 c.57.）的部分支持。
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