自噬。2012年6月1日；8(6): 903–914.
MTORC1通过阻止TFEB的核转运发挥自噬转录调节器的作用
,1 ,2 ,2和1,*
何塞·A·马蒂娜
1细胞生物学实验室；国家心脏、肺和血液研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达
陈勇（音）
2蛋白质组学核心设施；国家心脏、肺和血液研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达
马尔扬·古塞克
2蛋白质组学核心设施；国家心脏、肺和血液研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达
玫瑰Puertollano
1细胞生物学实验室；国家心脏、肺和血液研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达
1细胞生物学实验室；国家心脏、肺和血液研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达
2蛋白质组学核心设施；美国国家心肺血液研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达
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其他材料。
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附加材料。
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摘要
雷帕霉素（MTOR）蛋白激酶复合物的哺乳动物靶点是调节细胞生长和增殖以响应能量水平、缺氧、营养和胰岛素的途径的关键组成部分。抑制MTORC1通过调节ULK蛋白激酶复合体的活性强烈诱导自噬，ULK蛋白酶复合体是形成自噬体所必需的。然而，MTORC1参与自噬基因的表达尚不明确。在这里，我们发现MTORC1调节转录因子EB（TFEB）的核定位和活性，TFEB是bHLH亮氨酸拉链家族转录因子的成员，可驱动自噬和溶酶体基因的表达。在正常营养条件下，TFEB在Ser211中以MTORC1依赖方式磷酸化。这种磷酸化促进TFEB与YWHA（14-3-3）蛋白家族成员的结合以及转录因子在胞浆中的保留。MTORC1的药理或基因抑制导致TFEB/YWHA复合物的分离，并将TFEB快速转运到细胞核，从而增加与自噬和溶酶体功能相关的多个基因的转录。活性TFEB还通过与LAMTOR/RRAG/MTORC1复合物的相互作用与晚期内体/溶酶体膜相关。我们的结果揭示了MTORC1通过在转录水平调节自噬在维持细胞内环境稳定中的新作用。
关键词：自噬，溶酶体，MTOR，MTORC1，TFEB，转录，14-3-3/YWHA
介绍
MTOR激酶信号通路将能量、生长信号和营养物质丰度与细胞生长和分裂相协调。1MTOR对许多压力作出反应，其失调会导致癌症、代谢疾病和糖尿病。在细胞中，MTOR作为两种结构和功能不同的复合体存在，称为MTOR复合体1（MTORC1）和MTOR复合物2（MTORC2）。2-4MTORC1通过平衡合成代谢（蛋白质合成和营养储存）和分解代谢过程（自噬和能量储存利用），将能量和营养丰富性与细胞生长和增殖联系起来。MTORC1定位于晚期内体/溶酶体，这种分布被认为对MTORC1感知和响应氨基酸水平变化的能力至关重要。5
MTORC1被认为是转录依赖的自噬调节器。在富含营养的条件下，MTORC1是活性的，直接磷酸化并抑制参与自噬诱导的ATG蛋白，如ATG13和ATG1（ULK1/2）。6,7在饥饿条件下，当MTORC1失活时，MTORC1与ULK复合物分离，从而导致自噬诱导。8此外，许多已知的调节自噬的细胞途径在MTORC1上融合。9尽管有这些见解，但MTORC1对自噬基因调控表达的作用尚未明确。
最近，一种调节自噬的新的转录依赖机制被发现。转录因子EB（TFEB）是TFs的基本螺旋环-亮氨酸拉链家族的成员，它通过积极调节属于协调溶酶体表达和调节（CLEAR）网络的基因来控制溶酶体的生物发生和自噬。10-12TFEB通常定位于胞质溶胶，但在饥饿条件下或溶酶体功能受损时会进入细胞核。10,13TFEB过表达诱导自噬体数量和自噬流量增加，产生新的溶酶体，并通过促进溶酶体分泌导致几种溶酶体储存障碍（LSD）中储存物质的清除。12,14在本研究中，我们发现MTORC1通过调节TFEB与YWHA（14-3-3）蛋白的磷酸化依赖性关联，驱动自噬和溶酶体基因的表达。这些发现对我们理解MTORC1功能具有广泛的意义，并为自噬的复杂调控提供了新的见解。
结果
MTOR调节TFEB的亚细胞分布
我们假设MTORC1可能调节TFEB的分布和激活。为了测试这种可能性，我们用表达TFEB-Flag的腺病毒感染ARPE-19细胞，并用一些MTORC1抑制剂处理细胞。正如预测的那样，MTORC1的抑制会快速诱导TFEB的核移位(). 在对照条件下（Ad-TFEB感染细胞和DMSO培养细胞），不到20%的细胞（18.34%SD±1.08，n=322）在细胞核中显示TFEB染色。相比之下，用MTOR催化抑制剂LY294002、沃特曼或PP242处理细胞时，几乎100%的细胞的细胞核中TFEB显著积聚（LY29400 2为97.08%SD±0.87，n=308；沃特曼为95.46%SD±0.5，n=309；PP242为92.2%SD±1.31，n=312）。Torin-1也获得了类似的结果（数据未显示）。变构MTORC1抑制剂雷帕霉素也诱导了TFEB在细胞核中的显著积累，尽管其作用略弱（70.4%SD±1.97，n=321）。这可能是因为用这种药物治疗只能部分抑制MTORC115-17(). MTOR失活后，在不同类型的细胞中观察到TFEB重新分布到细胞核，包括人成纤维细胞和稳定表达TFEB的HeLa细胞克隆（CF7）10(图S1). 作为对照实验，我们测试了其他细胞激酶的抑制，包括PtdIns 3-激酶I型、AKT1、AMPK、MAPK1/3、MAPK14和MAPK8。这些并没有改变TFEB的分布(). 由于LY294002和沃特曼（而非PP242）对PtdIns 3-激酶III型有抑制作用，因此它们都能阻止自噬体的形成，因此TFEB向细胞核的传递与自噬小体的形成无关，但仍能诱导TFEB的激活(图S2).
图1。MTORC1调节TFEB的亚细胞分布。（A） 免疫荧光共聚焦显微镜显示重组TFEB-Flag在与MTORC1抑制剂孵育的ARPE-19细胞中的核定位。（B） 量化用不同激酶抑制剂培养的ARPE-19细胞中TFEB的核定位。数值为三个独立实验的平均值±SD。（C） 免疫荧光共聚焦显微镜显示TFEB-Flag和MTORC1在与PP242孵育2 h的ARPE-19细胞中的共定位。（D）TFEB在与PP422孵养的ARPE-9细胞中溶酶体定位的量化。（E） 延时电影的静态图像显示TFEB-GFP与溶酶体的顺序关联以及随后在细胞核中的积聚。比例尺：10μm***p<0.001；注：不重要。
图2。MTORC1的药理或基因抑制可诱导TFEB转运至细胞核。（A） 稳定表达TFEB（CF7）的HeLa细胞与指示的激酶抑制剂孵育，并通过免疫印迹监测TFEB的电泳迁移率。（B） 用不同的激酶抑制剂培养的HeLa（CF7）细胞的亚细胞分离。（C） 免疫荧光共聚焦显微镜显示TFEB在缺失RPTOR或RICTOR的ARPE-19细胞中的定位。比例尺：10μm。（D） 定量测定缺失RPTOR或RICTOR的ARPE-19细胞中TFEB的核定位。数值为三个独立实验的平均值±SD***p<0.001，**p<0.01。（E） RPTOR或RICTOR缺失的ARPE-19细胞裂解物中TFEB电泳迁移率的免疫印迹分析。
在MTORC1失活后，我们还观察到TFEB和MTORC1在囊泡结构中的共定位增加(). 这些小泡对LAMP1呈阳性，表明它们对应于晚期内体/溶酶体(图S3). 在对照条件下，只有6%的细胞显示出TFEB与晚期内体/溶酶体的显著关联（6.79%SD±2.75，n=704），而在与PP242孵育的细胞中，这个数字增加到了几乎75%（74.05%SD±4.02，n=1183）(). 当细胞与LY294002、沃特曼或Torin-1孵育时，也获得了类似的结果（数据未显示）。通过在Optiprep梯度中分离溶酶体膜，进一步证实了TFEB与溶酶体的关联(图S4). TFEB的激活也通过延时显微镜观察。用编码TFEB-GFP的质粒瞬时转染ARPE-19细胞。在未经处理的细胞或与二甲基亚砜孵育的细胞中，TFEB残留在胞浆中。相比之下，添加PP242后仅30分钟，TFEB被招募到囊泡结构中，然后在细胞核中逐渐累积(;图S5A和S5B;电影S1和S2因此，我们的数据表明，在MTORC1失活时，TFEB向细胞核的转运非常迅速，并且在TFEB与溶酶体膜结合之前。
MTORC1的药理学或基因失活改变TFEB的电泳动力学
为了进一步分析MTORC1如何调节TFEB的分布，我们通过SDS-PAGE分析了用不同激酶抑制剂培养的TFEB表达细胞的裂解物。如所示通过LY294002、沃特曼、PP242、雷帕霉素或饥饿处理抑制MTORC1，改变了TFEB的电泳迁移率，目前TFEB呈快速迁移形式。相反，在用二甲基亚砜或PtdIns 3-激酶抑制剂I、AKT1、AMPK、MAPK1/3处理的细胞中，未观察到分子量变化，MAPK14和MAPK8(). 我们观察到用MTOR抑制剂处理的细胞中磷酸化-MAPK1/3水平增加。这些结果与之前的报告一致，表明MTOR的抑制导致Ras-Raf1-MEK1/2-MAPK通路的激活。18TFEB运动性的变化是可逆的，在去除MTORC1抑制剂4小时后，TFEB恢复其正常分子量和胞浆分布(图S6A和S6B). 在正常培养基中添加MAPK1/3或AMPK抑制剂不会影响恢复，但雷帕霉素会抑制恢复(图S6A和S6B). 为了研究TFEB的电泳迁移率是否与其核定位有关，我们进行了亚细胞分离实验，发现MTORC1失活后，核中只存在快速迁移的TFEB().
MTOR在细胞内以两种不同的复合物形式存在，即MTORC1和MTORC2，这取决于其分别与RPTOR（RAPTOR）或RICTOR的结合。为了证实TFEB的活性由MTORC1调节，我们通过消耗无线电接收机或RICTOR公司带有特定的siRNAs。在缺乏RPTOR的细胞中，TFEB主要积聚在细胞核中，无论是在没有PP242的情况下还是在有PP242存在的情况下，都以快速迁移的形式出现(). 通过免疫印迹法评估无RPTOR时MTORC1的下调(图S7). 相反，通过耗尽RICTOR使MTORC2失活并没有改变TFEB的分布或电泳运动(). 总之，我们的结果揭示了MTORC1的活性与TFEB的运动性和亚细胞分布之间的明显相关性。
YWHA蛋白作为TFEB新结合伴侣的鉴定
为了进一步了解调节TFEB在细胞质中滞留的机制，我们寻找与TFEB相互作用的蛋白质。用Flag表位抗体免疫沉淀重组TFEB，用SDS-PAGE分离样品，并用考马斯染色观察。重要的是，在DMSO处理的细胞中观察到约27kDa的条带与TFEB共同免疫沉淀，但在PP242处理的细胞内几乎消失。从凝胶中切下带，进行胰蛋白酶化，进行质谱分析，并鉴定为YWHA(). YWHA作为TFEB的新结合伙伴的鉴定非常令人鼓舞，因为YWHA蛋白家族在营养敏感途径和几个转录因子的核转运中起着关键的调节作用。19,20抗YWHA抗体的免疫印迹证实了TFEB与内源性YWHA的相互作用(). 该实验还证实，用PP242处理细胞可显著减少TFEB共免疫沉淀的YWHA数量(). 此外无线电接收机（但不是RICTOR公司)几乎消除了这种相互作用，从而证实MTORC1的失活分离了TFEB/YWHA复合物(图S8). 在哺乳动物中，已经鉴定出至少七种不同的YWHA亚型。我们的质谱数据表明TFEB优先结合YWHAG（γ）和YWHAZ（zeta/delta）亚型（数据未显示）。然而，大多数YWHA亚型被发现与TFEB共免疫沉淀(图S9). 考虑到YWHA亚型的特异性很低，并且许多亚型可以相互形成异二聚体，这一点并不奇怪。
图3。S211是TFEB中与YWHA结合所需的一个新的MTORC1依赖性磷酸化位点。（A） 用二甲基亚砜或PP242处理的HeLa（CF7）细胞共免疫沉淀TFEB和YWHA的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶。星号（*）表示IgG重链和轻链。箭头表示肌动蛋白。（B） 免疫沉淀的免疫印迹分析，如（A）所示。（C） 免疫印迹分析如（A）所示获得的免疫沉淀物，并与小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）孵育或不与之孵育。（D） 人TFEB S211磷酸化位点与MITF和TFEB同源序列的多序列比对。（E） 过表达氨基酸特异性突变体和截短型TFEB的ARPE-19细胞免疫沉淀物的免疫印迹分析。（F） 含TFEB S211的肽（VGVTSSpSCPADL）在丝氨酸211处显示磷酸化的碰撞诱导解离（CID）光谱。（G） 从用二甲基亚砜或PP242处理的细胞中提取肽（m/z=636.766）的离子色谱图（XIC）。
TFEB与YWHA的结合依赖于磷酸化，需要Ser211
YWHA与靶蛋白的磷酸化依赖性结合是实现磷酸化失活的常见机制。然而，YWHA也能以磷酸化依赖的方式结合蛋白质。21为了区分这两种可能性，TFEB通过碱性磷酸酶处理去磷酸化。如所示TFEB的去磷酸化消除了与YWHA的相互作用，表明这种结合依赖于磷酸化。小眼相关转录因子（MITF）是一种与TFE家族密切相关的转录因子，也以磷酸化依赖的方式与YWHA相互作用。22序列比对显示，MITF和TFEB之间的YWHA结合基序具有高度同源性，并确定S211为TFEB中的假定YWHA位点(). 该基序在不同的TFEB直向同源物中也得到了很好的保守(). 此外，使用基于肽基序的扫描算法（scansite.mit.edu）分析TFEB序列23还确定S211为弱相关的YWHA结合基序(图S10).
基于这些数据，我们分析了模拟该位点非磷酸化状态（S211A）的突变是否影响与YWHA的相互作用。正如预测的那样，S211向Ala的准时突变完全消除了TFEB与YWHA的相互作用(). 相反，相邻Ser残基S209和S210的突变没有任何影响。TFEB中的几个额外的丝氨酸/苏氨酸残基被磷酸化以响应特定的信号通路，包括MAPK1的S14213以及T330、T331、S332和S334对雷帕霉素的反应。24然而，这些残基突变为Ala（突变体S142>A和TS>A）对TFEB/YWHA复合物的形成没有影响(). 最后，TFEB C末端富含丝氨酸区域的缺失或准时突变(462SSRRSSFS系统469)（突变体1-358、1-459和5S>A）都没有改变TFEB结合YWHA的能力(). 因此，我们的数据证实，TFEB和YWHA之间的相互作用是由S211介导的。
MTORC1调节TFEB与YWHA的磷酸化依赖性结合
S211从未被确定为TFEB中的磷酸化位点。这可能是因为在以前的质谱研究中，多肽裂解高度依赖胰蛋白酶。13为了获得更合适的消化模式，我们用糜蛋白酶消化样品，并用纳米级高效液相色谱-质谱（nanoLCMS）进行分析。我们的结果证实了S211在控制条件下确实被磷酸化()（另一个显示不同肽的CID光谱的示例如图S11). 值得注意的是，无标记定量显示，PP242处理后MTORC1失活导致S211磷酸化水平降低3.6倍(;图S11). 这些结果表明，MTORC1在S211诱导TFEB磷酸化，从而促进TFEB与YWHA的结合。
接下来，我们测试了与YWHA的结合是否足以将TFEB保留在胞浆中。与这一观点一致，我们发现S211突变为丙氨酸（TFEB-S211A）导致在没有MTORC1抑制剂的情况下，TFEB大量积聚到大多数细胞的细胞核中(). TFEB-S211A也被有效地招募到晚期内体/溶酶体中(). 饥饿对MTORC1的抑制进一步增加了细胞核中含有TFEB-S211A的细胞数量（从未处理细胞的70%增加到饥饿细胞的80%）。因此，我们不能排除S211以外的其他Ser/Thr残基也可能参与TFEB的调节。
图4。TFEB/YWHA复合物的解离导致TFEB运输到细胞核，并增加自噬和溶酶体基因的表达。（A） 免疫荧光共聚焦显微镜显示TFEB-S211A在ARPE-19细胞中的核定位和晚期内体/溶酶体定位。（B） TFEB核定位的量化如（A）所示。数值为五个独立实验的平均值±SD。自噬mRNA表达的相对定量RT-PCR分析(自动液位计9B和UVRAG公司)和溶酶体(灯1和MCOLN1型)感染对照腺病毒（Null）或表达TFEB-wt或TFEB-S211A的腺病毒的ARPE-19细胞中的基因。数值为三个独立实验的平均值±SD。比例尺：10μm***p＜0.001**p<0.01*p<0.05；不重要。
以前曾描述过TFEB的过度表达会增加一些自噬和溶酶体基因的转录。10,13为了确定TFEB-S211A突变体是否能够诱导转录，或者如果需要MTORC1失活诱导的额外修饰，我们测量了几个已知TFEB靶点的表达，包括自噬(自动液位计9B和UVRAG公司)和溶酶体(灯1和MCOLN1型)基因。如所示TFEB-S211A的过度表达显著增加了自噬和溶酶体基因的转录，尽管MTORC1仍保持活性(图S12). TFEB-S211A比TFEB野生型更有效地诱导特定基因的转录，因此表明TFEB向细胞核的转运在调节TFEB活性中至关重要。此外，TFEB-S211A的过度表达导致自噬体和细胞溶质SQSTM1的大量积累(). 在TFEB-wt和TFEB-S211A过度表达时，还观察到LC3-II、SQSTM1、UVRAG和LAMP1蛋白水平增加，LC3-II/LC3-I和LC3-II/actin比率增加(). 总之，我们的数据表明TFEB/YWHA复合物的分离导致TFEB转运到细胞核并增加自噬。
图5。TFEB-S211A诱导自噬体的积累。免疫荧光共聚焦显微镜显示，在过度表达TFEB-S211A的ARPE-19细胞中，自噬体积累（A）和细胞溶质SQSTM1（B）增加。（C） 感染腺病毒Null或表达TFEB-wt或TFEB-S211A的腺病毒的ARPE-19细胞裂解物的免疫印迹。使用所示抗体检测蛋白带。（D–I）蛋白质条带的量化，如（C）所示。条形图表示LAMP1/actin（D）、UVRAG/actin（E）、SQSTM1/Acton（F）、LC3的比率二/生命周期3我（G） ，LC3二/肌动蛋白（H）和TFEB Flag/肌动蛋白（I）表达为腺病毒Null感染的细胞的比率的倍数增加。数值为三个独立实验的平均值±标准差。比例尺：10μm***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
TFEB与MTORC1复合物相互作用
最后，我们探讨了调节TFEB与晚期内胚体/溶酶体膜关联的机制。最近的证据表明，MTORC1被招募到晚期内体/溶酶体中以响应氨基酸，并在那里组装成活化的MTORC1复合物。这种氨基酸依赖性募集需要Rag GTPases和LAMTOR，这是一种由LAMTOR1/2/3蛋白组成的支架复合体，并将Rag GTPases锚定在溶酶体上。25,26重要的是，TFEB能够协同免疫沉淀内源性LAMTOR/RRAG/MTORC1复合物的几个成分，包括MTORC1、RPTOR、RRAGC和LAMTOR1。此外，Torin-1是一种MTORC1抑制剂，可促进TFEB从细胞质到晚期内体/溶酶体的有效穿梭，在经Torin-1处理的细胞中，这种相互作用显著增强(;图S13). 因此，我们的数据表明，TFEB通过与MTORC1复合物的直接相互作用被募集到溶酶体膜，进一步证实了MTORC1在TFEB激活中发挥的重要作用。
图6。TFEB与MTORC1复合物相互作用。（A） 用DMSO或Torin-1（250 nM）在37°C下处理1 h的HeLa（CF7）细胞，并用抗Flag抗体对TFEB-Flag进行免疫沉淀。然后使用针对MTORC1复合物和RAB7组分的指示抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹分析。注意，输入物占总裂解物的3%，免疫沉淀TFEB占总免疫沉淀物质的10%。（B） 模型描述了MTORC1对TFEB的拟议机械调节。
讨论
本研究首次表明，TFEB在S211以MTORC1依赖的方式磷酸化，并提供了有关该转录因子在胞浆中保留的机制信息以及这些事件在调节自噬途径中的重要性。我们发现，MTORC1促进TFEB与作为TFEB细胞质阻遏物的YWHA蛋白的磷酸化依赖性关联。我们的数据进一步揭示，MTORC1失活后，TFEB/YWHA复合体解离，从而允许TFEB转运到细胞核，并转录与自噬体和溶酶体形成相关的多个基因(). 鉴于TFEB在治疗储存障碍方面的治疗潜力，14阐明调节TFEB激活的机制至关重要。
最近，两项研究探讨了TFEB激活的机制，并产生了一些相互矛盾的结果。Ballabio的研究小组发现，饥饿会导致TFEB转运到细胞核，并增加体内外自噬基因的转录。他们提出，MAPK1对S142的磷酸化导致TFEB在胞浆中滞留，而S142突变为Ala则导致TFEB在细胞核中积聚。13相反，Brugarolas的研究小组认为，在MTORC1活性高的细胞（TSC2-小鼠胚胎成纤维细胞）中，氨基酸462-469之间富含丝氨酸的区域的磷酸化触发了TFEB向细胞核的转运。此外，他们报道S142突变为Ala并不影响TFEB的亚细胞分布。27因此，显示TFEB在饥饿时或MTORC1活性高时定位于细胞核的明显矛盾数据需要进一步澄清。
我们的研究为之前发表的一些结果提供了关键的确认，并添加了关键和新颖的信息，以澄清和扩展我们对TFEB功能的理解。与Settembre等人的观点一致，我们发现饥饿会导致TFEB在细胞核中积累，从而证实营养水平在TFEB的激活中起主要作用。我们还证实，TFEB的过度表达会增加自噬和溶酶体基因的转录，并导致自噬体的积累。然而，我们认为MTORC1是TFEB活性的主要调节器。在这方面，值得注意的是，MTORC1的活性也受到营养物质的调节，并且MTORC1在饥饿条件下失活。与Peña-Llopis等人一致，我们表明MTORC1是TFEB激活的关键调节器。然而，Peña-Llopis的研究和我们的研究之间有一个关键的区别。虽然Peña-Llopis等人认为活性MTORC1诱导TFEB向细胞核的转运，但我们发现活性MTORC1促进TFEB在胞质溶胶中的螯合，并且必须发生MTORC1的失活才能触发TFEB向细胞核的转运和自噬基因的转录。事实上，很难解释为什么活性MTORC1（自噬抑制剂）会促进TFEB依赖的自噬基因转录。Peña-Llopis等人认为，这一过程可能与MTORC1活化后自噬体的溶酶体重组有关。28然而，我们在MTORC1失活后仅30分钟就观察到TFEB重新分布到细胞核，此时尚未发生自溶体形成和MTORC1再活化。此外，TFEB在细胞核中的积累与自噬体的形成无关，我们的结果表明，沃特曼和LY294002都通过抑制PtdIns 3-激酶III型阻止自噬体形成，但仍诱导TFEB活化。Peña-Llopis等人的研究没有解决TSC2-缺陷细胞中TFEB靶向哪些基因（或自噬是否增强）。因此，一种可能是MTORC1在自噬后的重新激活以不同的方式修饰TFEB，从而促进一组特定的TFEB应答基因的转录。
重要的是，我们的研究首次阐明了调节TFEB在胞浆中滞留的机制，并确定S211是TFEB中的一个新的磷酸化位点。以前的质谱研究依赖胰蛋白酶进行多肽裂解。13然而，我们发现用胰蛋白酶消化TFEB会产生不适合质谱分析的大片段。相反，用糜蛋白酶消化可以明确揭示S211处TFEB的MTORC1依赖性磷酸化。我们的研究还首次确定YWHA是TFEB的新结合伴侣，并表明YWHA和TFEB之间的相互作用是磷酸化依赖性的，并由S211介导。
最后，我们报告了通过使用固定细胞和活体成像激活后TFEB向晚期内体/溶酶体募集的初步描述。这种联系的生理意义目前尚不清楚，但越来越多的证据表明，内吞室作为特定信号复合物的膜平台发挥作用。29TFEB向晚期内体/溶酶体（活性MTORC1所在的隔室）募集可能会大大提高其磷酸化潜能。TFEB可能持续在胞浆和晚期内体/溶酶体之间穿梭，以持续监测MTORC1活性。或者，TFEB的额外修饰或异源寡聚可能发生在溶酶体上，从而为该转录因子的激活提供进一步的检查点。重要的是，我们观察到TFEB与LAMTOR/RRAG/MTORC1复合物的几个成分共同免疫沉淀。未来的研究将有助于辨别TFEB是否是用于氨基酸传感的溶酶体相关机械的一部分。
本研究对TFEB在诱导溶酶体应激条件下激活的机制提供了重要的新见解。10溶酶体中的蛋白质降解缺陷导致细胞中氨基酸水平降低，并伴随MTORC1失活。30这也解释了最初的观察结果，即TFEB定位于LSD细胞的细胞核，10由于这些疾病中缺乏特异性溶酶体水解酶，导致溶酶体降解中断。此外，很容易推测抑制MTORC1功能的额外应激源，如线粒体功能障碍或ER应激，也可能激活TFEB。最后，重要的是要记住，TFEB不仅激活自噬基因，还激活与溶酶体生物发生、胞内和胞外调节以及与基本蛋白质降解相关的非溶酶体酶的表达有关的基因。12因此，与MTORC1在控制分解代谢过程中发挥的关键作用一致，我们的数据表明MTORC1是细胞主要降解途径的主要调节器。
总的来说，这项工作提高了我们对MTOR生物学及其在多种代谢和贩运途径的复杂细胞协调中的机制作用的理解。已经证实，MTOR调节与线粒体代谢和脂质合成有关的几个转录因子的活性。在这里，我们揭示了这种激酶通过调节执行自噬程序所必需的基因的表达，在维持细胞内环境稳定中的新的和新颖的作用。
材料和方法
细胞系和药物治疗
ARPE-19细胞（American Type Culture Collection，CRL-2302）在37°C下生长于DMEM和火腿F12培养基的1:1混合物中，该培养基补充有10%的胎牛血清（Invitrogen，21041-025）、2 mM Glutamax™（Gibco，35050）、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Gibco2114），并在5%的加湿CO中培养2大气。按照制造商的建议，使用FuGENE-6试剂（Roche Applied Science，11988387001）瞬时转染细胞。转染细胞在转染后18–24小时进行分析。在感染实验中，根据制造商的建议，细胞被腺病毒感染。感染后16-24小时进行分析。稳定表达TFEB-FLAG的HeLa（CF7）细胞10是Andrea Ballabio博士（德克萨斯州休斯顿贝勒医学院和意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所）的一份礼物。CF7细胞在37°C的DMEM培养基（Gibco，10569）中生长，DMEM培养基补充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.5 mg/ml遗传素（Invitrogen，10131-035），在湿润的5%CO中2大气。将细胞在含有以下试剂之一的培养基中在37°C下孵育2小时：二甲基亚砜（Fisher Scientific，BP231-1）、LY294002（50μM）、沃特曼宁（2μM）、雷帕霉素（0.2μM）、U0126（20μM）和PD98059（50μM）来自细胞信号技术（分别为9901、9951、9904、9903和9900）；PP242（1μM）、MK2206（1μM）和XL147（10μM）分别来自Selleck（S2218、S1078和S1118）；SB203580（20μM）、MAPK8抑制剂II（20μM）、化合物C（40μM）和AMPK活化剂（20μL）分别来自Calbiochem（559398、420119、171261和171256）；Torin-1（250 nM）来自TOCRIS（4247）。在饥饿实验中，细胞在Hank的平衡盐溶液（Invitrogen，14175）中清洗三次，并在37°C的Earle平衡盐溶液中培养4小时（Sigma-Aldrich，E2888）。
抗体
使用了以下小鼠单克隆抗体：克隆14至EEA1，克隆Ab5至肌动蛋白，克隆3/P62 LCK配体至SQSTM1（BD Transduction Laboratories，610457，612656和610832），克隆4C5至Flag（Origen，TA50011），克隆H4A3至LAMP1（Developmental Studies Hybridoma Bank，CD107a），克隆M2和M5至Flag（Sigma-Aldrich，F3165，F4042）.还使用了以下多克隆抗体：抗MTOR、抗RPTOR、抗RICTOR、抗磷酸p70 S6激酶、抗p70 S6-激酶、抗磷酸4E-BP1、抗4E-BPl、磷酸-MAPK1/3、抗YWHA、抗组蛋白H3、抗RAB7、，抗UVRAG和抗RRAGC分别来自Cell Signaling Technology（2983、2280、2114、9205、2708、9451、9644、4695、8312、4499、2094、5320和5466）抗LC3和抗LAMTOR1（Sigma-Aldrich，L7543和HPA002997）、抗Porin和抗LAMP1（Abcam，ab15895和ab24170）以及抗Flag（Covance，PRB-132C）。Alexa Fluor 568-共轭山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 488-共轭羊抗兔IgG购自Invitrogen（A21090和A-11008）。HRP结合的抗鼠或抗兔IgG从细胞信号技术（7076和7074）获得。
腺病毒
Welgen，Inc.制备、扩增和纯化了表达TFEB或TFEB-S211A的腺病毒。
质粒
编码全长人TFEB的质粒先前已有描述10Andrea Ballabio博士（德克萨斯州休斯顿贝勒医学院和意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所）。根据制造商的说明，使用QuickChange Lightning定点突变试剂盒（Stratagene，200522/200521）进行TFEB中的氨基酸替换。
免疫荧光共聚焦显微镜
对于免疫荧光，用PBS清洗盖玻片上生长的细胞，并在室温下用4%甲醛固定15分钟，或在-20°C下用甲醇/丙酮（1:1，v/v）固定10分钟。为了监测TFEB的核定位，细胞在含有0.2%Triton X100的PBS中在室温下渗透10分钟。然后在室温下将细胞与含有10%胎牛血清和0.1%（wt/v）皂苷的PBS中指示的一级抗体孵育1小时，然后与对应的与Alexa Fluor-568或Alexa Fuor-488结合的二级抗体孵育。染色后，使用Fluoromount-G将盖玻片安装在玻璃载玻片上（Southern Biotech，0100-01）。图像是在蔡司LSM 510共焦系统上采集的，使用63X NA 1.4油浸物镜，使用488 nm和543 nm激光激发（卡尔蔡司）。
亚细胞分离
在NP-40裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 7.9，140 mM KCI，5 mM MgCl）中裂解细胞2和0.5%NP-40）补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂并在冰上保存15分钟。然后将裂解液在1000 x g下离心3分钟。上清液代表细胞溶质加上膜部分。小球（核部分）在NP-40裂解缓冲液中洗涤两次，并在Laemmli样品缓冲液中进行超声处理。对于溶酶体膜分离，细胞在150mm的培养皿中培养，使用商业溶酶体富集试剂盒进行裂解和处理（Thermo Scientific，89839）。
RNA干扰（RNAi）
对于siRNA敲除，使用DharmaFECT转染试剂转染细胞，转染ON-TARGETplus非靶向池siRNA双工或ON-TARGETplus智能池siRNA双工无线电接收机或RICTOR公司基因（Dharmacon-Thermo Scientific，分别为D-001810-10-20、L-004107-00-005和L-016984-00-005）。转染72小时后分析处理细胞。
质谱法
免疫沉淀蛋白依次用二硫苏糖醇还原并用碘乙酰胺烷基化。然后用胰蛋白酶或糜蛋白酶消化蛋白质。使用配备纳米LC系统（Eksigent）的LTQ Orbitrap Velos（Thermo Fisher Scientific）对所得肽混合物进行分析。用于磷酸化位点鉴定，TiO2在质谱分析之前，使用柱富集磷酸肽。肽ID和磷酸化位点使用Mascot 2.3（矩阵科学）进行分配，并使用Scaffold 3软件（蛋白质组软件）进行手动验证。对于无标签定量，使用Proteome Discoverer 1.3（Thermo Fisher Scientific）计算肽峰面积。
共免疫沉淀、电泳和免疫印迹
用冰镇PBS清洗细胞，将其重新悬浮在裂解缓冲液中（25 mM Hepes-KOH，pH 7.4，250 mM NaCl，1%Triton X-100（wt/v），辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物），并将样品通过25号针头进行10次裂解。将细胞裂解物在16000 x g的温度下在4°C下离心15分钟，并收集可溶性部分。对于免疫沉淀，将可溶性组分与2μl抗FLAG抗体和蛋白G-Sepharose珠（Amersham，17-0618-01）在4°C下孵育2小时。收集与珠子结合的免疫沉淀物，用裂解缓冲液洗涤四次，并用莱姆利样品缓冲液洗脱蛋白质。样品在还原条件下通过SDS-PAGE（4–20%梯度凝胶，Invitrogen，EC61385BOX）进行分析，并转移至硝化纤维。使用所示抗体对膜进行免疫印迹。辣根过氧化物酶化学发光是使用西方闪电化学发光试剂Plus（PerkinElmer Life Sciences，NEL 104001EA）开发的。
RNA分离和相对定量实时聚合酶链反应
按照制造商的建议，使用PureLink RNA迷你试剂盒（Invitrogen，12183018A）从细胞中分离RNA。使用纳米滴ND-1000分光光度计（Thermo Scientific）量化RNA产量。使用寡核苷酸（dT）在20μl反应中进行RNA（2-4μg）的反转录20和SuperScript III一线合成系统（Invitrogen，18080400）。使用5μl SYBR GreenER qPCR SuperMix（Invitrogen，11760100）、2μl cDNA、1μl基因特异性引物混合物（QuantiTect引物分析）和2μl水进行相对定量实时PCR，总反应体积为10μl。使用7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）对基因表达进行量化。反应的热特性为：50°C持续2分钟，95°C持续10分钟，35次95°C循环15秒，然后60°C持续1分钟。所有样品一式三份。用参考内源性基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）对感兴趣序列的扩增进行标准化。该值表示为与感染对照腺病毒（Ad-Null）的细胞RNA的比率。7900HT快速实时PCR系统软件用于数据分析（Applied Biosystems）。
统计分析
数据在Excel（微软公司）和Prism（GraphPad软件）中进行处理，以生成曲线图和条形图，并进行统计分析。对每个因变量进行单因素方差分析和两两后验*p<0.05具有统计学意义**p<0.01，非常显著；***p<0.001，极显著。p>0.05被认为不显著（n.s.）。
致谢
我们感谢B.Lelouvier和C.Mullins的帮助。该项目得到了NIH、国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）的院内研究计划的支持。
作者贡献：J.M.参与了实验策略，进行了实验并分析了数据。Y.C.和M.G.设计、帮助执行和解释质谱分析。R.P.设计了研究，进行了实验，分析了数据，监督了项目，并撰写了手稿。所有作者都审阅了手稿。
工具书类
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