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基因开发。2012年7月15日；26(14): 1527–1532.
数字对象标识：10.1101/编号190157.112
预防性维修识别码：项目经理3404381
PMID：22802527

通过轴突mTOR信号和4E-BP翻译阻遏物控制神经元中的病毒潜伏期

小林真里子,1 安格斯·C·威尔逊,1,2 摩西五世·赵,三，4,5,6,7和伊恩·莫尔1,2,8
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

病毒基因组可以从潜伏期中重新融合，引发生产性感染或重新激活。目前尚不清楚存在于神经元细胞核中的潜在HSV基因组是如何受到外围信号的调节的。在莫尔及其同事的这项研究中，作者证明，轴突中的局部mTOR信号控制着多种生理输入，这些生理输入可以整合起来调节病毒裂解/潜伏开关。此外，作者表明，在这一过程中，翻译阻遏物4E-BP是mTOR信号传导的重要靶点。因此，这项研究促进了我们对轴突如何响应环境信号和控制细胞体内HSV1基因组的理解，并为mTOR信号如何控制神经元细胞核中潜伏病毒基因组的表达提供了新的见解。

关键词：eIF4E结合蛋白4E-BP1、局部翻译控制、mTOR信号、神经元、病毒潜伏期

摘要

外周神经神经节中的潜在单纯疱疹病毒-1（HSV1）基因组周期性重新激活，启动生产性复制所需的基因表达程序。轴突检测到的分子线索是否可以传递到细胞体并用于调节神经元细胞核中潜在的基因组表达尚不清楚。使用神经元培养模型，我们发现抑制mTOR、耗尽其调节亚单位猛禽或诱导缺氧都会触发再激活。虽然持续的mTORC1激活抑制了再激活，但突变的4E-BP（eIF4E-结合蛋白）翻译阻遏物对mTORC1-刺激的再激活无反应。最后，抑制轴突中的mTOR可诱导再激活。因此，控制翻译的轴突mTOR信号的局部变化在空间分隔的隔室中调节潜在的HSV1基因组。

关键词：eIF4E结合蛋白4E-BP1，局部翻译控制，mTOR信号传导，神经元，病毒潜伏时间

对宿主神经元中的生理线索作出反应并在潜伏期和高效病毒复制这两个不同的发育程序之间切换的能力是单纯疱疹病毒（HSV）生物学和发病机制的一个决定性特征(Roizman等人，2007年). 潜伏期内，病毒基因组在神经元核内保持为上位体，病毒复制所需的基因表观遗传沉默(刀和悬崖2008;Bloom等人，2010年). 因此，病毒蛋白未被检测到，生产性复制被抑制。作为对不完全理解的生理线索或免疫状态变化的反应，病毒从潜伏期中出现或“重新激活”，启动复杂的基因表达程序，导致病毒复制，最终导致感染性病毒的产生(刀和悬崖2008). 利用小动物模型进行的研究有助于确定与再激活有关的病毒基因产物以及宿主先天和后天免疫系统在控制潜伏期中的作用(Wagner和Bloom 1997年;坎宁安等人，2006年;Knickelbein等人，2008年;汤普森等人，2009年). 20世纪初，人们首次假设该病毒定植于外周神经元，并建立终身潜伏感染，能够引发复发性疾病(库欣1905;Goodpasture 1929年)特别是在宿主神经元内调节HSV潜伏期的分子信号，如何在不同的环境刺激下触发再激活，以及如何从外围发生信号传递以抑制隐藏在神经元细胞核中的潜在基因组，这些问题仍然是个谜。

最近，由神经生长因子（NGF）与TrkA受体酪氨酸激酶（RTK）结合介导的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）/Akt信号传导被证明是维持潜伏期和抑制HSV产生（裂解）所必需的在一个原代神经元细胞培养模型系统中生长，该系统忠实地显示了动物模型中定义的潜伏期的关键特征(Camarena等人，2010年;Kim等人，2012年;小林等，2012年). 即使这种信号级联的短暂中断也足以促进潜伏期的再激活，这表明神经元PI3-K/Akt信号靶点可能是调节潜伏期和再激活的细胞效应器。在这里，我们确定轴突中的局部mTOR信号是潜在的分子机制，在此基础上，各种生理输入可以被整合以调节神经元中HSV裂解-潜在的发育决定。我们还表明，翻译阻遏物4E-BP是调节潜伏期的mTORC1信号的关键靶点。这是首次证明mTOR信号定位于轴突，随后通过4E-BP的翻译调控控制神经元核内潜伏病毒基因组的表达。此外，它提供了一个新的框架来理解物理和代谢应激如何通过mTOR在神经元自主水平上中断HSV潜伏期。

结果和讨论

细胞mTORC1激酶是PI3-K/Akt通路的关键靶点，在神经元功能中发挥重要作用，包括控制突触可塑性、长时程增强（LTP）、轴突生长和再生(威利斯和特维斯2006;林和霍尔特2008;Richter and Klann 2009年). 这些过程需要蛋白质合成，这可能由mTORC1底物p70 S6K和eIF4E结合蛋白（4E-BP）调节(Ma和Blenis 2009).

为了确定mTOR信号是否调节再激活，用活性位点mTOR抑制剂PP242、雷帕霉素或DMSO载体对潜伏感染HSV1-EGFP报告子的培养大鼠交感神经元进行脉冲处理。在应用激活刺激之前，在潜在感染的培养物中未检测到感染病毒的产生和EGFP的表达(Camarena等人，2010年;小林等，2012年). 虽然雷帕霉素对mTORC1具有选择性，但PP242同时抑制含有mTOR的复合物mTORC1和mTORC2，后者激活Akt(Feldman等人，2009年). 在这些条件下，用PP242或雷帕霉素处理潜伏感染的培养物可以通过mTORC1介导的磷酸化阻止4E-BP翻译阻遏物的失活(图1A、B)并刺激病毒ICP27 mRNA的积累，该mRNA编码一种必需的裂解激活物，远高于DMSO对照处理培养物中检测到的水平(图1C). 为了通过EGFP报告基因的表达或感染病毒的产生来评估重新激活，应用雷帕霉素或PP242 20小时，然后去除。用任一化合物抑制EGFP检测和生产性病毒复制所需的蛋白质合成进行稳定处理（补充图S1）。虽然只有背景自发激活水平，但EGFP检测证明了这一点(图1D)和传染性病毒的产生(图1E)在二甲基亚砜对照处理的培养物中观察到，短暂的PP242或雷帕霉素暴露可有效诱导再激活。

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干扰神经元中的mTOR信号可诱导潜在HSV1的重新激活。(A类)神经营养因子和RTK介导的PI3-K/Akt信号传导激活mTORC1控制翻译阻遏物4E-BP。雷帕霉素、PP242和猛禽shRNA独立地抑制mTORC1，通过过度磷酸化阻止翻译抑制因子4E-BP1的失活，并抑制cap依赖性mRNA的翻译。(B类)用雷帕霉素（rapa；100 nM）或PP242（2.5μM）处理20 h后，用SDS-PAGE在17.5%凝胶中分离出潜伏感染神经元的总蛋白，并用免疫印迹法进行分析。慢速超磷酸化(顶部箭头）和快速迁移的次磷酸化(底部箭头）4E-BP1表格显示在左边.Tubulin免疫印迹提供负载控制。(C类)mTOR药物抑制剂诱导HSV1再激活。用PP242或rapa处理潜伏感染的神经元20 h，用定量RT-PCR（qRT-PCR）测定病毒ICP27 mRNA水平。(D类)如中所示C类除20h外，将培养基取出，立即用缺乏抑制剂的新鲜培养基替换。晚期病毒裂解Us11-EGFP融合蛋白表达产生的EGFP阳性孔在5天内被定量。通常，根据EGFP表达评估，10%-20%的感染培养物会自动重新激活。每个数据点代表96 well板块的20个单井。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。(E类)5天后通过菌斑试验评估感染性病毒的产生。条形图显示了20个孔的平均菌斑形成单位（PFU）数量。(F类)如前所述，在阿昔洛韦（ACV）存在的情况下，建立了潜伏感染EGFP表达的HSV1的培养物，并转导表达靶向mTORC1特异性亚单位猛禽或NS对照的shRNA慢病毒(Camarena等人，2010年;小林等，2012年). 6天后，取出ACV，20小时后，分离总RNA。用qRT-PCR定量编码裂解HSV调节因子ICP27的mRNA丰度，并将其归一化为NS对照shRNA转导培养物中检测到的水平。误差条表示SEM(插入)5天后，用免疫印迹法分析转导shRNA-表达慢病毒神经元的总蛋白。

利用RNAi进一步研究了mTORC1信号对潜伏期的控制，以耗尽猛禽，猛禽是一种负责复杂组装和底物选择性的mTORC1-特异性调节亚单位(Sengupta等人，2010年). 表达对照、非沉默（NS）shRNA或raptor-specific shRNA的慢病毒(Thoreen等人，2009年)被送入潜伏感染的神经元。猛禽shRNA有效地耗尽了内源性猛禽，与NS对照相比，抑制了mTORC1底物4E-BP1的磷酸化，并诱导了关键的HSV1裂解调节因子ICP27的表达，这表明猛禽的再激活(图1F). 总之，使用三种独立方法对抗mTORC1的实验结果表明，需要持续的mTORC2活性来抑制神经元的溶解复制并维持HSV1潜伏期。

mTORC1的激活也由小GTPase rheb（脑中富含ras同源物）控制(Sengupta等人，2010年). 为了确定持续的mTORC1激活是否必要且足以维持潜伏期，使用强力霉素（doxycycline，dox）诱导的慢病毒在潜在感染的神经元中表达表位标记的突变rheb蛋白（Q64L）。Q64L rheb降低了GTPase活性(Li等人，2004年;Long等人，2005年)并在dox诱导表达时作为构成性mTORC1激活剂发挥作用(图2A、B). 用PI3-K抑制剂LY294002治疗后评估再激活(图2C); Akt抑制剂VIII（Akt VIII）(图2D)，一种有效的变构抑制剂，可抑制Akt上的调节性磷酸化标记(Calleja等人，2009年); 或mTORC1选择性抑制剂雷帕霉素±dox。在LY294002或Akt VIII处理的培养物中未检测到Akt S473磷酸化，验证了这些抑制剂的功效。此外，诱导rhebQ64L刺激4E-BP1过度磷酸化(图2B，参见泳道2和3，泳道5和6），证实了rheb介导的mTORC1活化而没有可检测的Akt活化。值得注意的是，rhebQ64L诱导抑制了LY294002诱导的再激活(图2C)或AKT VIII(图2D)，确定需要持续的mTORC1激活来维持延迟。相反，在dox诱导HA-rhebQ64L后，雷帕霉素处理的培养物中4E-BP1仍以低磷酸化为主(图2B（参见第8和第9车道），与雷帕霉素在rheb下游的作用一致。重要的是，rhebQ64L诱导并没有检测到阻止雷帕霉素诱导的再激活(图2E). 这表明，持续的mTORC1信号是神经元稳态的关键NGF反应调节器，对于维持培养神经元中HSV1潜伏期是必要的，也是足够的。

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rheb介导的mTORC1持续激活足以维持潜伏期并防止诱导性再激活。(A类)NGF介导的TrkA/PI3-K/AKT通路激活诱导的mTORC1信号转导图。NGF的受体RTK是TrkA。结节性硬化综合征；（Rheb）以GDP和GTP约束形式描述的Rheb。化学抑制剂或突变蛋白（rhebQ64L）在正确的（灰色）。(B–E类)用一种慢病毒转导潜伏感染的神经元，慢病毒编码由dox诱导的启动子表达的HA标记的rheb（Q64L）。20小时后，取出ACV，用含有3μM dox的培养基替换。48小时后，用抑制剂（10μM LY294002、5μM AKT VIII或100 nM雷帕霉素）处理培养物。(B类)添加抑制剂24小时后分离总蛋白，通过SDS-PAGE分级，并通过免疫印迹分析。总AKT和微管蛋白免疫印迹是负荷控制。pAKT是一种磷酸特异性Akt S473抗体。请注意，每个药物治疗小组代表一个独立的免疫印迹实验。因此，无法比较LY294002-、AKT VIII-和雷帕霉素处理的培养物之间HA-Rheb表达的相对水平。(C–E类)在添加抑制剂后20 h收集总RNA，并通过qRT-PCR测定编码HSV必需裂解激活物ICP27的mRNA丰度。误差条表示SEM。

去除NGF可刺激动物模型、移植神经节和培养神经元中HSV1的重新激活（Wilcox和Johnson 1987；Hill等人，1997年;Du等人，2011年). 神经营养素信号传导对靶神经元的许多影响都需要蛋白质合成，包括NGF戒断导致的细胞死亡(Martin等人，1988年,1992;富兰克林和约翰逊1998). 由于蛋白质合成的短暂（3小时）抑制诱导了再激活，因此还需要持续的蛋白质合成来维持潜伏期（补充图S2；Wilcox等人，1990年). 值得注意的是，通过mTORC1的PI3-K信号是细胞蛋白质合成的生理调节器(图2A;Ma和Blenis 2009;森古普塔等人，2010年). 为了确定通过mTORC1调节蛋白质合成的环境信号是否影响HSV1裂解-潜伏决定，将潜伏感染的培养物维持在常氧（20%O2)或缺氧（1%O2). 与抑制几乎所有蛋白质合成的嘌呤霉素或环己酰亚胺不同（补充图S2），缺氧通过阻止mTORC1介导的4E-BP翻译阻遏物的过度磷酸化选择性抑制cap依赖的mRNA翻译(Brugarolas等人，2004年; Connolly等人，2006年）。重要的是，缺氧几乎与正常氧培养中的嘌呤霉素脉冲一样有效地刺激再激活(图3A-C). 这意味着缺氧通过抑制mTORC1刺激的cap-dependent mRNA翻译来诱导再激活。

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低氧应激和帽依赖性信使核糖核酸翻译的抑制触发诱导型再激活。(A类,B类)通过缺氧抑制潜伏感染神经元的蛋白质合成。在1%O中69小时后2，培养物代谢标记为35S氨基酸在1%O中放置3小时2.对照培养物持续保持在正常氧（～20%O）下2)平行标记。缺氧总蛋白（1%O2)分离、SDS-PAGE分馏和放射自显影分析正常毒性培养物(A类)，并通过液体闪烁计数定量酸不溶放射性的相对量(B类). 普雷霉素（puro）处理常氧培养物3 h，为抑制蛋白质合成提供了阳性对照。(C类)在缺氧72小时后，将EGFP阳性、重新激活的孔的百分比与常氧培养物进行比较。Puro处理常氧培养物3小时，为诱导性再激活提供了阳性对照。

两种mTORC1底物p70 S6激酶（p70 S6K）和4E-BP1具有控制蛋白质合成的独立作用。p70 S6K被mTORC1磷酸化后激活，4E-BP1被抑制。除了磷酸化核糖体蛋白S6外，p70 S6K通过灭活eEF2激酶刺激翻译延长，并通过灭活eIF4A抑制剂PDCD4促进启动。或者，4E-BP1通过与cap-binding起始因子eIF4E结合并抑制40S核糖体向mRNA的募集来选择性抑制cap依赖性翻译(Ma和Blenis 2009). 通过mTORC1在T37/46上磷酸化4E-BP可使4E-BP失活（Gingras等人，1999年）。为了防止4E-BP失活，与表达野生型4E-BP1对照物的培养物相比，使用dox诱导慢病毒和再激活±dox将表位标记的T37A/T46A 4E-BPl双突变体（AA）引入潜伏感染神经元(图4A). 虽然野生型4E-BP诱导仅轻微影响蛋白质合成，未检测到诱导活化，但AA 4E-BP表达抑制翻译约40%，在诱导活化方面与雷帕霉素一样有效(图4B、C). 这不仅证明了组成性活性4E-BP翻译阻遏物可诱导再激活，还首次表明单个细胞基因的有条件表达可改变病毒的潜伏状态并触发再激活。这种效应对mTORC1底物4E-BP1是选择性的，因为S6K1缺失没有检测到诱导活化(图4D). 尽管S6K1底物可以控制翻译，但许多，如eEF2激酶、eIF4B和rps6，也被S6K2和p90 RSK磷酸化，允许S6K1耗竭被耐受(Ma和Blenis 2009;Magnuson等人，2012年)因此，S6K1缺失并未明显抑制神经元中的整体蛋白质合成（补充图S3）。

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组成活性4E-BP1阻遏物的诱导表达促进再激活。(A类)4E-BP1（AA）突变体对mTORC1介导的负调控无反应，并构成隔离eIF4E（4E），抑制cap依赖性mRNA翻译。（米7)米7GTP帽位于mRNA 5′端。用编码HA标记的4E-BP1野生型（WT）、AA或空载体的dox-inducible慢病毒转导潜伏感染神经元。在dox诱导后，通过免疫印迹分析总蛋白，如图2B。位于左边表示迁移较慢（HA）标记的4E-BP1；内源性4E-BP1迁移更快。(B类)从代谢标记为35S氨基酸持续3 h，并测定与空载体对照相比的放射性相对水平。(C类)dox诱导72h后收集RNA；用qRT-PCR定量ICP27 mRNA水平，并将其归一化为用空载体对照转导的培养物。雷帕霉素（100 nM）和二甲基亚砜处理的培养物没有用慢病毒转导，分别用作±再激活对照。误差条表示SEM(D类)如前所述，在ACV存在的情况下建立了潜伏感染表达EGFP的HSV1的培养物，并用表达耗尽p70 S6K1或NS shRNA对照的shRNA的两种慢病毒之一（22904和3159）转导(Camarena等人，2010年;小林等，2012年). 6天后，去除ACV，20小时后，分离总RNA。通过qRT-PCR定量ICP27 mRNA水平，如C类. (插入)神经元裂解物的免疫印迹验证S6K1沉默。Tubulin是一种负载控制。雷帕霉素作为阳性对照。

为了从mTORC1等RTK介体长距离传递信号，将轴突末端与神经元细胞体分开，NGF等神经营养因子使用轴突转运机制(赵2003). 局部神经营养素信号刺激离散亚细胞隔室中预先存在的mRNA的翻译。局部翻译允许快速反应，并在调节神经元稳态方面发挥关键作用(威利斯和特维斯2006;林和霍尔特2008;Richter and Klann 2009年). 此外，轴突局部产生的蛋白质的后续信号传递或运输可能影响神经元其他部位的过程，包括细胞核(Cox等人，2008年). 已确定潜伏HSV1可对mTORC1的普遍抑制产生反应(图1)，我们问潜伏病毒是否能感应到神经元信号的局部而非全局中断。为了研究空间特异性参数是否可以控制神经元中的HSV潜伏期，使用一个分区培养系统将轴突与其细胞体物理分离(Zheng等人2001;Cox等人，2008年). 通过将轴突与离散室中的细胞体隔离，每个室都可以独立操作。在Boyden室细胞培养插入物中，将神经元置于半多孔膜上，并浸没在含有medim+NGF的微孔中(Jeanneteau等人，2010年). 由此产生的NGF梯度允许轴突穿过孔并沿着膜底生长，从而建立了较低的“仅轴突”隔间(图5A)在分区培养中建立潜在HSV1感染后，将PP242应用于细胞体和/或轴突室30分钟。随后从两个室中取出培养基，并立即用缺乏抑制剂的新鲜培养基替换。当仅添加到轴突室时，PP242有效地抑制了分离轴突中4E-BP1的过度磷酸化，但未检测到抑制细胞体室中mTORC1介导的4E-BPl磷酸化(图5B). 相反，将PP242添加到顶室和底室中有效地抑制了顶室中神经元的4E-BP1磷酸化(图5B). 值得注意的是，轴突PP242的应用在刺激再激活方面与mTORC1信号的整体抑制一样有效(图5C、D). 虽然博伊登室允许采集轴突用于生化分析，但染色体和轴突室之间的隔离可能不是绝对的。为了实现更严格的轴突与躯体的流体隔离，实验使用微流控室重复进行，在微流控室内，静水压力阻止轴突从一个隔室扩散到另一个隔室内(Taylor等人，2005年). 再次，轴突室中的PP242脉冲有效地诱导了隔离在孤立体室中的潜在基因组的重新激活(图5D–F). 总之，这表明神经元胞体中潜伏的HSV基因组可以对轴突中mTOR信号的局部变化作出反应。

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抑制轴突mTOR信号可触发隔离在神经元细胞体中的潜在基因组的重新激活。(A类)使用Boyden室插件创建“仅轴突”隔间。神经元被镀在顶部有1μm孔隙的膜上。底部腔室中的高NGF会导致轴突通过孔生长到下腔室，形成一个仅限于轴突的一侧。细胞体太大，无法通过毛孔。(B类)用免疫印迹法分析顶部和轴突区（±PP242）的裂解物。(C类)描述在DMSO或2.5μM PP242处理顶部腔室与仅轴突腔室后EGFP阳性孔百分比的再激活分析。该图表示对三个独立实验的集体分析，每个实验点都来自八个博伊登腔。误差条表示SEM(插入)通过顶部腔室中细胞体的荧光成像检测到激活的神经元。(D类)用于分离染色体和轴突室的微流体装置示意图。神经元被画成绿色。相位和免疫荧光（Tau）图像显示轴突穿过分隔两个隔室的微槽。棒材，40μm。(E类)显示了对2.5μM PP242处理（±）1小时的体细胞与轴突细胞的EGFP阳性、再激活微流控室的比例。(*)P（P）≤ 0.0039.

神经元mTORC1活性的局部变化可以调节mRNA翻译、轴突损伤后生长锥的形成、轴突导向、LTP和钙信号(威利斯和特维斯2006;林和霍尔特2008;Richter and Klann 2009年).在这里，我们确定mTORC1调节神经营养性疱疹病毒HSV1的裂解/潜伏开关，并表明细胞核内的潜伏基因组响应轴突线索而重新激活，这为轴突可以监测环境信号以控制细胞体内被抑制基因组的表达谱提供了直接的实验证据。因此，轴突mTOR信号通路提供了一种有吸引力的分子机制，可以解释支配上皮的神经末梢如何检测到直接控制远处潜伏期和再激活的刺激；即位于三叉神经节的神经元核内。

mTORC1作为采集基本体内平衡指标的中心节点，包括生长因子、氨基酸、葡萄糖、能量和氧气的可用性以及DNA损伤的存在，是控制病毒生命周期的理想选择。为了响应这些不同的输入，mTORC1协调并促进调节自噬、细胞生长、翻译、代谢和线粒体功能的离散生理输出(Sengupta等人，2010年). 与此大致相同，λ噬菌体采用裂解或溶原性生长途径依赖于基本的宿主功能，以提供一个变阻器来获得养分(Herman等人，1993年).

虽然许多病毒的生产性复制激活或抑制mTORC1，以刺激或抑制急性感染细胞中cap依赖性翻译(沃尔什和莫尔2011)这是第一个病毒利用mTOR作为传感器来监测环境条件和调节潜伏性溶解发育决策的例子。合成受mTORC1和4E-BP翻译阻遏物调控的蛋白质可能有助于以神经细胞自主方式在病毒外壳水平上控制潜伏期。可以想象，这些蛋白质可以间接或直接调节表观遗传染色质标记，影响对抗裂解基因表达的病毒编码微RNA的水平(Umbach等人2008)或控制HCF-1的亚细胞定位，HCF-1是病毒基因转录激活所需的关键细胞因子(Kim等人，2012年). 对这些蛋白质及其作用机制的鉴定可能会导致针对潜在基因组库的新治疗策略。

材料和方法

原代神经元的细胞培养与潜伏感染

使用表达EGFP-Us11融合蛋白的野生型HSV1（巴顿株）在颈上神经节（SCG）神经元中建立潜在感染(Camarena等人，2010年;Kobayashi等人2012). 使用样本大小为20孔的96孔板，进行三次标准再活化分析。Boyden腔室（Millipore 24孔Millicell插入物，孔径1.0-μm）中的潜在感染是通过在顶部腔室中加入NGF（50μg/mL），将约10000个细胞电镀到顶部腔室，在体外第3天将NGF降低到20μg/mL（DIV3），并通过DIV4将其完全去除，同时始终保持轴突一侧的正常培养条件。在DIV4用阿昔洛韦（ACV）对培养物进行预处理，在DIV5从顶部隔室潜伏感染HSV1，并在DIV10诱导其重新激活。每个实验至少进行三次。使用微流体装置（Xona Microfluitics no.SND450）的潜在感染是通过在细胞体（体）室中用涂有2μg/mL层粘连蛋白和200μg/mL聚D-赖氨酸（Sigma no.L2020和P0899）的玻璃盖玻片在体和轴突室中均存在100 ng/mL NGF的情况下，将约40000个SCG神经元电镀到细胞体（体内）室中来确定的。在DIV3上，染色体室中的NGF浓度从100 ng/mL降低到5 ng/mL，然后在DIV6上提高到100 ng/mL。这有助于轴突从染色体生长到轴突室，在那里NGF浓度较高。在DIV7上，在存在100μM ACV的情况下，染色体分区感染了HSV1（感染多重性[MOI]=2），并在DIV14上诱导其重新激活。

实时定量RT-PCR

使用Trizol从每个样本10000个SCG神经元中分离出的RNA使用NanoDrop分光光度计进行定量。使用qScript cDNA Supermix（Quanta Biosciences）进行RT以获得第一链cDNA。使用Bio-Rad-iCycler-iQ系统和iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行实时PCR。每个荧光周期阈值（Ct吨)使用HSV1 ICP27引物获得的值与18S rRNA的值进行了标准化。针对每个条件分析了三个独立分离的RNA样品。

致谢

我们感谢Katrin Deinhardt就分区神经元培养提出的宝贵建议，感谢Sean Hagerty提出的rheb构建，感谢Kevan Shokat提出的PP242。这项工作得到了NIH向M.V.C.（NS21072和HD23315）、A.C.W.（GM61139和S10RR017970）和I.M.（AI073898和GM056927）提供的资助。M.K.承认T32AI007647和T32AI07180的支持。

脚注

本文有补充材料。

文章在线：http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.190157.112.

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社