生物化学杂志。2012年8月24日；287(35): 29648–29653.
Gtr1p的晶体结构全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值蛋白质复合物揭示GTP-GDP转换引发的大规模结构重排*
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Jae Hee Jeong
从‡浦项科技大学浦项加速器实验室，韩国京畿浦项790-784，
Kwang-Hoon Lee（李光勋）
这个§韩国大田305-701 KAIST生物世纪研究所生物科学系
Young-Mi Kim（金永美）
这个¶生物化学、分子生物学和生物物理系；明尼苏达州立大学明尼阿波利斯分校，邮编：55455
Do-Hyung Kim先生
这个¶生物化学、分子生物学和生物物理系；明尼苏达州立大学明尼阿波利斯分校，邮编：55455
Byung-Ha哦
这个§韩国大田305-701 KAIST生物世纪研究所生物科学系
延吉·金
从‡浦项科技大学浦项加速器实验室，韩国京畿浦项790-784，
从‡浦项科技大学浦项加速器实验室，韩国京畿浦项790-784，
这个§韩国大田305-701 KAIST生物世纪研究所生物科学系
这个¶生物化学、分子生物学和生物物理系；明尼苏达州立大学明尼阿波利斯分校，邮编：55455
2012年5月22日收到；2012年7月14日修订
背景：异二聚体GTR GTPase是氨基酸介导的TORC1途径中的关键调节因子。
结果：Gtr1p的结构全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值与Gtr1p相比，显示出较大的构象变化GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司.
结论：异二聚体GTR GTPase是调节猛禽结合亲和力的一种新型分子开关。
意义：结构信息有助于更好地理解GTR GTPase的调节机制。
关键词：氨基酸、细胞生长、蛋白质结构、小GT酶、TOR复合物（TORC）
摘要
由RagA（或RagB）和RagC（或RagD）组成的异二聚体Rag GTP酶是响应氨基酸水平激活雷帕霉素复合物1（TORC1）靶标的关键调节因子。GTP-负载的RagA/B和GDP-负载RagC/D之间的异二聚体是结合猛禽并导致TORC1活化的最活跃形式。这里，我们展示了Gtr1p的晶体结构全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值活性酵母Rag GTPase异二聚体。该结构表明，Gtr2p上的GTP-GDP转换导致该亚基的大规模构象转换，包括长片段的大规模重排，其RagA中的相应区域与猛禽结合。此外，异二聚体的两个GTPase结构域相互接触，但不会引起Gtr1p亚单位的任何构象变化。这些特征解释了两个GTP酶亚基的核苷酸结合状态如何开启和关闭猛禽结合亲和力。
关键词：氨基酸、细胞生长、蛋白质结构、小GT酶、TOR复合物（TORC）
介绍
在真核生物中，雷帕霉素复合物1（TORC1）的靶点2激酶在调节细胞生长以响应生长因子、能量水平和营养物质（如葡萄糖和氨基酸）的可用性方面起着核心作用(1). 氨基酸激活TORC1的信号转导关键依赖于高度保守的Rag GTPase，Rag GTPase超家族成员(2,三). 哺乳动物细胞表达四种Rag GTPase：RagA、RagB、RagC和RagD(4). 在酵母中，Gtr1p和Gtr2p分别是RagA/B和RagC/D的同源物(5).
Rag GTPase以异二聚体的形式存在，包含Gtr1p-like Rag GTPase（RagA或RagB）和Gtr2p-like Rag GTPase（Rag C或RagD）(4). 异二聚体复合物的功能依赖于鸟嘌呤核苷酸与每个Rag GTPase结合。由氨基酸丰度诱导的GTP-结合的RagA/B和GDP-结合RagC/D的组合表现出最高的活性。在哺乳动物中，Rag异二聚体与猛禽（哺乳动物TORC1（mTORC1）的组成部分）之间的相互作用在RagC/D携带GDP时增强，尽管RagA/B的核苷酸结合状态起主导作用(三). 通过相互作用，mTORC1从细胞溶质转移到溶酶体膜，在溶酶体中Rheb激活复合物(6). 另一方面，由氨基酸剥夺诱导形成的非活性异二聚体复合物包含GDP-结合的RagA/B和GTP-结合RagC/D。非活性形式不能结合猛禽，因此不能激活mTORC1(2,三). Rag异二聚体的核苷酸结合状态如何改变猛禽结合亲和力以打开或关闭mTORC1活性，目前尚不清楚。
最近，Gtr1p-Gtr2p复合物的晶体结构（PDB条目：3R7瓦)据报道，这两个亚基都与不可水解的GTP类似物GMPPNP结合，GMPPNPs代表异二聚体的部分活化形式(7). 在此，我们报告了Gtr1p的晶体结构全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值复合物，Gtr1p-Gtr2p复合物的最活跃形式。我们的结构与Gtr1p的结构相比GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司，揭示了Gtr2p在GTP转化为GDP后发生了重大的结构调整。这些变化涉及一个长片段，包括开关I、两个β链和开关II，并伴随着两个GTP酶结构域的位置变化。这些观察提供了Rag异二聚体复合物如何在氨基酸调节信号通路中作为分子开关的结构观点。
实验程序
Gtr1p-Gtr2p复合物的纯化
构建了包含全长Gtr2p和Gtr1p编码序列的双启动子表达载体。蛋白质复合物是在大肠杆菌BL21（DE3）RIL菌株（Novagen）并用Ni纯化2个+密切关系。将洗脱的蛋白质与烟草蚀刻病毒蛋白酶（1:100比例，w/w）在4°C下培养10 h，以去除His61 m处的标签米全球贸易伙伴关系。通过离子交换进一步纯化蛋白质，然后在10 m内进行尺寸排除色谱平衡米三氯化氢（pH 8.0），100 m米NaCl和1米米氯化镁2硒代蛋氨酸取代蛋白在大肠杆菌B834菌株（Novagen）在添加硒代蛋氨酸的最小培养基中生长，并在与野生型蛋白质相同的条件下纯化。
Gtr1p的结晶和结构测定全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值综合体
Gtr1p-Gtr2p络合物的晶体是通过22°C下的坐滴蒸汽扩散法获得的，方法是混合并平衡2μl蛋白质溶液和含有0.2μl沉淀剂的溶液米硫酸铵、22%（w/v）PEG 3350、8%v/v丁二酸盐（pH 8.0）和100 m米三氯化氢（pH 8.0）。为了收集数据，将晶体短暂浸泡在含有额外15%（w/v）葡萄糖的同一沉淀剂中，并立即放置在100K氮气流中。利用浦项加速器实验室束线4A上的硒代蛋氨酸取代蛋白晶体收集了单波长异常色散数据集。使用Phenix autosol定位硒位点并生成溶剂平面图(8). 使用Coot进行模型构建和优化(9)和CNS(10)分别是。x射线衍射和结构细化统计总结如下.
表1
| 数据收集 | |
| “空间”组 | C222型1 |
| 单元格尺寸（Å） | 一= 90.7,b条= 148.9,c（c）= 117.8 |
| 波长（Ω） | 0.97928（峰值） |
| 分辨率（Ω） | 30.0–3.1 |
| R（右）sym（对称）一 | 9.3 (34.7)b条 |
| 我/σ (我) | 20.5（3.0） |
| 完整性（%） | 99.2 (98.3) |
| 冗余 | 8.4 |
|
| 结构细化 | |
| 分辨率（Ω） | 30.0–3.1 |
| 反射次数 | 27,731 |
| R（右）工作c（c）/R（右）自由的 | 23.3/28.9年 |
| 原子数 | |
| 蛋白质 | 4802 |
| 水 | 9 |
| 分子数量 | |
| 全球技术伙伴 | 1 |
| 国内生产总值 | 1 |
| 镁2+ | 1 |
| 均方根偏差 | |
| 粘结长度（Ω） | 0.0094 |
| 结合角（°） | 1.643 |
| B类-系数（Ω2) | |
| 蛋白质 | 82.6 |
| 全球技术伙伴 | 76.7 |
| 国内生产总值 | 101.2 |
| 拉马钱德兰阴谋 | |
| 支持（%） | 82.8 |
| 额外允许（%） | 16.9 |
| 允许充足（%） | 0.4 |
结果和讨论
Gtr1p的总体结构全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值综合体
Gtr1p-Gtr2p复合物由大肠杆菌在没有添加任何核苷酸或核苷酸类似物的情况下结晶。HPLC分析表明，纯化的复合物含有40%的GDP和60%的GTP（数据未显示），表明在蛋白质纯化过程中，约40%与GTP酶结合的GTP分子转化为GDP。确定了Gtr1p-Gtr2p配合物的晶体结构，并将最终模型精确到3.1Å的分辨率。该结构表明，Gtr1p和Gtr2p分别与GTP和GDP结合，从而形成Gtr1p全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值复杂(A类). 每个亚单位由两个物理上可识别的结构域组成：一个N端GTPase结构域和一个C端二聚结构域，以下分别指定为G结构域和C结构域。这两个亚基的C结构域在结构上非常相似，主要负责通过由分子间β-片支撑的中心α-螺旋的分子间堆积实现异二聚。这些相互作用通过伪二重对称性相关，并导致两个G结构域的核苷酸结合位点以反平行模式相互面对。Gtr1p的G结构域全球技术伙伴包含六个β链和六个α螺旋，包括一个短的310-插入开关I区域的螺旋（αG2）(B类). 次级结构元件的数量和折叠拓扑与其他Ras相关GTPase相似。一个镁2+离子存在于Gtr1p的核苷酸结合位点，GTP的γ-磷酸通过氢键被两个开关区域抓住，与其他GTP酶一样。与此形成鲜明对比的是，Gtr2p的G结构域国内生产总值由五条β链和五条α螺旋组成(B类)，其核苷酸结合位点缺乏结合镁2+离子(C类)这是大构象转变的结果，下面将详细描述。这一发现与之前的观察一致，即镁2+GDP与RagC绑定不需要(4). 生化研究表明，镁的缺乏2+离子可以将GDP分解率提高1000倍(11,12). 显然，Gtr2p的GDP结合亲和力不如Gtr1p的GTP结合亲和力紧密，这由相对较弱的电子密度图和较高的B类-GDP的因子值。此外，GDP的占有率比GTP低约40%，这与HPLC分析结果一致。镁介导的几种相互作用的丧失2+核苷酸结合位点可能是相对较弱的GDP-Gtr2p相互作用的原因。
总体结构和核苷酸结合位点。
A类，Gtr1p的带状表示全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值结构。Gtr1p的G和C域全球技术伙伴在中洋红和粉红色和Gtr2p的国内生产总值在中天蓝色的和浅蓝色.结合核苷酸显示为棒状模型、和镁2+显示为青色球体.两个GTP的开关I区域和开关II区域位于黄色的和橙色分别是。B类，Gtr1p的拓扑图全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值复杂。次要结构元素的颜色如所示交流，Gtr2p的核苷酸结合位点国内生产总值.第2个F类o（o）−F类c（c）在省略GDP和σ的情况下计算的模拟退火省略图（3.1Å，1σ）-A权重显示GDP的存在，但不显示Mg2+与约束GDP相互作用的残差显示为棒状模型. The虚线表示氢键。D类与其他两个小GTP相比，GTP与Gtr1p结合。Gtr1p的结构全球技术伙伴(洋红)，拉布3A(橄榄色; 蛋白质数据库（PDB）条目：3个RAB)和说唱2(灰色; PDB条目：3个RAP)重叠，并显示和指示三种蛋白质的相关区域。Rap2的Tyr-32与Gtr1p的Leu-38相对应，是Ras、Rho和Ran GTPases中的保守残基。氢键中的残留物(虚线)GTP的γ-磷酸基团如所示棍枝和标签。E类，GMPPNP绑定到Gtr2p。Gtr2p的核苷酸结合位点（PDB条目：第3周)如所示绿色。保守的精氨酸残基Arg-18如所示棍枝。RagC中相应的精氨酸残基（PDB条目：3个LLU)和RagD（PDB条目：第2季度第3季度)如所示白色用于比较侧链构象。
Gtr1p和Gtr2p不同内源性GTPase活性的基础
在我们的晶体结构中观察到的GTP与Gtr1p的结合和GDP与Gtr2p的结合反映了之前的观察结果，即纯化的RagA不表现出固有的GTPase活性(13)RagC具有基本的GTPase活性，在4小时内将约40%的GTP转化为GDP(4). Arf亚家族成员和Rab3A也观察到极低的GTPase活性(14——16). 有趣的是，Gtr1p与Arf亚家族成员以及Rab3A具有相似的特征。首先，与Arf亚家族成员一样，Gtr1p在其他小GTP酶（如Ras、Rho和Ran亚家族成员）的开关I区中不具有保守的酪氨酸残基，它们具有催化活性(D类). 这种酪氨酸残基为GTP的γ-磷酸基团提供氢键，并被认为可以稳定GTP水解过程中生成的过渡态络合物(17). Gtr1p中相应的残基是Leu-38，它与GTP不相互作用(D类). 其次，如Rab3A所观察到的，Gtr1p的P环上的Ser-15为γ-磷酸盐提供了氢键，而大多数Ras亚家族成员中相应的甘氨酸残基则没有。Ser-31介导的Rab3A核苷酸结合囊的等效相互作用(D类)建议对GTP水解施加立体化学约束(15). 支持这一点的是，Rab3A的Ser-31突变为甘氨酸使GTPase活性增加了几倍(18). 这些观察结果表明，Gtr1p被锁定在GTP结合形式，除非GTP在该亚单位上的水解由GTPase激活蛋白辅助。
Gtr2p的核苷酸结合囊与Gtr1p的不同之处在于，Gtr2p的P环含有保守的Arg-18，而Gtr1p中的相应残基被Ser-15取代。在Gtr1p中GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司结构，Gtr2p中Arg-18的侧链GMPPNP公司接近结合核苷酸的γ-磷酸。在RagC和RagD的G结构域中，与Gtr2p的Arg-18相对应的RagC中的Arg-50和RagD-52的侧链与GMPPNP的γ-磷酸氢键合(E类). 因此，Arg-18的胍基可能在稳定GTPγ-磷酸盐的过渡状态中起作用。P环中保守的Arg-18使人想起人类鸟苷酸结合蛋白1的P环中的催化残基Arg-48，其侧链通过同二聚体重新定向以稳定过渡状态。类似地，在异源三聚体GTPase亚基Gtα的结构中，开关I区域的Arg-174侧链稳定了γ-磷酸的过渡状态(19). 这些观察结果表明，Gtr1p和Gtr2p内在GTPase活性的差异主要是由于这两种蛋白质P环的氨基酸序列差异引起的；Gtr1p的P环含有一个抑制残基（Ser-15），而Gtr2p的P环路含有一个稳定过渡态的残基（Arg-18）。
GTP水解引发的Gtr2p-G结构域构象转变
Gtr2p中G域的结构国内生产总值亚单位与GDP-结合状态下的典型GTPase以及与GMPPNP结合的Gtr2p的G结构域显著不同。这种差异是由GTP转化为GDP引发的由残基28-70组成的长链段的相当大的构象重排的结果。该段包括交换机I、βG2和βG3绞线以及交换机II(A类). 开关I段远离约束GDP，并重组为螺旋αG1的C端部分。特别是Thr-44残基，它与Mg2+Gtr2p中的离子GMPPNP公司开关I段的这种重新定位伴随着βG2从中央β片上分离并转变为环路段。链βG3由不同的残基重组：GMPPNP结合的Gtr2p中的残基53–59和GDP-结合的G tr2p的残基58–64(B类). 值得注意的是，βG3在两个不同的核苷酸结合态中的叠加表明侧链的化学性质是守恒的(B类)因此，βG3和βG1在两种状态下的相互作用相似（数据未显示）。开关II区域也发生了显著的构象变化(A类)尤其是在N端部分。Glu-62的侧链与结合的Mg配位2+Gtr2p中的离子GMPPNP公司在Gtr2p中经历了约16Å的运动国内生产总值(A类). 重新定位的开关II区域变得灵活，这表现在该区域定义不清的电子密度。
Gtr2p中的构象转变。
A类，与GMPPNP复合物中Gtr2p的G结构域的并排比较(左边)和GDP(正确的). 这个带括号的数字指示Mg移动的距离2+-协调残基Thr-44和Glu-62。B类，链βG3寄存器中的五个残基移位。GDP-结合Gtr2p和GMPPNP结合Gtro2p的G结构域重叠，并显示来自βG3的残基。
GTP水解引发的大范围运动
Gtr2p G结构域的构象转变伴随着G结构域相对取向的巨大变化，而这两个亚基的C结构域并没有发生显著变化，因为这些结构域位于Gtr1p全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值和Gtr1pGMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司配合物可以很好地重叠，其216个Cα原子的均方根误差为1.20Å。如所示A类，Gtr2p的G域相对于其C域表现出约28°的旋转运动。Gtr1p的G域也经历了刚体运动，但相对于其C域，它是一个相对较小的～6°旋转。两个重新定位的G结构域相互接触，占两个亚基之间结合界面的13%，而这两个结构域在Gtr1p中彼此分离GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司结构。值得注意的是，结构域间的接触不会改变Gtr1p的G结构域的构象全球技术伙伴因为对于181个排列的Cα原子，这两种结构中的这些畴几乎可以完全重叠，均方根误差为0.64Å。这一观察结果表明，一个亚单位的核苷酸结合状态既不决定GTP或GDP与另一亚单位的结合，也不改变另一亚基的固有GTPase活性。另一个显著的特点是Gtr2p中的域移动国内生产总值亚单位将C域中的Ile-214残基放入G域中的疏水口袋中，G域是由来自αG6的疏水残基Tyr-172、Phe-175、Ser-176和Val-179以及来自αG1的残基Val-29、Asn-32、Met-33和Leu-36新创建的(B类). 还应注意，Gtr2p两个域之间埋藏的表面积从～564增加到1056Å2通过畴运动，表明Gtr2p的畴间相互作用国内生产总值比Gtr2p更广泛全球技术伙伴(B类). 因此，C域通过稳定G域中的重定位片段在构象转换中起着重要作用。Gtr2p中的疏水残基和Gtr1p中的相应残基都高度保守（数据未显示），这表明在该亚单位将GTP-GDP转换为GTP-GDP时，Gtr1p中的G结构域可能发生非常相似的旋转运动。
G域的移动。
A类G域运动。C域(灰色)在Gtr1p中GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司和Gtr1p中的那些全球技术伙伴-Gtr2p公司国内生产总值叠加，并显示两个视图。Gtr1p中的G域GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司在中绿色。在俯视图中(左边)，的箭头表示G域的旋转运动。侧视图中(正确的)，为了清楚起见，仅显示了Gtr2p亚单位。B类，Gtr2p的G域和C域之间的相互作用发生变化。Gtr2p的域间接口GMPPNP公司(左边)和Gtr2p国内生产总值(正确的)如图所示。两种形式的Gtr2p的C域方向相同，显示为曲面模型。G域与C域相互作用的片段和残基如所示缎带和棍枝分别是。这个盒强调了C结构域中的Ile-214，它参与了新产生的结构域间疏水相互作用。
含义和结论
已知猛禽能选择性结合RagA/B-RagC/D异二聚体的RagA/B亚单位。此外，猛禽的结合在很大程度上取决于RagA/B的核苷酸结合状态，而不是RagC/D的核苷酸结合状况(2,三). 基于RagA家族和RagC家族之间的高序列相似性，我们利用Gtr2p的结构生成了GDP-bound Gtr1p的模型结构国内生产总值作为同源建模中的模板(20). 正如预期的那样，Gtr1p的模型结构国内生产总值与Gtr2p的结构非常相似国内生产总值该模型清楚地表明，Gtr1p的残基（其在RagA中的相应残基）参与了与猛禽的相互作用(7)，位于经历构象转换的节段(A类). 可以想象，如Gtr2p所观察到的，RagA家族成员在GTP水解时经历了相当大的构象转变，该亚单位的GTP结合形式和GDP结合形式之间的显著结构差异是猛禽与RagA/B-RagC/D异二聚体结合或分离的主要结构基础。众所周知，RagA全球技术伙伴-RagC公司全球技术伙伴活性低于RagA全球技术伙伴-RagC公司国内生产总值(三)这意味着RagC/D亚单位参与了RagA/B亚单位和猛禽之间的相互作用。因为RagA/B的构象全球技术伙伴根据Gtr1p-Gtr2p异二聚体两种形式的结构比较，RagC/D不受核苷结合状态的影响，与GDP结合的RagC/D很可能直接与Raptor相互作用，并有助于Raptor与RagA/B结合全球技术伙伴两种形式的Gtr1p-Gtr2p异二聚体的晶体结构表明RagA/B的Raptor相互作用表面全球技术伙伴将接近并与RagA/B中的RagC/D亚单位形成一个连续的表面全球技术伙伴-RagC/D公司国内生产总值异二聚体(B类)因为G域的运动。可能是RagC/D国内生产总值在这个方向上可以与猛禽互动。RagC/D的亲和力国内生产总值然而，对于猛禽来说，应该是弱的，因为当RagA/B亚单位是GDP结合形式时，RagA/B-RagC/D异二聚体是不活跃的。
Raptor相互作用曲面映射在Gtr1p-Gtr2p上。
A类，将RagA的Raptor相互作用残基映射到Gtr1p的结构上。RagA的这些残留物表示为球体关于Gtr1p的晶体结构全球技术伙伴亚单位(左边)以及Gtr1p的同源性模型化结构国内生产总值(正确的). 为了清楚起见，省略了结合核苷酸。B类，猛禽相互作用的表面和领域运动。Gtr1p-Gtr2p异二聚体的两种指示形式的C结构域重叠并以相同方向呈现。C域如图所示灰色，G域显示为表面模型。GTP绑定的G域位于浅洋红，并且GDP绑定的G域位于天蓝色. The蓝色补丁在Gtr1p上全球技术伙伴表示RagA的Raptor-binding残留物对应的残留物。它更接近Gtr2p国内生产总值比Gtr2pGMPPNP公司.
总之，本研究中观察到的显著构象转变为Rag GTPase异二聚体如何通过与猛禽相互作用作为分子开关提供了结构基础。我们的结构与Gtr1p的结构GMPPNP公司-Gtr2p公司GMPPNP公司为解决现有问题和设计实验方法提供了一个重要框架，以充分阐明Rag GTPases调控和氨基酸调节信号通路中mTORC1激活的分子机制。
*这项工作得到了陆地、运输和海洋事务部海洋极端基因组研究中心项目的资助，以及教育、科学和技术部资助的韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究项目的支持（2011-0007201号拨款）（Y.G.K.），由韩国NRF全球研究实验室（GRL）计划（K20815000001号拨款）（发给B.H.O.）、美国糖尿病协会（7-07-CD-08）（发给D.H.K.）和美国国立卫生研究院（DK072004和DK083474号拨款）。
原子坐标和结构因子（代码4ARZ公司)已存入新泽西州新不伦瑞克罗格斯大学结构生物信息学研究合作实验室蛋白质数据库(网址：http://www.rcsb.org/).
2使用的缩写如下：
- TORC1（扭矩1）
- 雷帕霉素复合物靶点
- mTORC1型
- 哺乳动物TORC1
- GMPPNP公司
- 5′-鸟苷酰亚胺二磷酸
- 有效值。
- 均方根
- 阿尔夫
- ADP-核糖基化因子。
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