雷帕霉素复合物1和2的非限制性哺乳动物靶点增加10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因的表达以调节Akt激酶的磷酸化^*

摘要

介绍

10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）⁵代表癌症中最常缺失的磷酸酶和第二常缺失的肿瘤抑制基因(1). 事实上，50-70%的散发性肿瘤，包括前列腺癌、子宫内膜癌和胶质母细胞瘤，以及30-50%的肺癌、乳腺癌和结肠癌，显示PTEN的一个等位基因缺失(2). 子宫内膜肿瘤、胶质母细胞瘤和BRCA1缺陷乳腺癌中PTEN的完全缺失与晚期转移相关(2). 此外，PTEN的种系突变与常染色体显性发育障碍、神经功能缺陷和错构瘤综合征（包括Cowden病、Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Lhermitte-Duclos病）有关，这些疾病显示出较高的癌症易感性(三,4).

生长因子刺激的I类磷脂酰肌醇（PI）3-激酶家族成员或其突变的组成活性催化亚单位产生磷脂酰肌糖3,4,5-三磷酸（PIP_三)调节细胞迁移、极性、增殖和存活等多种细胞功能(5,6). 项目实施计划_三在质膜中产生的新蛋白包含肽同源结构域，如Akt和PDK-1。Akt活化通过PDK-1和mTORC2分别在Thr-308和Ser-473两个位点的磷酸化发生(7). 在结构上，PTEN在其催化域中与其他蛋白磷酸酶具有相同性(8). 虽然PTEN很少被报道去磷酸化蛋白底物，但其对PIP的磷酸酶活性_三是其生理抑癌功能的重要机制(9–13). 因此，PTEN作为PI3-激酶信号转导的负调节因子，显著减弱Akt的生物活性。在PTEN阴性的癌细胞中，Akt被组成性激活，并通过包括结节性硬化复合物2（TSC2）和PRAS40在内的许多底物的磷酸化调节细胞生长、增殖、血管生成和代谢，这两种底物的失活都会增加雷帕霉素敏感性mTORC1的活性(7,14).

TSC1或TSC2基因突变有助于TSC的发展，表现为肺淋巴管肌瘤病、面部血管肉瘤和肾血管平滑肌脂肪瘤等疾病(15). 此外，TSC患者经常表现出神经障碍，包括智力低下、癫痫和自闭症(16). 临床上，与TSC1突变相比，TSC2基因座突变对TSC的表现贡献更大(17). 在功能上，TSC1和TSC2作为一种异二聚体存在，其中TSC2包含GTPase激活蛋白结构域。TSC1·TSC2复合物对富含大脑（Rheb）的小GTPase Ras同源物发挥GTPase激活蛋白活性，并阻断mTOR活性(18,19). 遗传研究果蝇属在哺乳动物细胞中，TSC2作为PI3-激酶/Akt/mTOR途径中的信号整合中枢(19,20). 活化的Akt和其他有丝分裂激酶在不同的位点磷酸化TSC2，导致其与TSC1分离并失活(21–24). 因此，失活的TSC2维持GTP结合的Rheb水平升高，从而激活TORC1促进肿瘤发生。TSC错构瘤的病理标本中显示TORC1活性增强(25,26). 同样，在PTEN缺乏的肿瘤中，Akt活性增加使TSC2磷酸化，导致其失活，从而激活mTOR(7,27).

TOR存在于两个进化保守的复合物中，即TORC1和TORC2；前者对雷帕霉素更敏感(28,29). TORC1和TORC2含有两种不同的蛋白质，分别是mTOR（猛禽）的雷帕霉素敏感衔接蛋白和mTOR的雷帕素不敏感伴侣(28,30,31). 这两种复合物都能结合mLST8/GβL和deptor，而TORC1含有PRAS40，TORC2含有protor和mSim1(28,32,33). TORC1直接磷酸化真核启动因子4E-结合蛋白（4EBPs）和核糖体蛋白S6激酶，并增加核糖体生物生成，以诱导细胞生长、增殖和代谢(32,34). 另一方面，TORC2在疏水基序位点Ser-473磷酸化Akt，以充分激活其抗凋亡功能(35,36).

TSC2缺失引起的广泛错构瘤很少发展为恶性肿瘤。TSC2缺乏导致Akt活性抑制，这可能有助于降低TSC肿瘤的恶性程度(37,38). TSC2-null细胞中Akt磷酸化下调的机制有多种。TSC2的破坏通过雷帕霉素敏感的TORC1介导的通过胰岛素受体底物1的负反馈环路产生胰岛素抵抗状态(37,38). 通过一种未知机制下调TSC2-null小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中PDGF受体-β，实现PI3-激酶/Akt信号的第二级负调控(39,40). 我们最近报道，在TSC2缺失的MEFs中，PTEN水平显著升高，这也有助于Akt磷酸化的降低(41). PTEN在TSC2-disrupted细胞中上调的信号转导机制尚不清楚。

在本研究中，我们发现TSC2-null MEF中增强的TORC1活性通过转录机制调节PTEN mRNA和蛋白水平。同样，TORC1控制正常细胞中PTEN的表达。此外，我们还表明，与TORC1一起，TORC2也有助于PTEN的表达。最后，我们证明TORC1和TORC2均上调Hif1α蛋白，从而增强PTEN的转录。因此，尽管mTOR活性增加，TSC患者PTEN的上调可能会减弱肿瘤的恶性潜能。

实验程序

结果

mTOR调节TSC2中PTEN的表达^−/−MEF公司

在TSC2-null细胞中，涉及增强TORC1活性的负反馈回路抑制Akt的磷酸化(37,38,46). 抑癌蛋白PTEN是PIP的重要机制_三维持调节Akt磷酸化的水平(11,12). 我们最近发现，TSC2缺失细胞中PTEN表达的增加也有助于Akt磷酸化的减少(补充图S1) (41). TSC2的GTPase激活蛋白活性阻断TORC1活性(18,20). 事实上，TORC1在TSC2缺乏的MEF中具有组成性活性，这一点可以通过Thr-389处p70 S6激酶的磷酸化增加得到证实(补充图S1). 检测TORC1在TSC2 PTEN表达中的作用^−/−MEF，我们使用雷帕霉素，一种TORC1活性的有效抑制剂(29). 雷帕霉素显著降低TSC2-null MEF中PTEN mRNA的表达，同时PTEN蛋白水平降低(图1,A类和B类). 雷帕霉素引起的S6激酶磷酸化缺失证实了TORC1活性的抑制(图1B类) (37,41,46). PTEN蛋白水平的降低导致这些细胞中Akt磷酸化上调(图1B类). 这些发现表明，TORC1调节TSC2缺陷细胞中PTEN的表达。为了更深入地了解PTEN表达的这种调控模式，我们将这些研究扩展到生长中的人类293细胞中，这些细胞在血清中表达活性TSC2。用雷帕霉素孵育这些细胞显示PTEN mRNA和蛋白的减少，这与TORC1的抑制有关(图1,C类和D类). 与TSC2-null MEF的观察结果类似，雷帕霉素增加了Akt在Ser-473和Thr-308的磷酸化(图1D类).

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图1。

mTOR调节PTEN的表达和Akt的磷酸化。 A–D雷帕霉素降低PTEN表达以调节Akt磷酸化。A类和B类、TSC2^−/−MEF生长到接近汇合处，在与25 n培养基孵育之前，需要饥饿血清24 h米雷帕霉素24h。A类如图所示，总RNA用于半定量RT-PCR检测PTEN和GAPDH mRNA。B类，用“实验程序”中所述的指示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹C类和D类，293个细胞在10%血清中生长汇合，然后与25n孵育米雷帕霉素24h。C类，通过半定量RT-PCR分析总RNA中PTEN和GAPDH mRNA的表达。D类，用所示抗体对清除的细胞裂解物进行免疫印迹。E–H（E–H）显性负mTOR抑制PTEN表达，从而影响Akt的磷酸化。E类和F类、TSC2^−/−将500 ng Myc-tagged mTOR KD或载体质粒转染12孔培养皿中的MEF，如“实验程序”所述。转染后24小时，用无血清培养基培养细胞24小时。E类用半定量RT-PCR分析PTEN和GAPDH mRNA的总RNA。F类，用所示抗体对清除的细胞裂解物进行免疫印迹。G公司和H（H）用Myc-mTOR KD转染293细胞，并在10%血清中培养48小时。G公司用半定量RT-PCR分析PTEN和GAPDH mRNA的总RNA。H（H），用所示抗体对清除的细胞裂解物进行免疫印迹。p-Akt公司，磷酸-Akt；S6K系列，S6激酶；p-S6K系列，磷酸-S6激酶。

雷帕霉素已被证明显著抑制TORC1活性，尽管与该大环内酯类药物长时间孵育（超过12小时）可阻断某些癌细胞中的TORC2活性(29). 上述结果是用雷帕霉素培养24小时的细胞获得的(图1,A–D). 在这些条件下，我们观察到Akt在Ser-473的磷酸化增强(图1,B类和D类). 这些数据表明雷帕霉素没有抑制TSC2中mTORC2的活性^−/−MEF和293个细胞。

为了更详细地测试mTOR的参与，我们检测了作为显性负激酶的激酶头mTOR是否影响TSC2-缺陷MEF中PTEN的表达。结果表明，TSC2-null MEFs中激酶头mTOR的表达抑制了PTEN mRNA和蛋白的表达，并减弱了TORC1介导的S6激酶磷酸化(图1,E类和F类)与上述雷帕霉素的作用类似。然而，与雷帕霉素的结果不同，激酶头mTOR抑制了TORC2介导的Akt在Ser-473的基础磷酸化(图1F类). 这些数据与影响mTOR激酶活性的激酶头结构突变一致，无论其是TORC1还是TORC2的组成部分。另一方面，我们观察到Thr-308处Akt的磷酸化增加(图1F类). 这可能是由于PIP的增加_三与PTEN降低相关的水平(图1F类,顶部面板)，这将刺激负责TSC2中Akt-Thr-308磷酸化的PDK-1活性^−/−MEF公司(图1F类).

为了进一步研究mTOR调节PTEN的生理相关性，我们检测了其对生长中的人类293细胞的影响。这些细胞中显性负mTOR激酶的表达抑制PTEN mRNA(图1G公司)与S6激酶磷酸化降低相关的蛋白质丰度，S6激酶被用作测定TORC1活化的替代物(图1H（H）). 由于激酶头mTOR会阻断TORC2活性，因此293细胞中Ser-473的Akt磷酸化被抑制(图1H（H）). 相反，显性阴性mTOR增加了Thr-308处Akt的磷酸化(图1H（H）). 这些数据共同表明，与TSC2类似^−/−MEF显性负mTOR阻断TORC1和TORC2活性，以交互方式调节Thr-308和Ser-473的Akt磷酸化。

为了证实TORC1在PTEN表达调控中的作用，我们接下来使用了mTOR的组成型活性突变体(补充图S2)在人类293细胞中(43). 293细胞中CA mTOR的表达增加了PTEN mRNA和蛋白的表达，同时增加了S6激酶的磷酸化(图2,A类和B类). mTOR的这种组成性活性突变体已被证明仅显示TORC1活性(43). 因此，在组成活性mTOR表达细胞中，Ser-473的Akt磷酸化被显著抑制(图2B类). 此外，在组成活性mTOR的存在下，Thr-308的Akt磷酸化也被抑制(图2B类). 这可能是因为增加PTEN会降低PIP_三从而导致PDK-1活性降低。总之，我们的结果表明，由于TORC1活性增加，PTEN的表达减少了Akt的磷酸化。

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图2。

CA mTOR增加PTEN以调节293细胞中Akt的磷酸化。用CA mTOR或载体质粒转染293细胞。转染后24小时，细胞在收获前在无血清培养基中培养24小时。A类用半定量RT-PCR分析总RNA中PTEN和GAPDH mRNA的表达。B类，用指示的抗体对清除的细胞裂解物进行免疫印迹。p-Akt公司，磷酸-Akt；S6K系列，S6激酶；p-S6K系列，磷酸-S6激酶。

mTOR调节PTEN的转录

上述结果表明，TORC1调节PTEN mRNA的表达。为了进一步了解其机制，我们研究了TORC1在PTEN转录中的作用。我们使用了一个报告质粒，其中萤火虫荧光素酶基因由PTEN启动子（PTEN-Luc）驱动(41,47). 该报告质粒的瞬时转染导致TSC2中有显著的荧光素酶活性^−/−MEF公司(图3A类) (41). 报告转染细胞与雷帕霉素孵育显著抑制荧光素酶活性，表明PTEN转录降低(图3A类). 类似地，mTOR激酶缺失突变体的表达阻止了TSC2中报告者的活性^−/−MEF公司(图3B类). 为了证实这些结果，我们将PTEN-Luc瞬时转染到人293细胞中。雷帕霉素对这些细胞的处理减弱了报告活性(图3C类). 此外，显性阴性mTOR与报告质粒共转染显著抑制荧光素酶活性(图3D类). 最后，我们确定组成性活性mTOR是否会增加这种活性。mTOR组成活性突变体与PTEN-Luc在293细胞中的共转染导致荧光素酶活性显著上调(图3E类). 这些结果表明，TORC1调节PTEN启动子活性以增加PTEN表达。

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图3。

mTOR调节TSC2中PTEN的转录^−/−MEF和293个细胞。 A类和B类、TSC2^−/−如图所示，用PTEN-Luc和mTOR KD转染MEFs。转染后24小时，细胞被血清饥饿24小时，并在收获前用雷帕霉素处理24小时(A类). 如“实验程序”所述，测定细胞裂解液中的荧光素酶活性(41,44,45,65).C–E类用PTEN-Luc和mTOR KD或CA mTOR转染293细胞，然后在血清中培养48小时(C类和D类). 中的单元格C类收获前与雷帕霉素孵育24h。对于E类转染后24小时，将细胞在无血清培养基中培养24小时。细胞裂解物用于荧光素酶活性测定，如所述(41,44,45,65). 对于A–D，显示了12个测量值的平均值±S.E。对于A类,B类、和D类，*代表第页= 0.001对控件。对于C类，*代表第页= 0.002对控件。对于E类，显示了六次测量的平均值±S.E.。*，第页= 0.0007对控件。

TORC1和TORC2通过转录调控PTEN的表达

雷帕霉素、激酶头mTOR和组成活性mTOR突变体的使用最终表明了激酶在调节PTEN表达中的重要作用。为了进一步剖析分子机制，我们首先通过抑制猛禽来检测TORC1的作用，猛禽是TORC1激酶的一种独特成分(31). 使用TSC2中的siRNA池击倒猛禽^−/−MEF降低PTEN水平(图4A类). 正如预期的那样，猛禽击倒降低了这些细胞中S6激酶磷酸化所判断的TORC1活性(图4A类). 由于TORC1活性降低导致PTEN水平降低与Ser-473和Thr-308的Akt磷酸化增加相关(图4A类). 这些发现表明，在TSC2缺乏症中PTEN上调需要TORC1活性。我们还检测了猛禽对生长中的人类293细胞的下调作用。使用两种独立的shRNA载体shRaptor 1和shRaptor2敲除猛禽后，基础PTEN水平降低，同时S6激酶磷酸化降低(图4,B类和C类). PTEN的减少导致Akt在Ser-473和Thr-308的磷酸化增加(图4,B类和C类). 为了证实这一观察结果，我们还使用siRNA池来下调293个细胞中的猛禽。正如预期的那样，PTEN的表达被抑制，同时S6激酶磷酸化降低，Akt磷酸化增加(补充图S3A).

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图4。

猛禽的下调可阻止PTEN的表达并增加TSC2中Akt的磷酸化^−/−MEF和293个细胞。 A类、TSC2^−/−用siRNA池转染MEF（20 n米)如“实验程序”所述，靶向猛禽或干扰RNA(41,44,45,65). 转染后20小时，细胞被血清饥饿24小时。细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。B类和C类用两个独立的shRNA表达质粒shRaptor 1和shRaptor2转染293细胞，靶向猛禽基因中的两个不同区域（500ng）或打乱(紧急停堆)向量如“实验程序”所述(41,44,45,65). 转染48小时后，用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。D–F型、TSC2^−/−MEF公司(D类)或293个细胞(E类和F类)用PTEN-Luc和siRNA池（20 n米)对抗猛禽(D类)或表达shRaptor 1的质粒(E类)或shRaptor 2(F类)（250纳克）。转染后20小时，TSC2^−/−MEF缺血清24小时(D类). 如果是293个细胞(E类和F类)在转染后48h收集细胞。如前所述，对细胞裂解物进行荧光素酶活性分析(41,44,45,65). 显示了12次测量的平均值±S.ED类和E类。对于F类，显示了六个测量值的平均值±S.E。对于D类，*代表第页= 0.002对控件。对于E类，*代表第页=0.0008对控件。对于F类，*代表第页= 0.02对控件。猛禽的表情如底部属于直方图代表性井。p-Akt公司，磷酸-Akt；p-S6激酶，磷酸-S6激酶。

我们已经证明mTOR通过转录机制调节PTEN mRNA的表达(图3). 为了检测TORC1是否特异性调节PTEN的转录，我们将PTEN-Luc报告质粒与TSC2中针对猛禽的siRNA池共转染^−/−MEF公司。TSC2猛禽击倒^−/−MEFs显著抑制荧光素酶活性(图4D类). 同样，PTEN-Luc与shRaptor 1或shRaptor2共同转染可减弱293细胞的报告活性(图4,E类和F类). 当我们在293个细胞中使用靶向猛禽的siRNA池时，获得了相同的结果(补充图S3B).

接下来，我们研究了TORC2在PTEN表达中是否起作用。采用血清培养的293个细胞。我们下调了对其激酶活性必需的TORC2组分rictor的表达(48)，使用两个独立的shRNA载体shRictor 1和shRictor 2生长293细胞。用两种rictor shRNAs敲低rictor抑制PTEN蛋白表达(图5,A类和B类). 正如预期的那样，作为TORC2底物的Ser-473的Akt磷酸化降低(图5,A类和B类). 有趣的是，在对rictor下调的反应中，Thr-308处Akt磷酸化的减少是明显的(图5,A类和B类). 使用siRNA池下调293个细胞中的rictor获得了相同的结果(补充图S4A). 为了进一步证实TORC2的作用，我们使用了两个靶向mSim1的shRNA质粒，mSim1是TORC2唯一的成分。该蛋白的两种亚型mSin1.1和mSin1.2主要存在于TORC2复合物中(33). 两种mSin1复合物与两种独立shRNAs的下调抑制PTEN的表达(图5,C类和D类). Akt的磷酸化也被阻断(图5,C类和D类). 最后，为了阐明TORC2在PTEN转录中的作用，用PTEN-Luc报告子和两个独立的shRNA载体shRictor 1和shRictor 2共转染293细胞。用两种shRNAs敲除里克托显著阻断了报告人的活动(图5,E类和F类). 使用siRNA池靶向这些细胞中的rictor以抑制rictor表达也获得了类似的结果(补充图S4B). 当针对mSim1的shRNAs被用于下调TORC2时，得到了相同的结果(图5,G公司和H（H）). 这些结果表明，TORC1和TORC2都通过转录机制促进PTEN蛋白的表达。

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图5。

在293细胞中，rictor和mS1的下调阻止PTEN的表达并降低Akt磷酸化。 A类和B类，293细胞用两种独立的shRNA表达质粒shRictor 1和shRictor 2转染，靶向rictor基因中的两个不同区域（500ng）或扰乱(紧急停堆)向量。C类和D类将两个独立的shRNA表达质粒mS1 sh1和mS1 sh2转染293细胞，靶向mS1 mRNA（500 ng）或打乱载体中的两个不同区域。转染48小时后，用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。E类和F类用PTEN-Luc和shRictor 1共转染293细胞(E类)、shRictor 2(F类)，mSin1第1页(G公司)，或mSin1 sh2(H（H）)表达式向量。转染后48小时收集细胞。如前所述，对细胞裂解物进行荧光素酶活性分析(41,44,45,65). 对于E类，显示了12次测量的平均值±S.E.。*，第页= 0.002对控件。对于F类，显示了六次测量的平均值±S.E.。*，第页=0.03对控件。对于G公司，显示了六次测量的平均值±S.E.。*，第页= 0.04对控件。对于H（H），显示了六次测量的平均值±S.E.。*，第页= 0.002对控件。rictor和mSin1的表达如底部的直方图。p-Akt公司，磷酸化-Akt。

TORC2通过翻译机制促进Hif1α表达

我们最近发现，PTEN启动子中存在的Hif1α应答DNA元件增加了其在TSC2-null MEF和293细胞中的转录(41). 此前，雷帕霉素被证明可以抑制TSC2缺失的MEFs中mTOR活性和Hif1α介导的转录(49). 我们直接测试了TORC1是否调节TSC2-缺陷MEF中的Hif1α蛋白。siRNA池介导的这些细胞中猛禽的下调降低了Hif1α蛋白水平(图6A类). 同样，使用两个独立的shRNA载体shRaptor 1和shRaptor2抑制猛禽表达，也阻断了293细胞中Hif1α的表达(图6,B类和C类). 当我们使用siRNA池下调这些细胞中的猛禽时，获得了相同的结果(补充图S5). 这些结果最终证明TORC1调节Hif1α蛋白的表达。

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图6。

TORC1和TORC2调节TSC2中Hif1α的表达^−/−MEF和293个细胞。 A类,D类、和E类、TSC2^−/−用siRNAs转染MEF（20 n米)如“实验程序”所述，靶向猛禽、里克托、mSin1或干扰RNA。转染后24小时，细胞需要血清饥饿24小时。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。B类,C类,F类,G公司,H（H）、和我用500 ng两个独立的shRNA表达质粒shRaptor 1转染293细胞(B类)和shRaptor 2(C类)，shRictor 1型(F类)和shRictor 2(G公司)，或mSin1 sh1(H（H）)和mSin1 sh2(我)，或是打乱(紧急停堆)转染48小时后，用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。J–M公司，Hif1α5′TOP-Lux报告质粒(42)与Myc标记的猛禽共同感染(J型)、Myc-tagged rictor(K（K）)，Myc标记的mSin1.1(我)，或Myc-tagged mSin1.2(M（M）)293个细胞。在细胞裂解物中测定了萤光素酶的活性。显示了六次测量的平均值±S.E。对于J型，*代表第页= 0.005对控件。对于K（K），*代表第页= 0.03对控件。对于我，*代表第页= 0.005对控件。对于M（M），*代表第页= 0.001对控件。p-Akt公司，磷酸-Akt；p-S6激酶，磷酸-S6激酶。

我们在上面已经表明，与TORC1一起，TORC2也有助于PTEN的表达(图4和​和5）。5). 因为PTEN是Hif1α靶基因(41)，我们使用rictor siRNA测试了TORC2在Hif1α表达中的参与。在TSC2-null MEF中，一种混合的siRNA-directed下调rictor的表达可降低Hif1β蛋白水平(图6D类). 这些细胞中mS1的siRNA定向下调也抑制了Hif1α的表达(图6E类). 与这些观察结果类似，使用两个独立的shRNA载体对每个蛋白下调rictor或mSim1都会降低293细胞中Hif1α蛋白的丰度(图6,F–I型). Hif1α蛋白的表达被认为是由于5′-UTR中存在TOP而导致其mRNA翻译增加(50,51). 事实上，在TSC2-null MEF中，Hif1α蛋白表达对雷帕霉素敏感，表明TORC1的作用(补充图S6) (49,50). 为了直接测试翻译机制，我们使用Hif1α5′-UTR驱动的报告质粒和猛禽表达载体(42). 猛禽过度表达增加Hif1α5′-UTR介导的报告活性(图6J型). 有趣的是，rictor和mSin1.1和mSin1.2的表达也增加了Hif1α5′-UTR驱动的荧光素酶活性(图6,K–M公司).

上述结果表明TORC2在增加Hif1α5′-UTR的翻译中起作用。蛋白质合成中的限速步骤涉及TORC1对翻译阻遏物4EBP-1的磷酸化(52). 我们使用rictor和mSin1 shRNAs测试了TORC2在4EBP-1磷酸化中的作用。rictor或mS1的下调抑制了Thr-37/46和Ser-65处4EBP-1的磷酸化(图7,A–D). 磷酸化诱导4EBP-1从eIF4E·4EBP-2复合物中解离以释放eIF4E，使eIF4E-与eIF4G结合形成起始复合物以开始mRNA翻译(52). 我们使用靶向293细胞中rictor和mSin1的shRNAs测试了TORC2在这一过程中的作用。共免疫沉淀实验表明，使用两个独立的shRNAs对每种蛋白下调rictor和mS1后，eIF4E与4EBP-1的相关性增加(图8,A–D). 反过来，从蓖麻shRNA-或mS1 shRNA--下调的样品中免疫沉淀eIF4E，然后用4EBP-1免疫印迹，显示4EBP-1eIF4e与4EBP-2的相关性增加(补充图S7，A–D).

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图7。

rictor或mS1的下调降低4EBP-1的磷酸化。293个细胞被转染了两个靶向其中一个rictor的独立shRNA质粒(A类和B类)或mSin1(C类和D类)或者加了炒(紧急停堆)矢量如图所示。细胞裂解物用磷酸化-4EBP-1进行免疫印迹(p-4EBP-1型)（Thr-37/46）、磷酸化-4EBP-1（Ser-65）和4EBP-1抗体。用抗rictor、mS1、phospho-Akt抗体对相同样本进行免疫印迹(p-Akt公司)（Ser-473）、Akt和肌动蛋白也显示出来。

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图8。

TORC2调节eIF4E·4EBP-1复合物的解离和eIF4E·eIF4G复合物的形成。用shRictor 1转染293细胞(A类和E类)、shRictor 2(B类和F类)，mSin1第1页(C类和G公司)，或mSin1 sh2(D类和H（H）)表达载体。转染48小时后，对细胞进行裂解，并用4EBP-1对提取物进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹(国际银行)带有eIF4E和4EBP-1抗体(A–D).E–H（E–H），相同的细胞裂解物被免疫沉淀(IP（IP）)使用eIF4E，然后用eIF4G和eIF4E抗体进行免疫印迹。Akt在Ser-473处的磷酸化，以证明rictor下调的细胞中的TORC2活性，以及细胞裂解物中rictor和mS1的表达，见底部面板。紧急停堆，已加扰；p-阿克特，磷酸化-Akt。

翻译的起始是由eIF4E、eIF4G和eIF4A组成的eIF4F复合物与mRNA帽结合。因此，我们测试了TORC2参与eIF4E·eIF4G复合物的形成。用eIF4G对shRictor或shmSin1转染细胞中的eIF4E免疫沉淀物进行免疫印迹，每个蛋白使用两个独立的shRNAs。rictor或mSi1的下调抑制了eIF4E·eIF4G复合物的形成(图8,E–H（E–H）). 相互免疫沉淀-相同样品的免疫印迹显示出相似的结果(补充图S7、E和H). 这些结果共同提供了TORC2调节mRNA翻译起始阶段的证据，并支持我们对上述Hif1α翻译增加的观察。

TORC2调节Hif1α依赖的PTEN表达

我们之前已经证明PTEN的表达受Hif1α的调节(41). 此外，我们已经证明TORC2调节Hif1α蛋白的表达(图6,F–I型). 我们检验了TORC2调节的Hif1α有助于PTEN表达的假设。用shRictor或shmSin1质粒以及Hif1α表达载体转染293细胞。正如预期的那样，rictor或mSim1的下调和Hif1α的表达分别降低和增加PTEN蛋白的水平(图9,A–D). 由于TORC2的抑制和PTEN表达的增加，Akt在Ser-473的磷酸化被抑制。有趣的是，Hif1α的表达阻止了shRictor或shmSin1诱导的PTEN表达抑制，从而导致Akt（Ser-473）磷酸化降低(图9,A–D，比较车道4具有车道2). 这些结果表明，TORC2介导的Hif1α表达调节PTEN水平。

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图9。

TORC2调节Hif1α驱动的PTEN表达。 A–D用HA标记的Hif1α和shRictor 1转染293细胞(A类)、shRictor 2(B类)，mSin1第1页(C类)，或mSin1 sh2(D类). 转染后48小时，对细胞进行裂解，并用所示抗体对裂解产物进行免疫印迹。E类和F类，TORC2调节Hif1α依赖的PTEN转录。用PTEN-Luc、HA-Hif1α和shRictor 1共同转染293细胞(E类)、shRictor 2(F类)，mSin1第1页(G公司)，或mSin1 sh2(H（H）). 转染48小时后，测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。显示了六次测定的平均值±S.E。在E类，*表示第页< 0.01对控件，#表示第页< 0.001对控件，**表示第页< 0.001对shRictor 1单独使用。在F类，*代表第页< 0.001对控件，#表示第页< 0.001对控件，**表示第页< 0.001对仅shRictor 2。在G公司，*代表第页< 0.001对控件，#表示第页< 0.001对控件，**表示第页< 0.001对仅mSin1 sh1。在H（H），*代表第页< 0.01对控件，#表示第页< 0.001对控件，**表示第页< 0.001对仅mSin1 sh2。紧急停堆，已加扰；p-Akt公司，磷酸化-Akt。

接下来，我们测试了TORC2-Hef1α轴在PTEN转录中的参与。在Hif1α表达载体存在下，用PTEN-Luc报告子和shRictor或shmSin1瞬时转染293细胞。正如预期的那样，shRictor或shmSin1的表达抑制了荧光素酶的活性(图9,E–H（E–H）). Hif1α的过度表达阻止了shRictor或shmSin1诱导的报告活性抑制(图9,E–H（E–H）). 这些结果最终证明，TORC2有助于增加Hif1α的表达，从而增强PTEN的表达。

讨论

本研究确立了mTOR活性在TSC2缺乏症PTEN上调中的重要作用(图10). 我们的结果首次证明了TORC1和TORC2通过调节PTEN的表达来控制Akt的激活。最后，我们证明了TORC2参与调节Hif1α转录因子，从而导致PTEN的转录增加(图10).

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图10。

总结我们结果的模式。这个实心箭头指出我们研究中描述的结果。项目实施计划₂，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸。

TSC患者的肿瘤显示S6激酶和4EBP-1的磷酸化增加，这与缺乏TSC2的培养细胞相似，表明TORC1的组成性激活(25,49,53). TORC1活性升高被认为是培养和动物模型中癌细胞增殖的主要驱动因素(34,54). 在mTOR信号增强的人类癌症中检测到TSC2磷酸化增强(55). 然而，最近使用不同mTOR抑制剂的临床试验仅在少数患者中显示出相当温和的抗肿瘤活性(56,57). 这些令人失望的结果可以部分解释为PI3-激酶途径的反馈抑制的释放，类似于在涉及IRS-1的TSC2无效细胞中观察到的反馈抑制。TORC1介导的S6激酶活性增加降低了IRS-1的水平，从而抑制了PI 3-激酶依赖性Akt磷酸化(37,53). 事实上，在TSC2-缺陷细胞中，雷帕霉素阻断S6激酶活性并减轻IRS-1的负调控，导致Akt磷酸化对胰岛素/IGF-1的反应恢复。最近的一份报告显示，包括人类表皮生长因子受体家族成员、胰岛素和IGF-1受体在内的多受体酪氨酸激酶的表达增加，从而酪氨酸磷酸化，以应对慢性Akt抑制(58). 然而，TSC2缺乏时Akt活性降低不足以增加胰岛素/IGF-1信号(37). TSC2缺乏导致Akt磷酸化缺失，以响应多种生长因子，如EGF和PDGF，这些生长因子不使用IRS-1信号(19,39,40,59). 这些结果表明，存在多种反馈机制来调节Akt磷酸化。

最近，我们报道在TSC2缺乏症中PTEN水平显著升高，这阻止了Akt磷酸化(41). 在本研究中，我们表明，用雷帕霉素治疗TSC2-null MEF可减少PTEN蛋白，同时增加Thr-308的Akt磷酸化(图1B类). 该位点的磷酸化由PIP下游的PDK-1介导_三(12). 这一观察结果在生长中的人类293细胞中也得到了证实(图1D类). 总之，我们的结果表明PTEN基因表达位于TORC1的下游。需要注意的是，细胞与雷帕霉素的孵育时间为24小时，这表明许多癌细胞中的TORC2活性下调(29). 然而，在这种孵育条件下，雷帕霉素作为一种经典的TORC1抑制剂，阻断TSC2中S6激酶的磷酸化^−/−MEF和293个细胞(图1,B类和D类). 此外，雷帕霉素增加了Akt在Ser-473的疏水位点磷酸化，同时PTEN下调(图1,B类和D类). 最近已经表明PIP_三调节TORC2的激活(60). 我们的数据表明，由于PTEN的下调，导致PIP增加_三增强TORC2活性以增加Akt在Ser-473的磷酸化。此外，雷帕霉素不抑制TORC2活性。

使用mTOR的激酶缺失突变体进一步加强了雷帕霉素的结果，该突变体模拟雷帕霉素对TSC2-缺陷MEF和293细胞中PTEN表达和TORC1活性的作用(图1,E–H（E–H）). 由于mTOR是TORC1和TORC2的常见激酶亚基，激酶死亡的mTOR预计会阻断这两种激酶复合物的活性。事实上，我们观察到两种TSC2中的TORC1和TORC2活性受到抑制^−/−MEF和表达显性负mTOR的293细胞(图1,F类和H（H）). PDK-1对Thr-308处Akt的磷酸化受PTEN的直接调控(12). 然而，据报道，这种磷酸化受Ser-473磷酸化的调控，TORC2组分的丢失也降低了Akt中这两个位点的磷酸化(35,61,62). 与这些结果相反，我们证明在Ser-473的Akt磷酸化降低的情况下，Thr-308的磷酸化增加(图1,F类和H（H）). 这些结果支持了以下观点：显性负mTOR下调PTEN可增加Thr-308处Akt的磷酸化。此外，对TORC1的抑制也会减轻负反馈回路，导致Thr-308处Akt的磷酸化增加。

与我们用雷帕霉素和激酶读mTOR获得的数据相反，正如我们所预期的那样，我们发现当我们使用mTOR的组成活性突变体时，PTEN的表达增加(图2,A类和B类). 由于TORC1活性增强，该突变增加了S6激酶的磷酸化，导致Akt磷酸化受到抑制(图2B类). 与激酶头突变体不同，组成活性mTOR不影响TORC2活性，因为我们在Ser-473处观察到Akt磷酸化没有增加。相反，磷酸化在组成活性mTOR存在时被抑制(图2B类)表明该突变体仅影响细胞中的TORC1活性。这些结果与Ohne的研究一致等。(43)确定该组成活性突变体在对TORC2无任何影响的情况下，仅上调TORC1活性。

因此，我们的数据表明TORC1参与PTEN的上调，这有助于TSC2缺乏症中Akt的磷酸化降低。TSC2-null MEF和293细胞中猛禽下调的结果进一步支持了这一结论，这表明PTEN蛋白水平降低与Thr-308和Ser-473的Akt磷酸化增加相关(图4,A–C). 这两个位点的磷酸化增加可能是由于PTEN的减弱导致的，PTEN的衰减增加了PIP_三增加PDK-1和TORC2活性的水平(12,60). 另一种可能性是，由于猛禽的下调，在没有TORC1形成的情况下，更多的mTOR激酶可以组装成TORC2。这将导致TORC2在Ser-473处增加Akt的磷酸化。

我们描述了显性负mTOR激酶对293细胞PTEN表达的影响(图1H（H）). 然而，这种突变会影响TORC1和TORC2的活性，这一点可以通过S6激酶和Akt Ser-473的磷酸化降低来证明(图1,F类和H（H）). 因此，TORC2和TORC1可能参与PTEN表达的调控。下调rictor或mS1以特异性阻断TORC2活性确实降低了293细胞中PTEN的水平(图5,A–D). 有趣的是，PTEN水平的降低不足以增加Thr-308处Akt的磷酸化。这可能是由于rictor或mSim1下调导致TORC2形成缺失，从而留下更多mTOR激酶可用于形成TORC1。我们检验了这个假设。用猛禽抗体对来自rictor或mS1下调的293细胞的mTOR免疫沉淀物进行免疫印迹。TORC2各成分的独立下调增加了mTOR·猛禽复合物的形成，表明TORC1的形成增强(补充图S8，A–D). 因此，根据S6激酶的磷酸化判断，下调rictor或mS1可增加TORC1活性(补充图S9，A–D). 已知TORC1活性增加会减少Thr-308处Akt的磷酸化，因为存在涉及IRS-1的负反馈环(37,38,53). 因此，这一现象可以解释我们观察到的在rictor或mSim1表达减少的情况下，Thr-308处Akt磷酸化减少的现象(图5,A–D).

我们的研究表明，TORC1和TORC2对PTEN上调的作用似乎是由于其mRNA水平增加(图1,E类和G公司). 据报道，多种转录因子调节PTEN的转录，包括NFκB、p53和Egr1(47,63,64). 我们在PTEN启动子中鉴定了Hif1α识别元件，并表明该转录因子调节TSC2-null MEF中PTEN的转录(41). 以前，研究表明，TSC2-null MEF中Hif1α蛋白水平的增加是由于组成活性TORC1的存在和5′TOP含量的Hif1 a mRNA翻译增强所致(49,50). 现在我们发现，雷帕霉素和显性负mTOR以及猛禽的下调都阻断了两种TSC2中PTEN启动子的活性^−/−MEF和293个细胞(图3和​和4）。4). 这些结果增加了TORC1敏感性Hif1α调节PTEN表达的可能性。事实上，用雷帕霉素和siRNA介导的猛禽下调处理TSC2-null MEF可降低Hif1α蛋白水平(图6A类和补充图S6)，提示TORC1在PTEN表达中的作用(41). 此外，在本研究中，我们证明了TORC2对TSC2-缺陷MEF和293细胞中Hif1α表达的贡献(图6,D–I型). 我们提供证据表明，由于TORC2对mRNA翻译起始的影响，它调节了Hif1α的TOP介导的翻译(图6,K–米). 事实上，TORC2增加了4EBP-1的磷酸化和eIF4E·eIF4G复合物的形成(图7和​和8）。8). 此外，我们提供了直接证据表明，TORC2介导的Hif1α上调通过增强转录增加PTEN的蛋白水平(图9). 这些数据还表明，TORC1和TORC2具有共同的调控途径来控制PTEN的表达。

我们的结果证明了TORC1和TORC2在调节Akt磷酸化方面的相互关系，正如猛禽和蓖麻的下调所证明的那样(图4,A–C、和​和5，5,A–D). 此外，我们的数据表明，PTEN在TSC2缺陷细胞中的表达增加可能有助于以细胞自主方式降低TSC肿瘤的恶性潜能。由于许多癌症中生长因子信号的增加，TSC2磷酸化和失活很明显。我们的结果表明，雷帕霉素介导的PTEN下调导致Akt磷酸化增加，这是一种新的机制，可以解释为什么不同的TORC1抑制剂在癌症临床试验中不是很有效(56,57). 最后，在TSC患者中，TORC1抑制剂的疗效可能取决于其肿瘤的PTEN状态。

补充材料

参考文献