G9a与蜗牛相互作用，对人类乳腺癌中蜗牛介导的E-cadherin抑制至关重要

G9a与蜗牛互动，与蜗牛和DNMT形成一个综合体。

DNA甲基化由DNMT1、DNMT3a和DNMT3b催化(19). 已经证明G9a可以与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b结合(37,40). 蜗牛、G9a和DNMT参与H3K9me2和E-cadherin启动子的DNA甲基化，表明这些分子可能相互作用。为了验证这一想法，我们分别用TGF-β处理NMuMG和MCF10A细胞3天和12天，以诱导蜗牛的表达和EMT的诱导。在免疫沉淀蜗牛后，我们发现G9a和DNMT1的相关性（图​（图3D）。三D） ●●●●。我们也在HEK293细胞中共表达标记的G9a、HA标记的蜗牛和Myc标记的DNMT。在免疫沉淀G9a、DNMT或蜗牛后，我们检测到其他两种分子的结合，这表明这三种蛋白质可以作为复合物相互作用（图​（图4A）。4A） ●●●●。为了进一步扩展我们在CLBC细胞系中的发现，我们从乳腺癌MDA-MB157、MDA-MB231和BT20细胞中分别免疫沉淀了内源性Snail、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和G9a，我们发现了该复合物的其他成分的关联，证实了G9a-Snail DNMTs复合物在体内的形成（图​（图4B4B和补充图4A）。为了确定这些分子之间的关系，我们敲除了MDA-MB157细胞中蜗牛的表达。免疫沉淀G9a后，我们发现它不影响G9a与DNMT的相互作用（图​（图4C4C和补充图4B）。然而，当G9a被击倒时，与免疫沉淀蜗牛结合的DNMT显著减少，表明G9a是连接蜗牛和DNMT的桥分子（图​（图4D4D和补充图4C）。

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图4

G9a与蜗牛和DNMT形成一个综合体。

(A类)HEK293细胞与标记的G9a、HA标记的蜗牛和Myc标记的DNMT短暂共存。分别用Flag、HA或Myc抗体免疫沉淀细胞提取物，并用Western blotting检测相关的G9a、蜗牛和DNMT。(B类)从MDA-MB157、BT20和MDA-MB231细胞中免疫沉淀内源性蜗牛、G9a和DNMT，并通过Western blotting检测结合内源性蜗鼠、G9b和DNMT。(C类)蜗牛或NTC siRNA在MDA-MB157细胞中表达，内源性G9a免疫沉淀后，结合蜗牛和DNMT进行Western blotting。(D类)G9a或NTC siRNA在MDA-MB157细胞中表达，或用G9a抑制剂BIX01294（2.5μM）处理细胞，免疫沉淀内源性蜗牛后，结合的DNMT和G9a进行Western印迹。

G9a包含多个功能域，包括一个富含半胱氨酸的区域、6个位于中央的锚蛋白重复序列和一个C末端酶的SET域（图​（图5A）。5A） ●●●●。为了确定与蜗牛相互作用的区域，我们产生了几个G9a缺失突变体（图​（图5A）5A） 在HEK293细胞中与蜗牛共表达。我们发现锚蛋白重复序列和C末端SET结构域保留了与蜗牛相互作用的能力（图​（图5A）。5A） ●●●●。然而，G9a的N末端区域无法与蜗牛互动（图​（图5A）。5A） ●●●●。我们还从GST-蜗牛融合蛋白中纯化了全长蜗牛，随后用烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割并去除了GST部分。当纯化的蜗牛与各种GST-G9a缺失突变体、锚蛋白重复序列、SET结构域或锚蛋白重复体加上G9a的SET结构体（而非GST）孵育时，用蜗牛免疫沉淀（补充图5A）。相反，当蜗牛被免疫沉淀时，我们发现存在GST-G9a（锚蛋白重复序列）、GST-G8a（SET域）或GST-G9 a（锚定重复序列加SET域（补充图5B），这表明G9a在体外和体内都与蜗牛直接相互作用。BIX01294与G9a的SET域结合，不影响蜗牛与DNMT的相互作用（补充图6）。该观察结果与以下发现一致：蜗牛与G9a的锚蛋白重复序列和SET结构域相互作用，G9a活性的抑制并不影响E-cadherin启动子处的DNA甲基化（图10，第10条通道）​图3三B） ●●●●。

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图5

G9a直接与蜗牛互动。

(A类)显示G9a结构和不同删除结构的示意图（顶部面板）。HEK293细胞与编码G9a和HA标记蜗牛的标记全长（FL）或缺失突变体（指定为A、B和C）的质粒瞬时共表达。用Flag或HA抗体免疫沉淀提取物，并用Western blotting检测结合G9a或蜗牛。(B类)蜗牛和两个缺失突变体的结构示意图（上图）。蜗牛全长突变体和缺失突变体在HEK293细胞中与G9a共表达。G9a免疫沉淀后，通过Western blotting分析相关蜗牛。ZF，锌指。

为了确定蜗牛中与G9a相关的区域，我们生成了蜗牛的两个缺失突变体(41)：蜗牛的N末端区域（ΔC-Snail；氨基酸1–153），包含蜗牛的SNAG结构域；和蜗牛的C末端区域（ΔN-Snail；氨基酸153-264），包括保守的锌指基序（图​（图5B）。5B） ●●●●。当蜗牛的这两个缺失突变体在HEK293细胞中与G9a共表达时，我们发现ΔN-蜗牛能够与G9a相互作用，表明蜗牛的C末端区域负责其与G9a的相互作用（图​（图5B）。5B） ●●●●。总之，我们的结果表明，蜗牛、G9a和DNMT在体内形成复合物，蜗牛与DNMT的结合至少部分是通过与G9a的结合介导的。

E-cadherin表达缺失与CLBC中E-cadherin启动子处H3K9me2升高和DNA甲基化有关。

CLBC具有许多EMT特征，且E-cadherin表达水平显著降低，因此与不良临床结果相关(1,27,42). 在三种模型细胞系中，E-cadherin沉默需要蜗牛-G9a-DNMT复合物，我们假设该复合物也可能是CLBC中E-cadherin表达缺失的原因。为了验证这一观点，我们比较了蜗牛、G9a、DNMT和EMT标记在5个管腔和6个CLBC细胞系（以前称为基础B亚型）中的表达(2,43). 与之前的报告一致，其中6个CLBC细胞株失去了E-cadherin的表达，并获得了蜗牛、N-cadherin和波形蛋白的表达（图​（图6A）。6A） ●●●●。然而，在比较管腔和CLBC细胞系时，我们没有观察到G9a和DNMT的蛋白质水平有任何显著变化（图​（图6A）。6A） ●●●●。我们还检查了这些细胞系中H3K9甲基化和H3K9-乙酰化的全球水平，没有发现任何显著变化（补充图7）。然而，当我们对E-cadherin启动子进行ChIP分析时，我们在大多数CLBC细胞系中检测到E-cadherin启动子处H3K9me2的显著升高（图​（图6B；6B类；定量实时PCR结果如补充图8所示）。与这些发现一致，CLBC细胞系中E-cadherin启动子处的H3K9乙酰化低于腔型乳腺癌细胞系（图​（图6B）。6B） ●●●●。E-cadherin启动子处H3K9me2的升高可能是由于蜗牛-G9a-DNMTs复合物的关联，因为与管腔乳腺癌细胞系相比，CLBC细胞系中蜗牛和G9a在E-cadherin启动子处的占有率也显著升高（图​（图6B6B和补充图8）。我们还使用MSP评估了两种亚型中E-cadherin启动子DNA甲基化。同样，所有CLBC细胞系在E-cadherin启动子处均显示DNA甲基化，而在任何管腔乳腺癌细胞系中均未观察到E-cadherin启动子处的甲基化（图​（图6B）。6B） ●●●●。为了进一步扩大体内观察范围，我们收集了25例管腔型乳腺癌患者和16例三阴性乳腺癌患者的新鲜冷冻乳腺肿瘤组织（ERα、孕酮受体（PR）和HER2/neu表达为三阴性；通常称为基底样乳腺癌），并进行病理分级（补充表1）。这些样本上E-cadherin、ERα和claudin-3的表达与病理检查的信息相关（补充图9）。尽管G9a的表达在管腔型和三阴性乳腺癌之间没有显著差异，但在三阴性乳腺肿瘤中蜗牛的表达显著升高（补充图9）。我们对这些肿瘤组织进行了ChIP分析，发现与管腔型乳腺癌相比，三阴性乳腺癌中G9a、H3K9me2水平和E-cadherin启动子处的DNA甲基化显著升高（图​（图6C）。6C） ●●●●。这些在人类乳腺癌组织中的结果证实了我们在乳腺癌细胞系中的观察结果，这进一步支持了我们的发现，即G9a和H3K9me2对CLBC中E-cadherin表达的表观遗传沉默至关重要。

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图6

在CLBC细胞系和肿瘤样本中，G9a相关抑制标记在E-cadherin启动子处富集。

(A类)从5种管腔型和6种克劳丁-罗亚型乳腺癌细胞株中制备细胞提取物，并通过Western blotting分析蜗牛、G9a、DNMT1和其他EMT标记物的表达。(B类)用ChIP分析法分析了不同细胞系中G9a、蜗牛以及E-cadherin启动子处H3K9me2和H3K9乙酰化水平的相关性。MSP检测了不同乳腺细胞系中E-cadherin启动子的甲基化（底部2个面板）。(C类)用ChIP和MSP分别分析了新鲜冰冻人腔型（25例）和三阴性（16例）乳腺癌组织中G9a、H3K9me2和E-cadherin启动子DNA甲基化的相关性。分布图中显示了G9a（0.26±0.08对1.68±0.44）、H3K9me2（0.18±0.07对1.83±0.6）和DNA甲基化（0.70±0.13对3.00±0.48）的相关性的统计分析（平均值±SD）。TNBC，三阴性乳腺癌。

蜗牛将G9a招募到E-cadherin启动子，导致E-cadherin表达受到抑制。

为了进一步验证G9a-蜗牛-DNMT复合物与E-cadherin启动子相关并介导CLBC中E-cadherin基因的转录抑制，我们在MDA-MB231和MDA-MB157细胞中进行了ChIP分析。正如预期的那样，G9a、蜗牛和DNMT1都与E-cadherin启动子结合（图​（图7A）。7A） ●●●●。有趣的是，当蜗牛在MDA-MB157细胞中被特异性敲除时，G9a对E-cadherin启动子的占有率显著降低（图​图7B；7B类；定量实时PCR结果如补充图10所示），而G9a表达的敲低并不影响Snail与E-钙粘蛋白启动子的结合（泳道7与泳道6，图​图7B），7B） 表明G9a与E-cadherin启动子的关联是通过其与蜗牛的相互作用介导的。与这些发现一致，蜗牛或G9a的敲除降低了E-cadherin启动子处H3K9me2的水平，并增加了H3K9的乙酰化（第7和第8车道与第6车道，图​图7C；7C类；定量实时PCR结果也显示在右侧面板上）。这两种分子的敲除进一步降低了H3K9me2的水平，类似于BIX01294处理的细胞中发生的情况（9和10道与6道，图​图7C）。7C） ●●●●。我们还免疫沉淀了蜗牛复合物并进行了G9a酶分析。蜗牛复合体在体外含有H3K9me2甲基转移酶活性，而这种酶活性可以被BIX01294抑制（图​（图7D）。7D） ●●●●。这些结果进一步支持了蜗牛与G9a相互作用的结果，并且需要将G9a招募到H3K9me2的E-cadherin启动子中。

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图7

G9a被招募到E-cadherin启动子中，用于E-cadherin表达的表观遗传沉默。

(A类)通过ChIP分析E-cadherin启动子处内源性G9a、蜗牛和DNMT1的相关性。(B类)G9a、蜗牛或NTC siRNA在MDA-MB157细胞中表达，并用ChIP分析E-cadherin启动子处内源性G9a，蜗牛和DNMT1的相关性。定量实时PCR的结果如补充图10所示。(C类)G9a、蜗牛或NTC siRNA在MDA-MB157细胞中表达，或用BIX01294（2.5μM）处理细胞；通过ChIP分析分析E-cadherin启动子上的H3K9me2和H3K9乙酰化。定量实时PCR结果显示在右侧面板中（3个单独实验的平均值±SD）。(D类)显示了体外G9a甲基化试验的统计分析，3个独立实验的平均值±SD。(E类)G9a、蜗牛或NTC siRNA在MDA-MB157和MDA-MB231细胞中表达，或用DNMT抑制剂5′-Aza-dC（5′-Azia；10μM）处理这些细胞，并用MSP分析E-cadherin启动子处的DNA甲基化。Ctrl，control。(F类)显示了体外DNA甲基化试验的统计分析，来自3个独立实验的平均值±SD。

我们注意到G9a表达的下调显著降低了E-cadherin启动子处DNMT1的关联性（第9通道vs.第8通道，图​图7B），7B） ，并且蜗牛表达的敲除也降低了E-cadherin启动子处DNMT1的结合（第10通道vs.第8通道，图​图7B）。7B） ●●●●。与G9a相比，DNMT1与蜗牛击倒的关联性相对较强（10车道vs.9车道，图​图7B）7B） 是由于蜗牛的大量表情（图​图6A）6A） 以及敲低MDA-MB157细胞中蜗牛表达的效率低下（补充图11）。由于H3K9me2与DNA甲基化密切相关，我们检测了Snail和G9a在MDA-MB157和MDA-MB231细胞中对E-钙粘蛋白启动子DNA甲基化的作用。我们发现，蜗牛或G9a表达的敲低降低了E-cadherin启动子处的DNA甲基化水平（第3和第5道vs.第1道，图​图7E）7E） 在MDA-MB157和MDA-MB231细胞中。这两种分子的表达被敲除后，DNA甲基化水平进一步降低，与用5′-Aza-dC治疗后观察到的水平相似（第7和13道vs.第1道，图​图7E）。7E） ●●●●。当对蜗牛复合体进行免疫沉淀和DNMT酶活性测定时，我们发现蜗牛复合物也含有DNMT活性，并且这种活性可以被5′-Aza-dC抑制（图​（图7F）。7F） ●●●●。总之，这些结果表明，蜗牛是G9a募集所必需的，G9a促进DNMT的随后结合，并导致体内E-钙粘蛋白启动子的甲基化。

为了进一步建立G9a和蜗牛在体内的功能关系，我们敲除了MDA-MB157细胞中G9a、蜗牛或两者的表达，并通过定量实时PCR测定了E-cadherin mRNA水平。G9a或蜗牛表达的敲除增强了E-cadherin的mRNA水平（补充图12A）。敲除这两种分子的表达进一步增强了E-cadherin mRNA水平。当我们使用E-cadherin启动子荧光素酶作为报告基因时，也获得了类似的结果（补充图12B）。这些数据表明G9a和蜗牛在抑制E-cadherin表达和诱导EMT中起协同作用。

G9a是体外CLBC细胞迁移和侵袭以及体内肿瘤生长和肺部定植所必需的。

抑制E-cadherin表达对EMT诱导和肿瘤转移至关重要。由于G9a与蜗牛相关时诱导H3K9me2，并导致三种模型细胞系和CLBC中E-cadherin启动子的DNA甲基化，我们假设G9a对体外乳腺癌细胞迁移和侵袭至关重要。为了验证这一假设，我们建立了稳定的转染体，敲低MDA-MB231细胞中G9a的表达。我们使用两个独立的shRNAs实现了内源性G9a约80%-90%的敲除效率（图​（图8A）。8A） ●●●●。G9a在两个克隆中的表达被敲除导致了形态变化；细胞聚集在一起，伴随着E-cadherin表达的显著恢复和波形蛋白表达的显著下调（图​（图8，8、A和B）。G9a表达的敲除也减少了跛足畸形的形成，如肌动蛋白-球蛋白染色所示（补充图13）。虽然我们没有观察到分别通过细胞计数和MTT分析测量的体外细胞生长或增殖的显著变化（补充图14，A和B），但G9a表达的敲低大大抑制了MDA-MB231细胞的迁移能力和侵袭性（图​（图8，8、C和D）。当我们敲低MDA-MB157细胞中G9a的表达时，也得到了类似的结果（补充图15，A和B）。这些结果清楚地支持了我们的发现，G9a是控制EMT和癌症转移中E-cadherin沉默的主要因素。

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图8

G9a表达下调抑制乳腺癌细胞在体外的迁移和侵袭。

(A类)通过Western blotting检测稳定表达对照载体或G9a shRNA的MDA-MB231细胞中G9a、E-cadherin和vimentin的表达。(B类)相位对比图显示了MDA-MB231细胞和G9a被击倒的稳定转染体的形态学变化。免疫荧光染色分析这些细胞中E-cadherin和vimentin的表达。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：25μm。(C类)通过伤口愈合试验分析MDA-MB231细胞和相应的G9a表达下调的稳定转染体的迁移能力。细胞迁移的统计分析如条形图所示（3个独立实验的平均值±SD），右侧面板显示了一个具有代表性的实验。比例尺：100μm。(D类)用改良的Boyden室侵袭试验分析稳定表达对照载体或G9a-shRNA的MDA-MB231细胞的侵袭性。侵入细胞的百分比显示在条形图中（3个单独实验的平均值±SD），右侧面板中显示了一个具有代表性的实验。比例尺：10μm。

我们还扩展了在异种移植转移模型中的发现，在该模型中，MDA-MB231细胞被用于产生肺转移。首先，我们通过将MDA-MB231细胞和相应的G9a表达敲低的克隆注射到SCID小鼠的乳腺脂肪垫中来使用自发转移模型。尽管G9a的敲除不影响体外MDA-MB231细胞的生长，但G9a表达的敲除显著抑制体内肿瘤的形成（图​（图9A）。9A） ●●●●。当对照组（shNTC）的肿瘤达到2 cm时^三在大小上，我们移除了肿瘤，并让这些小鼠再生长4周以检查肺转移。我们注意到，对照组小鼠有大量的肺转移，而G9a表达下调的小鼠没有任何肺转移的迹象（数据未显示）。尽管这一结果令人感兴趣，并表明G9a在肿瘤生长和转移中的关键作用，但我们无法确定G9a表达下调的细胞缺乏肺转移是由于原发肿瘤生长缓慢还是由于这些细胞无法在原发肿瘤中侵袭和扩散。因此，我们使用了一种实验性转移模型，将肿瘤细胞直接注射到SCID小鼠的尾幕中。尽管相等数量的细胞（1×10⁶)注射G9a后，这些细胞已经迁移到肺部，这是由生物发光的可比强度决定的（补充图16），我们发现两个稳定克隆中G9a表达的下调抑制了这些小鼠的肺部定植（图16​（图9B）。9B） ●●●●。为了进一步扩展这些观察结果，我们在另一个乳腺癌细胞系MDA-MB435中建立了两个G9a表达下调的稳定克隆（补充图17A）。与MDA-MB231细胞中的观察结果类似，G9a表达下调抑制了这些细胞在体外的迁移和侵袭（补充图17、B和C），并抑制了体内乳腺癌生长和肺部定植（补充图17D和E）。总之，我们的结果表明，G9a通过与蜗牛和DNMT的相互作用抑制E-cadherin的表达，对细胞迁移、侵袭、肿瘤生长和定植至关重要。

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图9

G9a表达下调抑制体内乳腺癌生长和肺部定植。

(A类)将稳定表达对照载体或G9a shRNA的MDA-MB231细胞注射到ICR-SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。每3天监测一次乳腺肿瘤的生长情况。9周后，通过生物发光成像记录各组肿瘤的大小，并通过测量光子通量进行量化。数值为6只动物的平均值±SEM(B类)单元格来自A类也注射到ICR-SCID小鼠的尾静脉。9周后，使用生物发光成像记录肺转移的发展，并通过测量光子通量（6只动物的平均值±SEM）进行量化。显示了每组3只代表性小鼠的结果。处死小鼠，肉眼检查肺转移结节，或在石蜡包埋切片中用H&E染色检测肺转移结节。比例尺：100μm。箭头表示肺转移。

细胞培养。

除乳腺癌细胞系T47D和ZR75外，所有癌细胞系均在补充了10%FBS的DMEM/F12中生长，这些细胞系在RPMI-1640和10%FBS中生长。HMLE细胞由Robert A.Weinberg（美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院怀特黑德研究所）提供。为了建立G9a表达下调的稳定转染体，用G9a-shRNA转染MDA-MB231-Luc-D3H1（荧光素酶稳定表达，来自Xenogene Corp.）和MDA-MB435细胞；用嘌呤霉素（300ng/ml）筛选稳定克隆4周。

免疫染色、免疫沉淀和免疫印迹。

如前所述进行实验(25). 为了进行免疫荧光染色，细胞生长在室载玻片上，用4%多聚甲醛固定，并与初级抗体孵育。所使用的二级抗体是德克萨斯州红共轭山羊抗鼠、FITC-共轭山羊抗兔或Alexa Fluor 350山羊抗兔（分子探针，Invitrogen）。

DNA甲基化分析。

按照制造商的协议，使用EpiTect系统（QIAGEN）用亚硫酸氢钠处理基因组DNA（~0.75μg）。亚硫酸氢盐转化的DNA（~50 ng）被用作CDH1启动子中CpG岛PCR扩增的模板。使用凝胶提取试剂盒（QIAGEN）从1.5%琼脂糖凝胶中纯化所有PCR产物，并将其克隆到pGEM-T Easy载体（Promega）中。从每个样本中随机选择五个克隆进行测序。如Herman等人所述，对硫酸氢盐修饰的DNA进行MSP(65).

定量实时PCR。

根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）分离总RNA。按照制造商的协议（Applied Biosystems），使用SYBR Green Power Master Mix进行特定定量实时PCR实验。

GST下拉分析。

GST蛋白如前所述表达(45). 通过Western blotting检测下拉复合物。

侵入试验。

如前所述进行侵入分析(15,45). 所有实验至少进行两次，一式三次。使用学生的t吨测试；一P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

荧光素酶报告分析。

如前所述进行侵入分析(15,25,45). 所有实验都进行了3次，一式三份。

逆转录聚合酶链反应。

按照制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen）制备总RNA。使用SuperScript一步法RT-PCR试剂盒（Invitrogen）进行RT-PCR。PCR产物在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，并在紫外光下进行可视化和拍照。

炸薯条。

如前所述进行ChIP分析(45). E-钙粘蛋白启动子的引物为：5′-ATCCCAGGCTAGAGGGTCACC-3′和5′-CCGCAAGCTCACAGGTGCTTTGCAGTTCC-3′。

冷冻的新鲜肿瘤样本是从德克萨斯大学MD安德森癌症中心经IRB批准的患者切除的乳腺肿瘤中采集的。关于ERα、PR和HER2的分期、分级和表达的数据见补充表1。这些冷冻样品在液氮中进行snap冷冻，并储存在-80°C下。用H&E染色切片对每个样品进行组织学检查。对肿瘤样本的区域进行显微解剖和检查，只有组织中肿瘤细胞含量一致超过75%的样本才用于ChIP分析。根据制造商的说明，使用印记ChIP试剂盒（Sigma-Aldrich）制备肿瘤样本。简单地说，100 mg乳腺肿瘤组织与1%甲醛交联（Pierce）。然后使用Dounce均质器在1 ml均质缓冲液中对样品进行20次均质。离心后，将颗粒重新悬浮在0.25 ml裂解缓冲液中，并进行处理以进行ChIP分析。

G9a和DNMT甲基转移酶测定。

HEK293T细胞与编码G9a和蜗牛的结构体共转染。在对蜗牛1或G9a进行免疫沉淀后，使用DNA甲基转移酶分析试剂盒和H3K9甲基转移酶测试试剂盒（Epigentek），按照制造商的协议，分析复合物的DNA甲基转移活性和H3K甲基转移酶活性。DNMT和G9a的酶活性分别在450nm处用微孔板阅读器和450nm处的荧光板阅读机检测。

实验性肺转移模型。

从Taconic购买雌性ICR-SCID小鼠（6-8周龄），并在特定无病原体条件下进行维护和治疗。小鼠注射MDA-MB231-luc-D3H1（1×10⁶细胞/小鼠）或MDA-MB435（2×10⁶细胞/小鼠）细胞及其相应的稳定克隆，通过乳腺脂肪垫或尾静脉敲低G9a表达（6只小鼠/组）。每周从背部和腹部对MDA-MB231细胞小鼠进行一次成像。所有注射MDA-MB231细胞的小鼠（6只，共6只）都出现了预期的肺转移病灶，荧光素酶信号在第5周开始出现。对于MDA-MB435细胞，12周内出现肺转移病灶。肉眼观察可见的肺转移性结节或在H&E染色的石蜡包埋切片中发现。使用Student’st吨测试；一P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

微阵列分析和G9a预测信号。

使用Affymetrix U133A微芯片（数据集保存在NCBI GEO数据库中，登录号为GSE34925），对MDA-MB231细胞和相应的稳定转染体进行表达谱分析，敲低G9a表达（每个样本一式三份）。对差异表达最大的探针（定义为中位数表达值的倍数变化）进行SAM（微阵列显著性分析）分析(66)与对照组相比，差异表达变化最小为1.33倍。该分析在MDA-MB231细胞中G9a表达下调后产生183个上调基因和250个下调基因，预测错误发现率（FDR）为0.85%。

为了确定G9a信号可能调控的基因并在乳腺癌患者生存中发挥作用，我们首先选择了GSE11121数据集（来自NCBI GEO网站；网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)包括200名结节阴性乳腺癌患者作为训练数据集，并进行单变量Cox比例风险回归分析，以找出其表达与患者生存率潜在相关的基因。然后将该基因列表与G9a敲低基因标记重叠，以找到常见基因，并通过聚类分析进一步限制在乳腺癌中共表达的9个基因(OLFML3级,ZFP36L2型,OGN（开放式网络）,PECAM1公司,COL6A1系列在G9a被击倒后受到上调，以及NKX21型,SQLE公司,CDR1型,SLCO4C1型G9a被击倒后被下调）。接下来，我们使用以下算法构建了一个多基因评分。规范化问题日志₂首先用一个特定问题的所有样本的中值减去这些值。多基因评分是5个上调基因减去4个下调基因的平均总和。根据基因表达热图，将任意阈值设置为±0.45，将患者分为三组，即低、中、高9个基因得分组（补充图20B）。这有效地将患者分为预后差和预后好的两组（补充图20A，P（P）= 1.999 × 10^-8). 此外，它将1级和3级患者从极端组中分离出来（补充图20B）。

为了验证9基因特征，我们首先使用GSE2034，这是另一个包含286名结节阴性乳腺患者的数据集，并应用相同的9基因评分分层程序将这些患者分为不同的预后组（补充图21A，P（P）= 0.00469). 患者的分离似乎与他们的ER状态无关（补充图21B）。接下来我们使用GSE1456，其中包括159名未报告淋巴结状态的乳腺患者。同样，9基因标记能够使用无病生存率或总生存率将患者分为三个预后组（补充图22A，P（P）=0.00919和0.00197）。这与分级和肿瘤亚型很好地对应，低分级组的1级和正常肿瘤较多，高分级组的3级、基底部和HER2肿瘤较多（补充图22B）。

统计。

实验重复至少2次。结果表示为平均值±SD或SEM，如图所示。独立学生的t吨检测荧光素酶活性；双尾学生的t吨测试用于组间比较。A类P（P）值小于0.05被认为具有统计学意义。

我们感谢Nathan L.Vanderford对手稿的批判性阅读和编辑。这项工作得到了NIH（R01CA125454）、Susan G.Komen基金会（KG081310）和Mary Kay Ash基金会（给B.P.Zhou）的资助。