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分子细胞蛋白质组学。2012年5月；11(5): 202–214.
2012年3月26日在线发布。 数字对象标识：10.1074/mcp。M112.017707号
PMCID公司：项目经理3418851
PMID：22454539

在Skyline中使用MS1提取离子色谱图对蛋白质组数据进行平台依赖和无标签定量

蛋白质乙酰化和磷酸化的应用*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg
比吉特-席林,‡§ 马修·J·拉丁,‡§ 布伦丹·X·麦克莱恩,§ 安娜·M·扎瓦兹卡,‡ 芭芭拉·弗雷文, 迈克尔·库萨克,‡ 迪伦·索伦森,‡ 迈克尔·贝勒曼, 恩轩静,‖ 克里斯汀·C·吴,** 埃里克·威尔第,‡‡ C.罗纳德·卡恩,‖ 迈克尔·麦考斯,§§和布拉德福德·W·吉布森‡¶¶
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

尽管定量蛋白质组学的代谢和代谢后标记方法取得了进展，但仍需要改进无标记方法。这一需求对于在肽水平上结合亲和力富集的工作流程来说尤为迫切，其中等压化学标签，例如用于相对和绝对定量的等压标签和串联质量标签可能会被证明有问题，或者在细胞培养标签中不能轻易应用氨基酸的稳定同位素标记。Skyline是一个免费的开源软件工具，用于定量数据处理和蛋白质组分析。我们扩展了Skyline的功能，以处理在HPLC-MS/MS蛋白质组实验期间获得的全扫描质谱数据（MS1）中肽分析物的离子强度色谱图。此外，与现有的程序不同，Skyline MS1过滤可以与四大供应商的质谱仪一起使用，这样可以在实验室之间直接比较结果。Skyline现在提供的新的定量和图形工具专门支持MS1过滤的多个采集的询问，包括峰值拾取的视觉检查以及自动和手动集成，这是现有软件中经常缺乏的关键功能。此外，Skyline MS1过滤显示光谱库中包含的基本MS/MS数据的保留时间指示器，以确保正确的峰值选择。Skyline的模块化结构还提供了定义良好、可定制的数据报告，从而允许用户直接连接到现有的统计程序进行事后数据分析。为了证明MS1过滤方法的实用性，我们在多个MS平台上进行了实验，并专门检查了该方法的性能，以量化两个重要的翻译后修饰：乙酰化和磷酸化，在使用小鼠和人类模型的日益复杂的以肽为中心的亲和工作流中。

质谱已迅速发展成为一种高通量方法，用于识别差异表达的蛋白质或翻译后修饰（有关审查，请参阅参考文献。1). 这些数据可用于提高对调控途径的理解，发现新的疾病生物标记物，并表征正常和病理过程的分子机制。有几种方法可用于使用稳定同位素标记或无标记工作流进行差异蛋白质组学，如参考文献。2.对于代谢标记，通过细胞培养或SILAC中的氨基酸进行稳定同位素标记1通常用于细胞培养实验(三)尽管这种方法最近被用于动物研究(4,5). 另一种方法是，在蛋白质合成、分离和蛋白水解消化后，在代谢后环境中对肽进行化学标记的等压标记策略。iTRAQ公司(6)和最近的串联质量标签(7,8)是该策略的两个广泛使用的示例，能够分别多路复用多达6到8个单独的样本。还描述了其他方法，例如18蛋白质水解过程中的O标记，但由于技术挑战尚未被广泛采用。

尽管取得了这些进展，但使用等压标签或SILAC进行定量并不适用于所有实验工作流程。例如，SILAC标记在涉及哺乳动物模型组织的蛋白质组学研究中可能成本过高，甚至不可行(例如老鼠）或人类(例如血浆或肿瘤活检）。代谢后标记策略，如iTRAQ，原则上可用于哺乳动物系统，尽管在某些情况下可能不切实际。例如，在针对翻译后修饰（PTM）肽的以肽为中心的工作流中，抗体或其他富集步骤可能与化学标签不兼容。我们自己将抗乙酰赖氨酸抗体富集步骤与iTRAQ结合的努力在很大程度上是失败的，含有这种修饰的肽的富集效率显著低于没有化学标记的肽。2

无标记定量方法更适合于SILAC标记不可能或代谢后等压标记方法可能导致严重效率低下的蛋白质组实验。近年来，人们描述了几种无标签方法，包括MS/MS光谱计数(9,10)和MS离子强度测量(11). 然而，光谱计数方法通常用于小动态范围内的相对蛋白质定量，不适用于以天然肽为中心的亲和力富集工作流。相反，从MS1扫描中提取离子丰度的无标签定量方法与PTM修饰肽的定量更兼容，因为每个肽分析物都是分开处理的。这种类型的方法包括MSQuant(12)，MaxQuant(13)，人口普查(14)、MASIC(15)，超级Hirn(16)和频谱磨机(17)等（审查见参考。11). 然而，现有的MS1提取工具通常仅限于特定的仪器平台，或针对特定实验室的数据管道进行定制。此外，通常不存在允许对已处理的多副本数据集进行即时评估和运行到运行的功能比较的图形输出。也许最重要的是，显然缺乏可在多个实验室使用的真正的平台独立的定量程序，从而限制了大规模蛋白质组实验或直接比较不同实验室和仪器的数据集的能力。

为了解决这些限制，我们调整了Skyline，这是一个免费的开源软件应用程序(http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)，提供一种称为Skyline MS1过滤的无标签定量工具，该工具可有效提取和处理多肽前体MS1扫描的离子强度色谱图。我们扩展了最初在Skyline开发的用于多反应监测（MRM）-MS实验的定量和图形工具(18)支持查询MS1过滤的多个样本采集。Skyline中的这些工具提供峰值选择的图形显示，复制峰值面积和保留时间的视图，审查后，Skyline允许手动峰值集成（必要时），而现有软件通常缺乏这些关键功能。此外，Skyline MS1过滤显示所选MS1峰值特征与其基础MS/MS数据的直接链接，以确保正确的峰值选择和集成，以及以独立于供应商的格式轻松导入原始数据文件。自发布以来，Skyline已被证明是一个高度可靠和灵活的针对性MRM-MS分析程序(19–21). 它目前正用于国家癌症研究所癌症临床蛋白质组技术评估项目，以评估跨多个地点和实验室的大规模蛋白质组实验的再现性和准确性2(http://proteomics.cancer.gov/programs/cptacnetwork网站). 为了测试Skyline MS1过滤在无标签定量蛋白质组学中的实用性，我们进行了比较实验，以检查处理几种仪器类型（包括QqTOF和LTQ FT-ICR质谱仪）数据的能力，并获得了多肽的适当线性和定量响应曲线。一旦建立了这些性能指标，我们就进行了一系列针对两个重要PTM的实验，即磷酸化和N个-ε-乙酰化，这将对Skyline MS1滤波的性能和鲁棒性提供更严格的评估，特别是在缺乏定量方法的以肽为中心的工作流中。这些实验是用越来越复杂的样品和工作流程设计进行的，包括针对乳腺癌细胞系和转基因小鼠模型分离的线粒体中PTM变化的肽亲和力富集步骤。

实验程序

材料

包括乙腈和水在内的HPLC溶剂从Burdick和Jackson（密歇根州马斯科根）获得。蛋白质化学试剂包括碘乙酰胺、DTT、碳酸氢铵、甲酸、三氟乙酸、乙酸、二氯乙酸（DCA）、十二烷基甲糖苷、尿素，以及蛋白质标准物牛血红蛋白、BSA、兔磷酸化酶B和酵母烯醇酶均购自Sigma-Aldrich。所有蛋白质标准品的纯度均大于95%。三（2-羧乙基）膦从Thermo（Rockford，IL）购买，HLB Oasis SPE滤芯从Waters（Milford，MA）购买。透析盒（MWCO 3 kDa）来自Pierce，蛋白质组学级胰蛋白酶来自Promega（Madison WI）。胰蛋白酶消化β-半乳糖苷酶（质量控制标准）购自AB SCIEX（加利福尼亚州福斯特市）。

蛋白质标准品的氨基酸分析（用于LTQ FT-ICR浓度曲线）

氨基酸分析由AAA实验室（华盛顿州默瑟岛）进行。5%乙酸（2 mg/ml，w/v）中的蛋白质标准品在6n个盐酸、0.05%β-巯基乙醇、0.02%苯酚在110°C下24小时。除半胱氨酸和色氨酸外，氨基酸的浓度通过紫外可见液相色谱法和6点标准曲线进行测量。

PTM肽富集试剂

从ImmuneChem（ICP0380-100）和Cell Signaling（9441）购买抗乙酰化赖氨酸抗体，以富集乙酰化肽。使用Titanosphere Phos-TiO试剂盒（200μl色谱柱，GL Sciences）进行二氧化钛色谱法富集磷酸化肽。用于Western blots的抗丙酮酸脱氢酶1α抗体从Abcam（全蛋白）、EMD（pSer-293）购买，或作为Abcam的J.Murray博士的慷慨礼物提供（Ser（P）-300和Ser（P）-232）。含有稳定同位素标记的赖氨酸或精氨酸残基的乙酰化和磷酸化合成肽(13C类615N个2-Lys和13C类615N个4-Arg）分别从赛默飞世尔科技公司获得。

数据访问

与这份手稿相关的数据可以从位于西雅图的华盛顿大学服务器下载http://proteome.gs.washington.edu/suppliementary_data/MS1_过滤/。使用MS1过滤进行肽定量的所有详细信息，包括所有MS复制品的肽峰面积，都以Excel文件的形式提供在名为“定量详细信息”的子文件夹中（也以Excel文件形式提供补充表S6，A–I类).

光谱查看器：用于审查含有肽的PTM的数据质量的Skyline光谱库

交互式Skyline光谱库文件包含已识别的含PTM肽的所有MS/MS光谱，并随后用于MS1过滤和定量补充文件S1。Skyline是一个开源程序，可以从以下网址下载http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline。该数据的所有MS/MS光谱细节显示在补充表S1(A–F)搜索引擎参数总结如下补充方法S1和表S1G公司.PTM站点分配最初由搜索引擎Protein Pilot和Mascot建议（详细信息见下文），并使用先前定义的标准通过手动检查进行确认(22). 所有含PTM的肽均作为光谱查看器天际线文件的一部分提供供审查。

Skyline MS1过滤工具算法与数据分析

Skyline是一个开源软件项目，可以免费安装(http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline). 使用BiblioSpec算法在Skyline中生成光谱库(23)在MS1过滤之前对原始数据文件进行数据库搜索。创建光谱库和MS1过滤的其他详细信息和教程可以在Skyline网站上查看(http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline). 对于专注于PTM肽的工作流，Skyline中的特定精炼功能被设置为从Skyline肽树中过滤出非乙酰化或非磷酸化肽。

简单地说，从包含MS/MS光谱的原始数据创建了一个综合光谱库，包括在一次运行中对单个肽进行重复采样以及在多次采集中进行采样（参见图2). 在原始数据文件导入和MS1过滤后，使用冗余库启用MS/MS定向MS1峰值拾取/集成和峰值识别（请参阅图3C类). 对于肽同位素的峰值拾取和离子强度积分，Skyline动态选择一个恒定的时间间隔，用于整个测量范围内的强度值。通过首先计算原始采集点之间间隔的模式，然后选择最小模式值来选择时间间隔。选择间隔后，通过线性插值将所有强度值映射为间隔宽度一致的间隔时间。对插值点进行峰值检测，并使用以秒为单位的梯形求和（s*i）计算峰值面积(24). 背景区域从所有峰值区域中减去，其中背景定义为以积分边界为边界的矩形区域x个轴和垂直于色谱图穿过积分边界的最小强度的线。通常，根据质谱仪器平台，将前体同位素输入过滤器设置为3个（M、M+1和M+2），分辨率为10000–50000(补充图S1A类). 每个肽使用多个前体同位素，可以使用不同的新指标对理论和观察到的同位素分布进行排序。这些包括Skyline肽树中的同位素等级和图形界面中的“预期”同位素分布(补充图S2). 此外，通过比较预期分布和观察到的分布（得分从0到1，其中1是最高的），可以生成同位素点积分数(补充图S3). Skyline提供了图形工具，以便在MS1过滤期间轻松直观地评估多个前体，利用该信息确认可靠的峰拾取，识别潜在干扰，并直观评估所选峰及其多个前体亚型的提取离子色谱质量（强度和噪声级）。原始文件以其本地文件格式直接导入Skyline，Skyline使用ProteoWizard数据访问库实现了这一点(25).

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MS1过滤蛋白质组数据流示意图。Skyline MS1过滤独有的新模块或显著修改的模块如所示文本框（解释见正文）。

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Skyline MS1过滤图形用户界面。 A类，肽YAPVA的Skyline肽树卡克DLAS公司R（右）(卡克是乙酰赖氨酸，并且R（右）是13C类615N个4-Arg）显示了三个提取的分子离子同位素峰M、M+1和M+2。B类从两个样品中采集的四个样品的色谱图和峰强度迹线是重复的，重肽的峰值分别为1和3 fmol（S1R1、S1R2、S2R1和S2R2）。这个垂直线带有注释的保留时间和标识(身份证件)标记最初指导MS1峰值选取的基本MS/MS采样。C类，Skyline显示所选肽的MS/MS光谱库，为特定采集复制提供潜在肽识别信息。在这种情况下，显示了四个重复物中两个重复物（S1R1和S2R2）的基本MS/MS光谱，尽管可以显示所有光谱。D类和E类，之前为目标LC-MRM数据处理开发的已建立Skyline可视化显示，包括峰值区域复制视图(D类)和保留时间复制(E类)（有关Skyline图形显示、设置和参数的更多详细信息，请参阅补充图S1–S3).

数据导入后，手动检查色谱痕迹的图形显示（提取的离子色谱图），以确定MS1过滤肽的正确峰值选取。在某些情况下，在色谱窗口中手动调整峰值积分。通过新的MS1过滤功能，其他Skyline功能也得到了更新和同步，例如Skyline自定义报告，它可以导出对MS1过滤分析和定量非常重要的其他相关字段和参数（请参阅教程部分）。由于我们对含PTM的肽采取以肽为中心的方法，因此作为本手稿的一部分进行的所有定量都是在肽水平上进行的。使用MS1过滤进行肽定量的所有细节，包括所有MS复制品的肽峰面积，均以Excel文件的形式提供补充表S6(A–I类)Skyline网站包含有关MS1过滤的详细教程。

Skyline MS1过滤的逐步说明（教程）

Skyline网站上发布了一个新的MS1过滤“一步一步”教程。本教程指导用户正确使用Skyline MS1过滤设置、参数和图形工具(http://proteome.gs.washington.edu/software/Skyline/tutorials/ms1filtering.html). 本教程提供了一个测试数据集，用户可以下载并描述导入光谱库、选择适当的设置和过滤器、填充Skyline肽树、导入质谱原始文件以进行MS1过滤和离子色谱提取的协议，以及利用新的图形工具来帮助评估和进一步处理数据集。天际线自定义报告中添加的新功能（“PrecursorResult.ItopopeDotProduct”、“PrecurrorResult.Identified”、“Transition.ItotopeDistIndex”、“过渡.ItoopeDistRank”、“转换.Itoope分布比例”等）在另一个名为“自定义报告和结果网格”的详细web教程中进行了解释(http://proteome.gs.washington.edu/software/Skyline/tutorials.html). 定期修订和更新将在Skyline MS1筛选中添加其他功能时进行。

质谱和色谱方法及仪器

使用三个质谱平台获取MS1过滤实验所用的所有数据。样品通过反相HPLC-ESI-MS/MS进行分析，使用（i）Eksigent Ultra Plus nano-LC二维HPLC系统（加利福尼亚州都柏林）连接到四极飞行时间三TOF 5600质谱仪（AB SCIEX），（ii）与四极飞行时间QSTAR Elite质谱仪（AB SCIEX）相连的Eksigent纳米液相色谱二维HPLC系统，以及（iii）与Waters超高压纳米液相色谱仪相连的配备7-Tesla超导磁体（Thermo Fisher Scientific）的LTQ FT-ICR质谱仪（马萨诸塞州米尔福德）。有关描述质谱仪参数和设置以及所有色谱设置和梯度条件的所有详细信息，请参阅补充方法S1.

生物信息数据库搜索TripleTOF 5600和QSTAR Elite

在这项研究中，分析和搜索了具有微小差异的质谱数据集。对于QSTAR Elite数据集，通常使用Analyst Mascot.dll v1.6b27（AB SCIEX）生成峰值列表，并使用Mascot搜索数据(26)服务器版本2.3.02。此外，还使用数据库搜索引擎ProteinPilot分析了TripleTOF 5600和QSTAR Elite的质谱数据(27)（AB SCIEX Beta 4.1.46，修订版460）和Paragon算法（4.0.0.0，459）。有关搜索参数、固定和可变修改、酶特异性、使用的数据库、评分、错误发现率分析等的所有详细信息，请参见补充方法S1和在中编译补充表S1G公司.

生物信息数据库搜索LTQ FT-ICR

MS1和MS2文件是使用Make MS2从原始文件派生的(28)然后使用内部管道和Sequest算法（版本2.7）进行搜索。有关搜索参数和诱饵数据库搜索的详细信息，请参阅补充方法S1.

标准浓度曲线的样品制备（TripleTOF 5600）

六种赖氨酸乙酰化合成肽13C类615N个2-Lys和13C类615N个4-精氨酸分别用于在复杂基质（复杂线粒体裂解物，柱上0.3μg）或简单基质（Michrome牛6蛋白混合物，柱上25 fmol）中生成标准浓度曲线，在八个浓度点（0.0041、0.0123、0.037、0.11、0.33、1、3和25 fmol）上从4.1个阿托莫到25个飞莫用于以下肽：LVSSVSDLPKacR公司（羟甲基戊二酰-CoA合酶2蛋白），MVQ卡克服务水平协议R（右）（羟甲基戊二酰-CoA合酶2蛋白），AFVDSCLQLHETKacR公司（长链特异性酰基辅酶A脱氢酶蛋白）卡克DLAS公司R（右）（SDHA蛋白），LFVD卡克我R（右）（ATP合成酶偶联因子6蛋白）和AFGGQSL卡克前景K（SDHA蛋白）。对于复杂和简单基质中的每条曲线，分别获得了三条浓度曲线，每条曲线的进样浓度从最低到最高。其他详细信息列于补充表S2.

标准浓度曲线样品制备（LTQ-FT-ICR）

制备由牛血红蛋白、BSA、兔磷酸化酶B和酵母烯醇化酶组成的等摩尔蛋白质标准混合物，并用胰蛋白酶进行还原、烷基化和消化，如补充方法S1.

磷酸化和乙酰化亲和力富集工作流方法

为了证明Skyline MS1过滤不同功能的效率和功能，研究了多种生物项目，特别是以肽为中心的工作流和分析翻译后修饰的肽，从“简单”到“复杂”的生物实验。这些生物测试用例实验的所有实验细节都在补充方法S1包括磷酸肽富集（TiO2色谱法），丙酮酸脱氢酶E1α激酶抑制剂研究的样品制备，乳腺癌生物标志物工作流程的条件培养基的制备，赖氨酸乙酰化肽的亲和纯化，以及小鼠骨骼肌线粒体蛋白裂解物的样品制备。

图解法（绘图和线性回归）

结合Python 2.7生成校准曲线图和线性回归(网址：www.python.com)和GNU R 2.12.2(http://www.r-project.org/). rpy2 2.1.9-1提供了互操作性(http://rpy.sourceforge.net/rpy2.html). 提供了源代码。在Skyline中集成峰值后，生成自定义Skyline报告，其中包含SampleName、PeptideSequence、PrecursorCharge、ProductMz、FragmentIon和Area等字段。数据通过自定义python程序进行解析，然后传递给R进行绘图生成和统计。在某些情况下，数据集包含异常值或其他非线性数据点。这些异常可以用干扰、饱和度或其他与分析相关的现象来解释。为了处理数据，使用MASS包中的lrm函数在R中拟合了一个稳健的加权线性回归(29). 稳健回归迭代地丢弃异常值，以计算更稳健和适当的拟合。回归与方差的倒数成比例加权。

测定LOD和LOQ

根据峰面积标度计算LOD。它是根据空白样品（样品b，无加标肽）的方差和最低加标浓度的方差（样品S，4个氨酚加标肽(30). 假设I型错误率α=0.05用于判断肽是否存在，II型错误率β=0.05用于检测肽是否存在时，LOD计算为LOD=平均值b条+吨1 − β*（S.D。b条+S.D.公司。S公司)/2，其中吨1 − β术语等于标准的（1−β）百分位吨上的分布n个自由度，其中n个等于复制次数。Y（Y）然后使用上述线性回归将值转换并计算为浓度。这种方法依赖于LOD处于回归区域，其中响应仍然是线性的。一旦测定了LOD，则使用惯用关系式计算LOQ：LOQ=3*LOD(31).

结果

Skyline MS1过滤方法

开发了Skyline中的全扫描MS1滤波，以从多个HPLC-MS/MS实验的数据相关采集中提取定量信息(图1A类). 来自多个供应商的本机MS仪器输出文件可以直接导入Skyline，Skyline使用ProteoWizard数据访问库实现了这一点(25). MS1过滤方法在Skyline 1.2版中完全实现，以提取选定肽前体离子的保留时间和强度色谱图。对于高分辨率MS1扫描，米/将前体同位素分布的z峰（M、M+1、M+2等）过滤到单独的色谱图中，以获得更高的选择性和色谱峰一致性确认(图1B类). MS1过滤设置基于MS仪器分辨率。在色谱提取过程中，Skyline将2×全宽窗口内的强度求和为理论预测质量电荷比的一半最大值(图1C类). 来自几个主要MS仪器供应商的原始数据已经过测试，包括AB SCIEX、Thermo、Waters和安捷伦。中提供了特定的Skyline MS1过滤设置和原始文件导入设置补充图S1，A类和B类。为了确保在整个数据采集过程中MS1和MS/MS扫描之间进行动态质谱采集切换的一致峰值积分区域，Skyline动态选择一个恒定的时间间隔，用于整个测量范围内的强度值。通过首先计算原始采集点之间间隔的模式，然后选择最小模式值来选择时间间隔。选择间隔后，通过线性插值将所有强度值映射为间隔宽度一致的间隔时间。在插值点上执行峰值检测，并使用强度（s*i）单位为秒的梯形求和计算一致的峰值面积(24).

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MS1过滤示意图。 A类，整个色谱梯度上MS1信号的热图米/z在高分辨率质谱仪上获得的距离。B类，“放大”显示典型肽分子离子的同位素包络，在M、M+1和M+2选择峰值，显示MS1强度随时间的变化。C类高分辨率数据允许对分子离子进行特定过滤，并分离同位素分布中的各个峰。天际线将单个分辨率内的强度与预测质量电荷比的任一侧相加，从而使滤波窗口达到理论分辨率的两倍，预测全宽达到一半最大值(2×半高宽). 用户可以根据MS仪器类型和首选同位素选择分辨率设置米/z采集范围。

Skyline MS1过滤工作流示意图如所示图2强调新的或显著修订的Skyline模块和工具。质谱原始数据来自多个HPLC MS/MS实验，以生成MS1和MS/MS扫描。MS/MS原始数据最初由几种可能的搜索算法之一进行处理，并创建相关的天际线光谱库。然后，该光谱库由Skyline BiblioSpec模块进行分析。此模块允许用户填充Skyline肽树、同位素前体质量和电荷状态列表，并设置用于MS1过滤的Skyline文档。然后，使用Skyline-ProteoWizard和新颖的Skyline“全扫描过滤器”将原始文件直接导入Skyline生成肽MS1离子色谱图（提取离子色谱图）的模块。天际线内的自动峰值集成由MS/MS指导的峰值拾取进行指导。然后使用一组新的MS1过滤可视化工具，如识别注释、预期同位素分布、同位素秩和同位素点积分数（如下所述），以帮助评估数据质量，并在必要时调整峰值积分。

Skyline中用于检查MS1过滤数据的图形界面如所示图3Skyline肽树如所示A类。显示感兴趣肽的一个或多个同位素峰的离子色谱图，并附有注释，说明获取MS/MS光谱并与肽匹配的保留时间(图3,B类和C类). 包含所有MS/MS标识的肽搜索结果及其相应的保留时间从每次MS采集中获得，并导入Skyline以创建综合光谱库。光谱库可以从各种肽搜索引擎生成，并且支持多种数据格式(18). 然后导入原始MS采集文件，并提取色谱图，根据库中可用的采样MS/MS光谱将MS1特征与正确的肽序列相关联。

为了支持正确的峰选择，提取的离子色谱图在特定肽的取样MS/MS光谱的保留时间包含一个识别指示剂(图3B类). 光谱库还保留了在样品重复中获得的每个已识别的MS/MS光谱，并且可以在MS1离子色谱窗口内选择识别注释后查看(图3B类)或光谱窗口中的下拉菜单(图3C类). 此外，从数据中提取了多种同位素前体，以更充分地涵盖同位素包络(即M、 M+1、M+2等），对所选峰的适当积分和潜在干扰的识别提供额外确认(补充图S2). 然后，天际线对预选同位素峰的预期相对丰度（同位素秩）进行排序，并生成每个肽的实验和计算同位素分布之间的同位素相似性分数（同位素点积分数）(补充图S2和S3). 对于大多数肽，包括不太丰富的同位素（同位素秩2、3和更低），整体集成离子强度测量提高了定量的准确性，特别是对于更大的肽，更高质量的同位素对前体包络有重要贡献(补充图S4). 尽管张之前已经讨论过使用多种同位素进行定量(32)Skyline MS1滤波中实现的多个前兆特征在数据分析过程中为用户提供了有益的信息，并为查询峰值积分提供了极大的灵活性。Skyline多前体离子支持为用户提供工具，以直观评估多前体，并利用该信息确认可靠的峰值选取，识别潜在干扰，以及直观评估提取的离子色谱质量（强度、噪声级）选择的峰及其多种前体亚型。最后，显示了从两个重复样品中获得的四个样品中的每一个样品的单独保留时间和同位素峰面积贡献，在1或3 fmol时添加了重同位素肽(图3,D类和E类). 显示每个重复的每个同位素的贡献，以评估变异性和一致性。

为了证明这些特征，使用MS1过滤检测仪器操作1个月后胰蛋白酶消化β-半乳糖苷酶（质量控制标准）的实验重复品的峰面积、峰宽和保留时间变化。得到的胰蛋白酶肽在色谱（保留时间）和质谱（峰面积）性能特征方面均显示出高再现性(补充图S5A类). 为了支持此分析，可以使用Skyline导出以csv格式轻松创建自定义结果报告，记录每次采集的选定关键参数和指标，如峰值面积和保留时间（请参阅补充图5，B类和C类和表S6，A–I类).

标准浓度和响应曲线

为了评估Skyline MS1滤波的再现性和稳健性，在三个重复中生成了标准响应曲线(图4,A类和B类、和补充图S6). 对于TripleTOF 5600，六个重标记乙酰赖氨酸肽包含13C类615N个2-赖氨酸或13C类615N个4-精氨酸(补充表S2)将其加入线粒体蛋白裂解液（复合基质）和六蛋白标准消化液（简单基质）中，得到8种最终浓度，范围从4到25fmol。除最低浓度外，这些曲线显示出良好的线性响应，具有良好的重复性。对于每种受监控的肽，复杂基质和简单基质中的加权线性回归分别为0.93至1.03和1.00至1.13(补充图S6G公司). 在三个重复的每个浓度点计算的变异系数（CV）值低于20%CV，但复合基质中最低浓度（≤37 amol）除外(图3C类). 当添加到复杂线粒体基质中时，计算每个乙酰赖氨酸肽的LOQs，当仅整合第一前体同位素（M）时，LOQs的范围为52到185阿摩尔(补充表S3). 这些相同的样品也在较旧的QSTAR Elite（QqTOF）上进行了分析，得出了类似的线性响应曲线，尽管检测限没有那么低（数据未显示）。为了评估Skyline MS1过滤大量肽的可重复性，我们通过27次重复注射，从这些相同样品的复杂背景基质（线粒体小鼠肝提取物）中检测了366个自信确定的肽子集。在366个肽中，295个的峰面积CV小于20%，366个肽类中只有12个的CV超过30%(图4D类). 虽然峰面积CV略有改善，峰丰度增加，但即使在低峰面积也能实现良好的再现性(补充图S7).

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稳定同位素标记的和含乙酰赖氨酸的肽的标准浓度曲线。 A类和B类，雅典娜卡克DLAS公司R（右）(A类，琥珀酸脱氢酶复合物，亚单位A）和LVSSVSDLPKacR公司(B类，3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合成酶2），浓度范围从4到25飞秒。肽被稀释成简单的基质(红色三角形，25 fmol“六蛋白混合物”）或复合基质(蓝色圆圈，小鼠肝脏线粒体裂解物，柱上0.3μg），并在TripleTOF 5600质谱仪上获得三份。前体离子M的MS1过滤峰面积曲线米/z621.83952+(A类，重型YAPVA卡克DLAS公司R（右）)和米/z626.86042+(B类，重型LVSSVSDLPKacR公司). 显示了加权回归线和计算的定量限（另请参见补充表S3)在不同基质中，YAP和LVS肽的加权线性回归斜率分别为1.03和1.03，0.99和1.00。C类，显示了六种靶向乙酰赖氨酸肽在复合基质中每个浓度点（0.037–25 fmol）的三个重复的峰面积CV，显示了20%和30%的CV截止值（另见补充图S6，C类和F类).D类高通量分析显示，在复杂的线粒体裂解物背景矩阵中，27个独立获得的序列中有366个肽的峰面积CV。针对MS1过滤前体显示峰面积CV米/z.

为了证明Skyline MS1过滤也与从其他仪器类型和供应商处获得的数据兼容，在高分辨率LTQ FT-ICR质谱仪（Thermo）上生成并获得了单独的标准浓度曲线，一式三份。生成了四种消化标准蛋白的13个系列稀释液，并将其加入胰蛋白酶消化液中秀丽隐杆线虫裂解物。与之前一样，得到的响应曲线显示出良好的线性响应（所有加权线性回归的斜率如所示补充图S8和补充附录A）。除了AB SCIEX和Thermo仪器外，Skyline MS1过滤还能够从Waters和Agilent平台导入和分析原始数据（未显示数据）。

线粒体丙酮酸脱氢酶磷酸化位点的定量

为了测试MS1过滤在更具挑战性的基质和工作流程中量化生物相关PTM的能力，我们对小鼠肝组织进行了激酶抑制剂研究，并评估了丙酮酸脱氢酶E1α亚基（PDHE1α）磷酸化状态的变化。通过梯度纯化分离小鼠肝线粒体，并用丙酮酸类似物DCA处理，该类似物可导致丙酮酸脱氢酶激酶的特异性抑制和PDHE1α三个调节位点（Ser（P）-232、Ser（P）-293和Ser（P.）-300）的磷酸化丢失(33). 在DCA时间过程之后，等量的线粒体被消化，磷酸肽被TiO选择性富集2色谱法，以及等量的两种重标记(13C类615N个4-添加包含Ser（P）-293或Ser（P）-300的精氨酸胰蛋白酶磷酸肽。然后通过LC-MS/MS在每个时间点一式三份分析磷酸肽，使我们能够通过MS/MS确认与PDHE1α上的三个已知磷酸化位点相对应的几种内源性磷酸肽(补充图S9). MS1过滤结果显示，在前10分钟内，含有Ser（P）-293和Ser（P）-300的二磷酸肽立即减少，随后下降到检测以下30分钟(图5A类). 有趣的是，我们能够监测对应于Ser（P）-293或Ser（P）-300的共洗脱单磷酸肽丰度的初始增加(图5B类)我们将其归因于相应的二磷酸肽的快速去磷酸化。然而，正如预期的那样，DCA处理30分钟后，单核苷酸丰度显著降低。除了上述完全基于MS1过滤前体峰面积的定量外，我们还能够将内源性磷酸化肽标准化为其相应的重肽类似物，并获得几乎相同的结果(补充图S10). 含有Ser（P）-232的磷酸肽最初保持不变，30分钟后下降(图5C类). 为了证明这些结果是PDHE1α特异性的，在DCA时间过程中，通过MS1过滤监测了另外24个预计不受抑制剂治疗影响的磷酸肽，其中88%的磷酸肽显示CV低于30%(补充图S11). Western blot显示PDHE1α总蛋白水平无变化，磷酸化位点特异性抗体结果与MS1过滤所得结果一致(图5D类).

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DCA抑制激酶后，PDHE1α中Ser-293、Ser-300和Ser-232磷酸化的时间进程发生变化。 A类，二磷酸YHGH三次重复注射的相对定量pS公司293MSDPGV公司pS公司300YR，前体离子M在米/z876.8155.B类，相应磷酸肽的相对定量，YHGHpS公司293MSDPGVSYR和/或YHGHSMSDPGVpS公司300YR，前体离子M在米/z836.8323.C类，磷酸肽YGMGTpS公司232提取前体离子M的VER米/z540.2150.D类用磷酸化位点特异性抗体和总蛋白抗体对DCA治疗的PDHE1α磷酸化进行独立的Western blot分析。

乳腺癌细胞系条件培养基中磷酸肽的定量

为了增加待检测的肽靶的数量，我们使用MS1过滤来量化来自几种乳腺肿瘤亚型的细胞系分泌体之间蛋白质磷酸化的相对差异。具有转移潜能的癌细胞向细胞外微环境分泌蛋白质，改变细胞粘附、细胞间通讯、运动和侵袭性(34). 其中一些蛋白质有可能到达血流并成为适合早期无创诊断的生物标记物。为了确定这些分泌蛋白的变化，我们分析了从10个乳腺癌细胞系的条件培养基（CM）中获得的磷蛋白（5个管腔和5个基底，包括4个基底B，后者对应于三阴性肿瘤类型），这些细胞系反映了原发性乳腺癌亚型的分子特征(35). 将这些癌细胞分泌到CM中的蛋白质浓缩，用胰蛋白酶消化，并用TiO富集磷酸肽2样品分馏后的亲水作用液相色谱法。然后通过LC-MS/MS在两个生物和技术复制品中分析富集的磷酸肽组分(图6A类). 接下来，使用MS1过滤来评估来自两种肿瘤亚型分泌的蛋白质的磷酸肽丰度的差异。波形蛋白，一种已知的基底型肿瘤特异性间充质标志物，与不良病理参数相关(36)产生磷酸肽ETNLDpS公司430LPLVDTHSKR公司440其丰度在三种不同的基底细胞系中显著增加，但在管腔细胞系中未检测到(图6,B类和C类). Ser-430的磷酸化先前与中间丝组装的调节有关(37)因为波形蛋白被认为是肿瘤细胞获得间充质表型的特异性标记物(38)测定波形蛋白中的相关磷酸肽可能会增加该标记的敏感性。此外，MS1过滤结果显示，上皮细胞标记细胞角蛋白18的管腔细胞系CM中Ser-7的磷酸化增加(39,40)(补充图S12，A类和E类). 然而，来自肿瘤蛋白D54的磷酸肽(41)另外两种与癌症相关的蛋白calnexin在碱性细胞系中的浓度高出约3倍(补充图S12，F类和G公司和表S4).

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亚型特异性乳腺癌细胞系条件培养基中磷酸肽的相对定量。 A类，从CM富集磷酸肽的工作流程，包括在TiO2之前的亲水相互作用液相色谱分离步骤2磷酸肽富集和随后的LC-MS/MS分析。B类，磷酸肽的Skyline峰面积复制视图，ETNLDpS公司LPLVDTHSKR，来源于波形蛋白，由前体离子M在米/z635.642. 监测来自五个管腔癌细胞系、一个基底A癌细胞系和四个基底B癌细胞系（每个细胞系两个生物复制品和两个注射复制品）的CM峰值，测得的峰面积平均值分别为126、33和8538。这个星号在单个重复中，表示MS/MS的取样和磷酸肽的鉴定。C类，根据乳腺癌亚型聚类的MS1过滤峰面积图蓝色对于灯具，棕色的对于基础A，以及绿色对于基础B CM样本（每个细胞系两个生物复制和两个采集复制保持相同的符号）。

SIRT3基因敲除动物骨骼肌线粒体裂解物乙酰化位点的鉴定和定量

蛋白质脱乙酰酶SIRT3缺乏的小鼠表现出多种线粒体蛋白质的超乙酰化(42). 最近，这种线粒体sirtuin参与调节许多线粒体蛋白的酶活性，包括异柠檬酸脱氢酶（IDHP）、琥珀酸脱氢酶亚基a（DHSA）和应激70蛋白（Grp75）(43–45)以及与包括糖尿病在内的各种代谢性疾病有关。为了评估MS1过滤在复杂组织背景中识别PTM变化的效用，我们监测了从分离的线粒体中获得的一组蛋白质中多个位点的赖氨酸乙酰化变化。四种野生型（WT）和四种SIRT3的骨骼肌线粒体−/−通过差速离心和梯度纯化富集（KO）小鼠。我们利用两种抗乙酰赖氨酸抗体的组合开发了一个强大的流程，用于从线粒体中免疫富集乙酰化肽(图7A类). 用HPLC-MS/MS对等量的乙酰赖氨酸肽进行了重复分析。从该数据集中，我们能够识别Grp75中的2个乙酰化位点，DHSA中的3个乙酰化部位，IDHP中的16个乙酰化位置(补充表S5). 随后，我们在Skyline中为胰蛋白酶乙酰化肽生成了一个光谱库，并通过MS1过滤所有样本分析了每个已识别乙酰化肽的相对肽丰度。使用这种方法，在所有三种蛋白质中测量来自骨骼肌的每个乙酰赖氨酸肽的相对比率（KO:WT）(图7B类). SIRT3对IDHP的调节在限制热量摄入期间在小鼠氧化应激介导的听力损失中发挥作用(45)没有确定具体的监管场所。与WT相比，我们测量到骨骼肌SIRT3 KO小鼠中IDHP的Lys-45、Lys-272和Lys-299乙酰化显著增加2倍以上(图7B类). 此外，DHSA和Grp75分别在Lys-179和Lys-288有一个乙酰化显著增加的位点(图7B类). 值得注意的是，对于每个蛋白质，都观察到一些乙酰化位点，但WT和KO之间没有显著变化，这表明并非所有位点都是SIRT3的潜在底物。总的来说，这些结果表明，MS1过滤能够量化赖氨酸乙酰化在一系列复杂的组织分离和富集步骤之后的变化。在这种情况下，我们发现SIRT3的缺失导致一些线粒体蛋白质乙酰化增加，并指示酶调节的潜在位点体内.

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监测SIRT3 KO小鼠线粒体蛋白的乙酰化情况。 A类，WT和SIRT3 KO动物骨骼肌线粒体乙酰肽富集的工作流程示意图，包括Lys-乙酰肽的抗乙酰赖氨酸富集，两个注射复制品的LC-MS/MS，以及在Skyline中生成用于MS1过滤和相对定量的光谱库。B类，四只WT和四只SIRT3 KO小鼠骨骼肌样品中三种蛋白质不同部位的单个胰蛋白酶乙酰赖氨酸肽的峰面积强度比（KO:WT）。#表示重要性：第页<0.05（双尾学生）吨测试；n个WT和SIRT3为4−/−（KO），每个样品两次注射重复。

讨论

这些研究中描述的无标签肽定量实验利用了Skyline中现有的和扩展的靶向蛋白质组学工具，这些工具集成到了一个新的工作流MS1过滤中。Skyline MS1过滤被证明能够支持将MS1全扫描光谱中的离子色谱图大规模提取到已建立的Skyline用户界面中，并在各种蛋白质组工作流程中量化多肽(补充图S13). 图形界面工具允许通过与底层MS/MS标识的直接链接轻松检查数据，允许准确处理数据并在必要时进行更正。此外，实验具有高度的可扩展性；在本研究中，我们使用MS1过滤对数百个线粒体肽的PDHE1α靶向分析中的三个磷酸位点进行量化，以评估再现性。目前，作为大规模研究的一部分，我们正在使用MS1过滤检测数千肽，以评估PTM网络的变化。三最后，这种无标签方法非常可靠，支持以平台依赖的方式直接导入原始数据文件，鉴于正在进行的大量多中心临床研究，蛋白质组学界越来越需要这些功能(30). 值得注意的是，MS1过滤是在Skyline开源环境中构建的(18,20)自发布以来，它已经记录了7000多次下载，超过350名注册用户。Skyline MS1过滤设计为可以根据需要添加和使用其他软件模块。例如，作为国家癌症研究所癌症临床蛋白质组技术评估联盟的一部分开发的项目，如“保留时间查看器”(http://www.gibsonproteomics.org/resources/rt-viewer)和其他工具可以轻松处理来自Skyline可编辑数据报告格式的数据。我们完全预计，一旦用户熟悉其整体结构和实用性，Skyline MS1过滤也将随着额外工具功能的加入而发生进一步的变化，如色谱比对算法，以增强峰值拾取。

MS1滤波的定量特征在几个实验设计中得到了验证。使用TripleTOF 5600质谱仪（AB SCIEX）获取掺入复杂线粒体裂解物基质的稳定同位素标记的乙酰赖氨酸肽的响应曲线，以及掺入秀丽线虫使用LTQ FT-ICR质谱仪（Thermo）裂解产物。在这两种情况下，都获得了几个数量级的线性响应(即复杂矩阵中的三重TOF 5600回归斜率=0.93–1.03），LOD和LOQ在低匹配范围内，CV通常低于20%。为了在更具挑战性的环境中检验这种无标签方法的稳健性，在这种环境中，生物意义将被严格检查，我们在几个基于亲和力的工作流中测试了这种方法。在最简单的情况下，PDHE1α的磷酸化位点变化在DCA抑制剂治疗和磷酸肽特异性富集后在时间过程实验中进行量化，并通过Western分析进行独立验证。作为正在进行的癌症生物标记物研究的一部分，我们进行了更严格的实验设计，描述了几种蛋白质的磷酸化位点定量，例如乳腺癌细胞系条件培养基中的波形蛋白和角蛋白I型细胞骨架18。对色氨酸磷酸肽进行亲和力富集，并在10个细胞系中进行比较，得出几个具有统计学意义的差异。最后，利用乙酰赖氨酸肽的抗体亲和富集法研究了SIRT3 KO和WT小鼠线粒体蛋白水解物的乙酰组。此前，我们曾尝试进行等压标记方法，但发现使用两种不同的商业抗体会降低免疫沉淀的效率。在这里，我们通过对几个关键线粒体酶中的一组乙酰化位点的分析，成功地使用MS1过滤法分析了这些复杂混合物，其中IDHP和DHSA已知受SIRT3调节，而Grp75以前没有被SIRT3调控的报道。此外，我们不仅确定了乙酰化位点，而且首次证明了这些位点如何随着SIRT3活性的丧失而发生定量变化。综上所述，这些实验表明，Skyline MS1过滤能够量化多肽分析物中的变化，从而增加样品和工作流程的复杂性。此外，我们在MS1离子强度数据的采样中证明了高度的线性和再现性，即使在多个样本比较的条件下也是如此。

MS1过滤的一个特别重要的用途是为发展MRM-MS分析提供多肽的初始大规模定量分析。Skyline本身最初是为了后一个目的而开发的，因此，在这些分析实验中获得的肽靶和相关的MS/MS光谱库可以无缝地转移，用于开发MRM-MS验证类型研究。事实上，对于本文所述的小鼠乙酰基组和癌症生物标记物条件培养基研究，MS1过滤数据为MRM-MS候选者选择提供了理论基础，以分别询问SIRT3底物中的组织特异性变化，并确定用于乳腺癌血浆分析的新生物标记物。

致谢

我们感谢Christie Hunter博士（AB SCIEX）、Sean Seymour博士（AB-SCIEX）、D.R.Mani博士（麻省理工学院和哈佛大学博德学院）、James Murray博士（Abcam）和John Cottrell博士（矩阵科学）提供的宝贵帮助和建议，以及Christopher Benz博士（巴克学院）提供的乳腺癌细胞系。

脚注

*这项工作得到了美国国立卫生研究院PL1 AG032118（给B.W.G.）、R24 DK085610（给E.V.）、T32AG000266（给M.J.R.）、R1 RR032708（给M.J.M.）和P41 RR011823（给M.J M.）以及美国国立癌症研究院U24 CA126477（给B.W.G.，分包给UCSF）的支持，这是国家癌症研究所癌症临床蛋白质组技术倡议的一部分。这项工作也得到了NCRR共享仪器拨款S10 RR024615（给B.W.G.）和AB SCIEX在巴克研究所评估TripleTOF 5600的资金的部分支持。这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅用于表明这一事实。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充材料.

2M.J.Rardin和B.W.Gibson，未发表的结果。

三M.J.Rardin和B.W.Gibson，未发表数据。

1使用的缩写如下：

SILAC公司
细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
iTRAQ公司
相对和绝对定量的等压标签
质谱/质谱
串联质谱法
MS1号机组
全扫描质谱
PTM公司
翻译后修改
物料需求管理
多元反应监测
DCA公司
二氯乙酸
LOD（检测限）
检测极限
现场质量
定量限
个人简历
变异系数
厘米
条件培养基
SIRT3号机组
西尔图因3
IDHP公司
异柠檬酸脱氢酶
DHSA公司
琥珀酸脱氢酶亚基A
重量
野生型
击倒对手
淘汰赛。

作者贡献

B.S.、M.J.R.、A.M.Z.和B.W.G.设计研究并撰写手稿；M.J.R.、A.M.Z.、B.S.和M.S.B.进行了实验；B.S.和M.J.R.获得了QSTAR Elite和TripleTOF 5600的质谱数据；B.S.、M.J.R.和A.M.Z.分析并解释了数据；B.X.M.和M.J.M.设计并开发了Skyline软件，并编辑了手稿；B.S.和M.J.R.协助Skyline MS1过滤的功能开发；B.E.F.提供的Skyline光谱库实现；C.C.W.协助Skyline开发；M.P.C.提供统计分析，并编写自定义图形绘图软件；D.J.S.协助数据分析；M.S.B.绘制了LTQ FT-ICR浓度曲线并获得了FT-ICR质谱数据；E.J和C.R.K.提供了骨骼肌样本；C.R.K.和E.V.协助设计了乙酰组研究。

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文章来自分子和细胞蛋白质组学：MCP由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会