EMBO J。2012年1月4日;31(1): 14–28.
IAP通过直接靶向Rac1进行降解来调节细胞迁移的可塑性
,1,* ,1,*† ,2 ,1 ,1 ,1 ,三 ,4 ,5 ,6 ,2,9 ,7 ,8 ,8 ,2,9和a、,1
Tripat Kaur Oberoi公司
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
塔内尔·多根
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
詹妮弗·C·霍金
2德国纽赫伯格-穆尼奇发育遗传学研究所Helmholtz Zentrum München
罗尔夫·彼得·舒尔茨
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
朱利安·穆兹
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
卡莉·安德森
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
达格马尔·梅耶尔·祖·赫林多夫(Dagmar Meyer zu Heringdorf)
4德国法兰克福歌德大学医学院Zentrum制药公司
古杜拉·施密特
5德国弗莱堡大学实验和临床药理学与毒理学研究所
南川和彦
2德国纽赫伯格-穆尼奇发育遗传学研究所Helmholtz Zentrum München
9德国不伦瑞克布伦瑞克科技大学动物研究所
格雷戈里·S·哈姆斯
7德国瓦茨堡大学鲁道夫·维丘中心分子显微镜系
亚历杭德罗·卡皮
8德国图宾根图宾根大学细胞生物学跨文化研究所图宾根蛋白质组中心
鲍里斯·马塞克
8德国杜宾根大学杜宾根跨文化细胞生物学研究所杜宾根蛋白质组中心
莱因哈德·Wöster
2德国纽赫伯格-穆尼奇发育遗传学研究所Helmholtz Zentrum München
9德国不伦瑞克布伦瑞克科技大学动物研究所
克里希纳拉·拉贾林加姆
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
1德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG Emmy Noether小组
2德国纽赫伯格-穆尼奇发育遗传学研究所Helmholtz Zentrum München
三德国康斯坦茨大学生物系
4德国法兰克福歌德大学医学院Zentrum制药公司
5德国弗莱堡大学实验和临床药理学与毒理学研究所
6德国法兰克福歌德大学拓扑成像单元
7德国瓦茨堡大学鲁道夫·维丘中心分子显微镜系
8德国杜宾根大学杜宾根跨文化细胞生物学研究所杜宾根蛋白质组中心
9德国不伦瑞克布伦瑞克科技大学动物研究所
一德国法兰克福歌德大学医学院生物化学II研究所DFG埃米·诺特小组,邮编60590。电话:+49 69 6301 5450;传真:+49 69 6301 5577;电子邮件:编辑:2mehcoib@anhsirk *这些作者对这项工作贡献均等
†现住址:美国加利福尼亚州旧金山南部基因泰克癌症信号与转化肿瘤学部
2011年9月20日收到;2011年10月28日接受。
- 补充资料
补充电影S1
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补充电影S2
GUID:BC48CC77-A240-460A-B28B-9EB0249B0654
补充影片S3
GUID:684E14BB-1EB0-4DFF-A861-0027D9FFF6B8
补充电影S4
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补充数据
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图2、4、5、6和7的源数据
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审查过程文件
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摘要
凋亡抑制蛋白(IAP)是一类高度保守的多功能蛋白。Rac1是一种经过充分研究的Rho GTPase,它控制着许多基本的细胞过程。虽然人们对核苷酸与Rac1结合的调控已很清楚,但控制Rac1降解的分子机制尚不清楚。在这里,我们证明了X-连锁IAP(XIAP)和细胞IAP1(c-IAP1)以非核苷酸依赖的方式直接与Rac1结合,以促进其在Lys147的多泛素化和蛋白酶体降解。CNF1毒素处理或RhoGDI耗竭后,Rac1降解也需要这些IAP。一直以来,各种策略下调XIAP或c-IAP1导致原代细胞和肿瘤细胞中Rac1蛋白水平增加,导致细胞形态拉长,细胞迁移增强。此外,XIAP可抵消发育中斑马鱼后脑中依赖Rac1的细胞极化,并促进神经元从正常组织结构中分层。这些观察揭示了IAP在控制Rac1稳定性从而调节细胞迁移和形态发生可塑性方面的进化保守作用。
关键词:细胞凋亡,IAP,Rac1
结果
IAP的缺失导致正常细胞和肿瘤细胞的形态拉长
由于IAP在肿瘤中高度表达,肿瘤治疗的当前策略之一是特异性下调IAP,使肿瘤细胞对常规化疗敏感。为此,开发了大量基于Smac的IAP拮抗剂(Chen和Huerta,2009年;Gyrd Hansen和Meier,2010年). 一类Smac类化合物(BV6,这里称为IAC)已被证明以时间和浓度依赖的方式触发c-IAP的自泛素化,导致某些细胞类型中TNFα介导的凋亡(Varfolomeev等人,2007年;Varfolomeev和Vucic,2008年). 我们最近证实,X-或c-IAP的缺失导致c-RAF的稳定和肿瘤细胞系中细胞的迁移(Dogan等人,2008年). 为了检查IAC治疗是否能再现这些效果,我们用亚致死剂量的IAC治疗了各种癌症细胞系。较低剂量的IAC在HeLa细胞治疗后16 h触发c-IAP1的完全丢失和c-IAP2和XIAP的部分丢失(). 有趣的是,IAC处理的HeLa细胞在接种到富含F-肌动蛋白突起的明胶或胶原基质上时表现出高度拉长的形态(). IAC处理的HeLa细胞嵌入厚厚的胶原蛋白层后也表现出拉长的形态(). 跨阱迁移实验表明,IAC处理的细胞表现出增强的定向细胞迁移(). 这些结果证实了IAP调节肿瘤细胞运动的可塑性。
IAP与IAC的耗竭会导致形态拉长和迁移。(A类)用两种浓度的IAC处理HeLa细胞16小时,并用免疫印迹法监测各种IAP的耗竭。(B类)生长在涂有明胶的塑料盘上的HeLa细胞的相控图像。细胞在DMSO或IAC(5μM)存在下接种15小时(C类)细胞伸长指数如所示(B类). (D类)用LifeAct转染HeLa细胞,对活细胞中聚合的肌动蛋白进行染色。将细胞接种到胶原蛋白涂层板上,用延时显微镜观察形态学变化。(E类)IAC治疗24小时后嵌入厚胶原基质的HeLa细胞的形态学变化。(F类)IAC处理后,HeLa细胞在跨阱迁移室中迁移。然后将迁移的细胞固定并用结晶紫染色。给出了一个典型实验的数据。(G公司)给出了三个独立实验的跨井偏移实验的量化结果(*P(P)<0.05).
IAP的损失导致Rac1水平上升
IAP的丢失可以稳定C-RAF激酶(Dogan等人,2008年)在用亚致死浓度的IAC刺激细胞后,我们检查了细胞中的C-RAF/ERK1/2激活。正如预期的那样,在IAC处理的HeLa和Sbcl2细胞中,C-RAF水平的增加与C-RAF和ERK1/2磷酸化活性形式的一致增加是明显的(补充图S1A和B). 然后我们检查了RAF/MAPK激活是否有助于IAC处理细胞的拉长形态。有趣的是,激活C-RAF/MAPK通路对于IAC介导的定向迁移是必需的,但对于延长的形态则不是必需的(补充图S1C-E). 间充质迁移模式由Rac1的激活或RhoA的失活控制(萨海和马歇尔,2003年). 为了测试这种可能性,我们在IAC处理的细胞中进行了活性Rac1和RhoA下拉测定。与拉长的形态一致,我们在IAC处理的细胞中检测到相对较高水平的GTP-结合活性Rac1(). 有趣的是,我们在IAC处理的细胞中检测到Rac1总水平的适度但可重复的增加(). 正如预期的那样,在IAC处理的细胞中,GTP-结合的RhoA数量减少,而总RhoA水平没有改变(). 由于IAC治疗可导致c-IAP和XIAP在不同程度上下调,我们测试了单个IAP在调节Rac1水平中的作用。有趣的是,当细胞转染c-IAP1和XIAP siRNAs时,检测到Rac1总水平和活性水平增加(). 由于在IAP缺失的细胞中发现总Rac1水平增加,我们测试了IAP直接影响Rac1蛋白稳定性的可能性。正如预期的那样,我们在IAC处理的HeLa细胞中检测到蛋白质增加(约2倍),但Rac1 mRNA水平没有增加(补充图S2A). XIAP或c-IAP1或两者的沉默导致HeLa细胞总Rac1蛋白水平显著增加(;补充图S2B). 这种效应并不局限于HeLa细胞,因为在转染了一组以上靶向XIAP或c-IAP1的siRNA的293T细胞中很容易检测到Rac1蛋白的增加(). 当IAC或siRNAs耗尽IAP时,在其他肿瘤和正常细胞系中获得了相同的结果(补充图S2C–J). 然后我们测试了IAP的丢失是否会导致Rac1蛋白半衰期的延长。XIAP和c-IAP1的联合耗竭增强了HeLa细胞中内源性Rac1蛋白的半衰期().
IAP调节Rac1的稳定性。(A类)用IAC(2.5μM)或DMSO处理HeLa细胞16 h,并用活性Rac1或RhoA的活性GTP-结合形式(C类)如材料和方法中所述沉淀。(B类)显示了控制细胞和IAC处理细胞中总Rac1和活性Rac1水平的量化(通过材料和方法中所述的密度测定)。显示了来自三个独立实验的数据。误差线表示平均值的±s.d。在总裂解物中监测c-IAP1的耗竭以及Rac1和RhoA的总水平。(D类)HeLa细胞转染c-IAP1或(E类)XIAP siRNAs持续48小时,并沉淀GTP结合的Rac1数量。用免疫印迹法监测细胞裂解液中总Rac1的水平。(F类)用各种siRNAs转染HeLa细胞48小时。用western blot检测细胞总裂解物,以监测各种IAP和Rac1的蛋白水平。(G公司)Rac1水平的增加通过密度测定进行量化。显示了三个独立实验的数据(*P(P)<0.05,**P(P)<0.01,***P(P)<0.005). 误差条表示平均值的±s.d。(H(H))用两组XIAP和三组c-IAP1 siRNA转染293T细胞。用western blots监测Rac1水平。提供了Rac1增加的量化。(我)XIAP和c-IAP1的联合丢失提高了Rac1的蛋白质半衰期。用IAC处理转染XIAP siRNAs的HeLa细胞,并向细胞中添加环己酰亚胺,以监测Rac1的蛋白半衰期。(J型)Western blot分析显示野生型(WT)和c-IAP1中Rac1和Ras的蛋白质水平−/−或(K(K))WT和XIAP−/−MEF公司。Rac1和Ras带的信号强度通过密度测定法进行量化,并归一化为肌动蛋白水平。图中可以找到源数据补充数据.
为了进一步证实这些观察结果,我们检查了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),这些成纤维细胞来源于缺乏各种IAP的小鼠。一直以来,在c-IAP1-和XIAP缺陷MEF的早期传代中检测到高水平的Rac1蛋白(). 对Rac1的影响是特异性的,因为相关的小GTPases Ras或RhoA在c-IAP1缺陷或IAC处理的细胞中没有上调(). 这些结果证实了IAP控制Rac1在原代细胞和肿瘤细胞中的蛋白质稳定性。
IAC诱导的拉长形态和细胞迁移需要Rac1
然后我们检查了在IAP缺失细胞中观察到的增强迁移和拉长形态是否需要Rac1。与Rac1水平的增加相一致,XIAP和c-IAP1缺陷的MEF表现出Rac1依赖性的细长形态和增强的细胞迁移(;补充图S3). 有趣的是,c-IAP1缺陷MEF的形态比XIAP缺陷MEF更为细长。然后我们测试了我们在肿瘤细胞系中观察到的表型是否依赖于Rac1水平。短发夹RNA介导的Rac1缺失阻止了IAC诱导的拉长形态(). 正如预期的那样,用Rac1抑制剂NSC-23766对细胞进行预处理后,IAC处理细胞的细长形态和迁移速度大大降低(;补充图S4;补充电影S1,S2系列,第3章,S4系列). 此外,用Rac1抑制剂或Rac1 siRNAs处理HeLa细胞也可以防止IAC处理的细胞在跨阱迁移室中增强迁移(). 这些结果表明,IAP的耗竭导致Rac1的激活和上调,RhoA的失活,进而驱动间充质迁移模式。
Rac1是IAC介导的拉长形态和细胞迁移所必需的。(A类)来自野生型c-IAP1的代表性图像−/−和XIAP−/−MEF生长在玻璃上,并用磷灰石-TRITC染色(红色)。(B类)用野生型和XIAP进行的代表性伤口愈合实验中0、8或10小时的相位对照图像−/−或c-IAP1−/−MEF公司。(C类)用IAC处理表达Rac1或对照shRNAs的稳定细胞系,并用相控显微镜监测形态学变化。显示了来自每种条件的代表性字段以及显示Rac1 shRNA敲除效率的蛋白质印迹。(D类)接种在明胶上的HeLa细胞用DMSO、IAC或IAC+NSC-23766(50μM)处理,并在显微镜下观察不同时间间隔。裁剪的快照来自补充电影如图所示。(E类)用Rac1抑制剂NSC-23766预处理HeLa细胞,监测IAC对跨阱迁移的影响。(F类)跨井偏移实验如所示(E类)通过材料和方法中提到的计算机辅助算法进行量化。显示了三个独立实验的数据(**P(P)<0.01,***P(P)<0.005). (G公司)用对照或Rac1 siRNAs预处理HeLa细胞,监测IAC对跨阱迁移的影响。(H(H))跨井偏移实验如所示(G公司)通过材料和方法中提到的计算机辅助算法进行量化。显示了三个独立实验的数据(**P(P)<0.01,***P(P)<0.005).
IAP直接绑定到Rac1
然后,我们探索了IAP介导的Rac1稳定性背后的分子机制。以前的研究果蝇属DIAP1揭示了Rac1和DIAP1之间的直接相互作用(Geisbrecht和Montell,2004年). 由于IAP高度保守,我们研究了人类IAP是否也能与Rac1结合。IAP–Rac1相互作用可以在内源性水平检测到,因为XIAP和c-IAP1很容易与Rac1共沉淀().In-vitro公司纯化蛋白的结合实验表明,XIAP或c-IAP1与Rac1以非核苷酸依赖的方式直接相互作用(). 相反,GST–PAK1-PBD仅绑定到装有GTPγS的Rac1。这些结果与DIAP1的观察结果一致,表明IAP和Rac1之间的相互作用在进化上是保守的。对XIAP的各种突变体的研究表明,XIAP的RING、UBA和BIR3结构域对于与Rac1的相互作用是可有可无的(). 由于Rac亚型仅在C末端不同,我们检查XIAP是否能与Rac2和Rac3相互作用。In-vitro公司纯化蛋白的下拉实验显示XIAP与Rac2或Rac3之间存在直接相互作用(补充图S5A). 这些结果证实了IAP和Rac蛋白之间的直接相互作用。
IAP可以绑定到Rac1在体外和体内. (A类)Rac1和IAP之间的内源性相互作用。用HGF(100 ng,15 h)刺激生长在10 cm培养皿中的HeLa细胞,并用适当的缓冲液溶解。然后对内源性Rac1进行免疫沉淀,并在SDS-PAGE中解析免疫复合物,并进行免疫印迹,以共同沉淀XIAP和c-IAP1。(B类)In-vitro公司用纯化蛋白进行的结合分析显示XIAP和c-IAP1以GTP/GDP-独立的方式与GST-Rac1结合。GST–Rac1用GTPγS和GDP预处理,以分析核苷酸与IAP结合的依赖性。PAK1-PBD下拉实验证实了核苷酸负载,揭示了GTP特异性结合。(C类)在293T细胞中表达Myc-tagged XIAP或XIAP(1-240)和HA–Rac1后,测试它们之间的相互作用。免疫沉淀实验中抗体的非特异性结合总是通过相应的同型对照进行检查。图中可以找到源数据补充数据.
XIAP和c-IAP-1是Rac1的直接E3泛素连接酶
为了测试IAP是否以蛋白酶体依赖的方式降解Rac1,我们在蛋白酶体抑制剂存在下共同表达IAP和Rac1。事实上,两种不同抑制剂对蛋白酶体的抑制阻止了IAP介导的Rac1降解(;补充图S5B). 先前的研究表明,活化的Rac1易发生泛素依赖性降解,赖氨酸147被鉴定为Rac1的潜在泛素受体(Doye等人,2002年;Lerm等人,2002年;Visvikis等人,2008年). 正如预期的那样,激活的Rac1更容易受到XIAP介导的降解(补充图S5C). 为了测试IAP是否是Rac1的直接E3连接酶,我们检查了Rac1是否可以被c-IAP1(一种强E3连合酶)直接泛素化。Rac1Q61L的泛素化效率更高在体外在c-IAP1指定E2之一的Ubc5Ha在场的情况下,由c-IAP1(). 这些结果表明,Rac1的活化形式是一种更好的泛素化底物,这解释了为什么Rac1Q61L突变体更容易降解。此外,体内在293T细胞中进行的泛素化实验表明,XIAP或c-IAP1的共同表达促进了激活的Rac1的多泛素化,赖氨酸147的突变可以挽救Rac1(). 与这些一致,XIAP或c-IAP1的过度表达导致共表达Rac1的下调,而不是Rac2或Rac1Q61LK147或Rac1 b的下调(补充图S5D–F). 有趣的是,野生型而非c-IAP1H588A的表达增强了活化Rac1的多泛素化体内(;补充图S6A). 一直以来,c-IAP1的RING突变强烈降低了Rac1的衰变率(补充图S6B). 为了进一步证实这些观察结果,我们进行了质谱分析,结果表明c-IAP1和XIAP可以将泛素直接偶联到活化Rac1的赖氨酸147(;补充图S6C和D). 有趣的是,c-IAP1泛素化RacQ61L比Ubc5Ha作为E2酶的XIAP更有效(补充图S6C). 这些结果表明XIAP和c-IAP-1是Rac1的直接E3泛素连接酶。
IAP与Rac1的结合促进Rac1多泛素化和降解。(A类)通过western blotting监测蛋白酶体抑制剂MG132对IAP过度表达影响下Rac1水平的拯救。(B类)c-IAP1直接泛素化Rac1。对具有各种突变的纯化的重组Rac1蛋白进行体外如材料和方法中所述,c-IAP1泛素化。免疫印迹法监测泛素与Rac1的结合。Rac1的较低暴露量如下所示。(C类)XIAP和c-IAP1促进活化Rac1的多泛素化。将Myc–Rac1Q61L或Myc–Rac1Q61LK147R与Flag–IAP和HA–泛素构建物联合转染293T细胞。使用Myc抗体免疫沉淀Rac1Q61L,免疫复合物进行HA(泛素)、Rac1和IAP Flag的western blot。细胞在裂解前用MG132处理6小时。(D类)如中所述,分析了c-IAP1和c-IAPH588A在293T细胞中对Myc–Rac1Q61L的泛素化(C类). (E类)c-IAP1直接在赖氨酸147处泛素化Rac1。重组Rac1Q61L经过体外材料和方法中提到的泛素化反应与c-IAP1。用免疫印迹法监测Rac1蛋白的修饰。(F类)样品来自体外Rac1与c-IAP1的泛素化反应(E类)用胰蛋白酶消化后进行质谱分析。显示了在K147位置携带Gly-Gly修饰的Rac1肽的MS/MS光谱。在744.41处测量三重带电的前体离子的质量,质量偏差为0.08p.p.m.箭头表示检测到肽的凝胶带。图中可以找到源数据补充数据.
CNF1毒素和RhoGDI耗竭介导的Rac1降解需要IAP
然后,我们开始开发一个系统,其中Rac1泛素化和蛋白酶体降解可以在内源性水平上完成。最近的研究揭示了RhoGDI1在调节Rho GTPases的体内平衡中的进化保守作用。Keith Burridge及其同事证明,当siRNAs耗尽RhoGDI1后,包括Rac1在内的几种Rho GTPase以蛋白酶体依赖的方式显著降解(Boulter等人,2010年). 我们测试了在这些设置下,Rac1的降解是否需要IAP。事实上,XIAP和RhoGDI1的联合消耗挽救了这些细胞中的Rac1蛋白水平(). 与这些结果一致,RhoGDI耗竭促进了内源性Rac1的泛素化,而XIAP的共同耗竭可以完全挽救这一现象(). 此外,我们使用了来自肠致病性的纯化CNF1毒素大肠杆菌以Rac1为目标进行降级(Lerm等人,2002年). 用200 ng CNF1毒素处理293T细胞后16小时,Rac1水平降低。正如预期的那样,XIAP和c-IAP1的缺失导致CNF1介导的多泛素化和内源性Rac1的蛋白酶体降解得到挽救(). 这些结果重申了体内IAP在控制Rac1稳定性中的作用。
IAP是内源性Rac1的多泛素化和蛋白酶体降解所必需的。(A类)用对照、XIAP和RhoGDI siRNA转染HeLa细胞。用免疫印迹法监测各种蛋白的水平。(B类)HeLa细胞转染对照、RhoGDI或RhoGDI-XIAP siRNA。免疫沉淀内源性Rac1,并通过免疫印迹监测多泛素链与Rac1的结合。细胞在裂解前用MG132处理6小时以保存泛素化Rac1。(C类)CNF1介导的Rac1降解需要IAP。用200 ng/ml CNF1毒素进一步处理转染siRNAs和/或IAC的293T细胞6小时。监测Rac1和IAP的水平。(D类)如前所述,用CNF1毒素处理转染对照或XIAP siRNAs+IAC的293T细胞。免疫沉淀内源性Rac1,监测泛素结合。细胞在裂解前用MG132处理6小时。图中可以找到源数据补充数据.
斑马鱼菱形唇细胞中XIAP过度表达Rac1失活引起的表型缺陷
为了揭示Rac1和XIAP之间的遗传相互作用,我们利用特征描述了发育中小脑突出增殖区的细胞完整性,即上菱形唇(URL)。最近体内斑马鱼胚胎的延时研究揭示了神经祖细胞极化在该生发区的重要性。这些细胞开始长距离的高度定向集体迁移,最终定居于后脑被盖,随后定居于小脑颗粒细胞层。小脑菱形唇源细胞分别产生若干被盖后脑核神经元和小脑皮质颗粒神经元。因此,这个增殖区与脊椎动物的发育密切相关(Koster和Fraser,2001年;Rieger等人,2009年;Volkmann等人,2010年). 此外,该生发区的神经细胞会引起最常见的儿童脑瘤(髓母细胞瘤),其通过分层扩散到脑室的脑脊液中。由于Rac1也参与脊椎动物小脑发育的调节,我们开始测试XIAP在这一形态发生过程中的潜在作用(Tahirovic等人,2010年). 我们转向稳定的转基因斑马鱼菌株Tg(千克)(atoh1a:Gal4TA4)赫兹平方米在一个无调性1a调控元件,可用于以镶嵌方式在菱形唇细胞中产生转基因的条件表达(Distel等人,2010年). 将Gal4依赖性表达构建物与膜靶向荧光蛋白FynTagRFP-T一起注入单细胞期,驱动显性负Rac1(T17N)变体Tg(千克)(atoh1a:Gal4TA4)hzm2型在48 h.p.f.时对约90%表达Rac1T17N的胚胎和荧光细胞进行分析(n个=62; 六个实验),在后脑心室中观察到荧光菱形唇细胞簇,这可能是由于细胞极性缺陷,而在表达FynTagRFP-T的对照胚胎中很少观察到这种情况(5±6%)(). 引人注目的是,通过使用类似的Gal4依赖的Dr-XIAP/TagRFP-T表达结构,菱形唇细胞中内源性斑马鱼XIAP(Dr-XIAP)表达增加,导致29±13%表达胚胎的后脑室中出现类似的异位簇形成(). 事实上,与表达Rac1T17N的胚胎相比,表达Dr-XIAP的胚胎将细胞簇挤出脑室的数量更少,这并不奇怪,因为Dr-XIAP-介导的Rac1缺失需要几个小时,并且剩余的Racl活性足以确保小脑的正常发育,由于杂合Rac1缺陷小鼠没有表现出明显的小脑畸形(Tahirovic等人,2010年). 然而,许多表达Dr-XIAP的胚胎确实显示出类似于簇内细胞的圆形前体细胞,这些细胞通常位于心室的外周(,白色箭头)。在大约65%的表达Rac1或Dr-XIAP的胚胎中观察到异位簇形成的前体状态,而在未受影响的对照组中只有5%(). 值得注意的是,从组织中挤出的细胞,无论是成簇还是单个,都不仅仅是濒临死亡的细胞,因为大多数异常的Dr-XIAP和dnRac1表达细胞没有用吖啶橙标记(补充图S7A). 为了进一步测试在Dr-XIAP过度表达的祖细胞中观察到的表型是否依赖于Rac1,我们进行了拯救实验,我们生成了额外的双和三转基因表达构建物,以Gal4依赖的方式共同表达膜靶向的FynTagRFP和Rac1或FynTag RFP/Dr-XIAP/Rac1。这些实验表明,仅Rac1的过度表达不会导致菱形唇和小脑发育的明显异常(). 正如预期的那样,Rac1水平同时升高到Dr-XIAP表达能够挽救分层表型,并显著减少斑马鱼后脑脑室脑脊液中Dr-XIAP-诱导的异位细胞簇和圆形细胞的数量,这表明Dr-XIAP和Rac1存在遗传相互作用体内().
后脑菱形唇中dnRac1或XIAP的表达导致细胞分层进入心室。(A类)48 h.p.f.Tg小脑和后脑前部的侧视图(atoh1a:Gal4TA4型)hzm2型表达FynTagRFP-T、FynTag RFP-T/Rac1、FynTagRFP-T/dnRac1或FynTag-RFP-T/XIAP的胚胎。在脑室的脑脊液中,这些细胞要么是孤立的细胞(箭头),要么是成簇的细胞(如箭头所示)。缩写:4th V;第四脑室;A、 前部;cb,小脑;D、 背侧;hb,后脑;P、 后部;五、 腹部。(B类)显示每种情况下具有一个或多个异常TagRFP-T表达细胞簇的胚胎百分比的图表。(C类)显示具有一个或多个分离的圆形TagRFP-T表达细胞的胚胎百分比的图表。对于这两张图,n个=6个独立实验,单向方差分析和Tukey’s事后(post-hoc)测试。**P(P)<0.01,*P(P)<0.05. 误差线表示±标准偏差(D类)斑马鱼XIAP与Rac1结合。兔网织物裂解物中产生的Dr-XIAP经过GST或GST-RacQ61L或GST-RacT17N的GST下拉实验。(E类)在293T细胞中表达Dr-XIAP和Rac1构建物,并在免疫印迹中监测Rac1的降解。(F类)从小鼠永生化小脑颗粒神经元中免疫沉淀Rac1,并用免疫印迹法监测XIAP的共沉淀。(G公司)用XIAP siRNA转染mCGN细胞,并用免疫印迹法监测Rac1总水平的增加。(H(H))IAP介导的Rac1降解的拟议模型。GEF和GAP控制GTP/GDP与Rac1的绑定。XIAP–c-IAP1复合物直接与Rac1结合,并促进多泛素链与活化Rac1的赖氨酸147的偶联体内IAP的丢失使Rac1蛋白稳定,导致正常细胞和肿瘤细胞中的伸长/间充质迁移模式。图中可以找到源数据补充数据.
为了确认Dr-XIAP可以直接调节Rac1,我们测试了Dr-XIAP-Rac1交互。事实上,斑马鱼XIAP以非核苷酸依赖的方式与Rac1强烈结合(). 此外,Dr-XIAP而非GFP mRNA的表达导致斑马鱼胚胎中总Rac1蛋白水平的降低(补充图S7B). 与这些观察结果一致,293T细胞中Dr-XIAP的表达导致人类Rac1的降解().
为了进一步测试XIAP和Rac1能否在URL细胞内内源性水平上相互作用,我们从出生后第4天(P4)的小鼠小脑获得了永生小脑颗粒神经元(CGN)。有趣的是,我们可以在这些细胞中很好地与Rac1共沉淀XIAP(). 此外,siRNA介导的XIAP缺失导致这些细胞内源性Rac1水平增加(). 这些结果揭示了IAP在调节Rac1降解中的进化保守作用。由于XIAP在髓母细胞瘤中高度表达,因此很容易提出,在菱形唇细胞中增加XIAP表达可能会使这些细胞容易形成肿瘤。
讨论
本文报道的工作表明,IAP在控制Rac1的稳定性、组织完整性和细胞迁移的可塑性方面发挥着直接作用。尽管有证据表明Rho GTPase受泛素化和降解调节,但负责Rac1泛素化与降解的E3泛素连接酶尚不清楚(Nethe和Hordijk,2010年). 我们的研究揭示了Rac1降解的分子机制,Rac1是除GEF、GAP和GDI之外的一种重要调控模式。XIAP和c-IAP1都可以将多泛素链直接偶联到活化Rac1的赖氨酸147在体外和体内并靶向它们进行蛋白酶体降解。与这些生化数据一致,RNAi介导的敲除或处理带有IAC的细胞或基因缺失导致这些IAP的生理水平降低,导致内源性Rac1的蛋白质水平增加,导致细胞形态拉长,细胞迁移增强。在这些细胞系中,当细胞被CNF1毒素或RhoGDI耗竭处理时,IAP的丢失也阻止了内源性Rac1的多泛素化,这会促进蛋白酶体降解(). IAP在控制Rac1功能中的作用可能在进化上是保守的,因为先前已经证明DIAP1的过度表达可以防止RacN17介导的边界细胞迁移缺陷果蝇属虽然机制尚不清楚(Geisbrecht和Montell,2004年). 与DIAP1的观察结果一致,我们检测到人类和斑马鱼IAP也可以以非核苷酸依赖的方式与Rac1结合。用GDP或GTP加载Rac1不会影响Rac1与XIAP或c-IAP1的相互作用在体外,表明IAP可能通过其BIR域靶向Rac1-like SET或β-pix的C末端。
我们的数据表明Rac1的多泛素化依赖于c-IAP1的环结构域。然而,仍然需要XIAP,因为XIAP或c-IAP1或两者的缺失导致Rac1蛋白水平的类似增加,这表明这些IAP在控制Rac1稳定性方面没有功能冗余。尽管XIAP和c-IAP1可以在Ubc5Ha存在下直接将泛素链与Rac1偶联在体外,XIAP–c-IAP1复合物可能作为更有效的E3连接酶发挥作用体内招募相同或不同的E2在细胞中泛素化Rac1(). IAP已被证明可以形成同聚体和异聚体(IAPosomes),并且之前已经证明XIAP和c-IAP1之间存在环介导的异构化(Silke等人,2005年;Rajalingam等人,2006年). 最近对c-IAP的另一种底物RIP2的研究也揭示了这些IAP在控制RIP2泛素化中的非冗余作用,支持了IAP-IAP异质体在其底物泛素化过程中的新主题(Bertrand等人,2009年;梅斯等人,2010年). 由于IAP可以合成多种泛素链,因此很有兴趣描述IAP在Rac1上合成的泛素链类型以及为此开发的E2酶。由于IAP可以自动和交叉泛素化自身,因此破译控制特定链共轭和选择底物以调节各种细胞过程的复杂机制确实是一项具有挑战性的任务(Vaux和Silke,2005年).
XIAP–c-IAP1介导的Rac1泛素化可能通过与Caveolin和RhoGDI等其他蛋白质的结合来进行空间调控(Nethe和Hordijk,2010年;). 此外,XIAP和c-IAP1只能以局部方式靶向Rac1的一部分,以调节迁移。RhoGDI缺失主要导致细胞溶质Rac1的降解(Boulter等人,2010年)此过程需要XIAP(). 这也可能导致某些细胞类型在IAP耗竭时Rac1水平的不那么强劲的增加。先前的研究表明,Rac1的降解需要多碱基区(PBR)、核定位、异戊二烯化以及与其他蛋白质如核蛋白α2的结合(Lanning等人,2004年;Pop等人,2004年;Sandrock等人,2010年). 沿着这些路线,有趣的是,c-IAP1被证明定位于许多细胞类型的核室(Samuel等人,2005年;卡地亚等人,2011年). 显然,Rac1–c-IAP1相互作用的时空动力学需要进一步阐明。
由于Rac1控制着众多的细胞过程,确实令人惊讶的是,缺乏单个IAP的小鼠缺乏任何主要表型,这表明Rac1可能存在多余的E3连接酶。例如,RhoA被证明被Smurf1和Cullin-RING泛素连接酶泛素化,Rac1被认为是伴侣客户端(Wang等人,2003年;Chen等人,2009年;Boulter等人,2010年). 我们建议,在没有IAP(XIAP和/或c-IAP1)的情况下,Rac1蛋白水平的增加可以被更通用的“蛋白质质量控制”系统检测和清除,以维持体内平衡。此外,IAP相互交叉调节,众所周知,一个IAP的缺失会导致其他IAP的蛋白质水平增加。在这方面,值得注意的是,在XIAP缺陷的MEFs中观察到的Rac1水平的强劲增加在随后的传代中减少,这可能是由于c-IAP1的上调或伴侣机制的激活。因此,我们预计XIAP-c-IAP-1双缺陷小鼠会出现严重的发育缺陷。
然而,我们对斑马鱼小脑发育的研究揭示了XIAP在调节祖细胞极性中的作用,因为增加XIAP的表达会导致这些细胞的分层,而Rac1的共同表达可以挽救这些细胞。此外,该生发区的神经细胞主要表达Rac1亚型,并产生最常见的儿童脑瘤(髓母细胞瘤),其通过分层扩散到脑室的脑脊液中,这与我们对Rac1功能进行镶嵌操作所观察到的表型相似。值得注意的是,来自髓母细胞瘤(如DAOY或ONS-76)的细胞系表达高水平的XIAP,我们的观察表明,增加XIAP表达可能会使这些细胞易于形成肿瘤。
IAP缺失的肿瘤细胞表现出拉长的形态和间充质运动模式,以Rac1依赖的方式突出跛足。即使在混合形态的细胞中,如WM852细胞,这些效应也很明显,因为用IAC处理这些细胞会进一步增强其细长形态(数据未显示)。由于IAP控制Rac1和C-RAF蛋白水平,一个主要问题是,使用IAP拮抗剂治疗可能会意外地促进肿瘤细胞迁移和转移(尤其是当肿瘤细胞未能发生凋亡时)。然而,这种可能性需要仔细验证,因为Rac1信号影响肿瘤细胞侵袭的顺序阶段(Malliri和Collard,2003年). 此外,间充质迁移模式限制了肿瘤细胞在肺部的定植,因为Rac1信号可以根据细胞/组织背景促进或抑制肿瘤扩散(Malliri和Collard,2003年;Sanz-Moreno等人,2008年). 在这些行中,Lopez等人(2011年)观察到c-IAP1缺失后迁移减少,这可能归因于所用细胞类型的差异以及MCF-7细胞中siRNA-介导的XIAP缺失导致Rac1水平增加(补充图S2H). 此外,IAP的丢失也可以通过稳定C-RAF激酶影响Rho信号(Ehrenreiter等人,2005年). IAP被认为是直接转移基因,Survivin–XIAP异构体被证明可以促进乳腺癌和前列腺癌细胞的肝转移(Mehrotra等人,2010年). 在另一项研究中,XIAP的缺失实际上导致了免疫竞争性小鼠前列腺癌模型中的一种侵袭性疾病(Hwang等人,2008年). 我们目前的观察结果与这些表型密切相关,因为IAP介导的Rac1调节可能有助于Rho-ROCK介导的肿瘤细胞侵袭和转移的病因。
我们的研究也对基于IAP的肿瘤治疗有直接影响,并有助于选择患者使用这类新药进行治疗。由于IAP影响促生存途径,因此有必要对各种肿瘤对亚致死剂量IAC的长期反应进行更深入的研究。总之,我们的结果揭示了IAP在调节Rac1(一种Rho GTPase)方面进化上保守的一面,Rac1影响对许多细胞过程具有根本意义的几种途径。因为Rac1在组织再生中也起着重要作用(Dipersio,2007年),我们提出IAP拮抗剂可能用于治疗组织损伤。
材料和方法
siRNAs和质粒的转染
为了通过RNA干扰沉默XIAP、c-IAP1和Rac1的表达,在转染前至少20小时,将约75 000个细胞/孔接种在12孔板中。使用Hiperfect(Qiagen)或DharmaFECT转染针对各种基因的siRNA和作为阴性对照的干扰对照siRNA®Duo(Dharmacon)或Lipofectamine RNAimax(Invitrogen)转染试剂盒。转染后24小时,对细胞进行胰蛋白酶消化,如果需要,将一半细胞接种在12孔板中的玻璃盖玻片上进行免疫荧光分析,而将另一半接种进行蛋白质印迹分析。细胞在转染后48小时被正常溶解。除非另有说明,我们已经以60 nM的最终浓度转染了siRNAs。本研究中使用了以下siRNA:
XIAP siRNA-1:经验证的siRNA,目录号:SI00299446(Qiagen);
XIAP3′UTR siRNA:靶序列:CTGACTGATCTAATTGTATTA(Qiagen);
c-IAP1 siRNA-1:J-004390-12-0010(靶上Dharmacon加siRNA);
c-IAP1 siRNA-2:靶序列:CTAGGAGACAGTCCTATTCAA(Qiagen);c-IAP1 siRNA-3:J-004390-13-0010(靶上Dharmacon加siRNA);
Rac1小鼠siRNA:Thermo Scientific猫#J-041170-06;
RhoGDI1 siRNA:5′-UCAAUUGACGCUUUCCTT-3′(Sigma-Genosys);
对照siRNA:目录编号:D-001210-01-20(Dharmacon);
Rac1 siGENOME SMARTpool siRNA:目录编号:M-003560-06-0005(Dharmacon);
Rac1 shRNA:(TRCN0000004872;Sigma-Aldrich)CCGGCCCTACTGTTTGACATTACTCGAGATAATTGCAAAGAGAGGTTTT。
携带对照和Rac1 shRNAs的慢病毒颗粒是从Sigma中获得的,稳定的细胞系是按照制造商的说明生产的。
在联合敲除实验中,用最终浓度为60 nM的siRNA转染细胞。
Rac1/RhoA活性检测
用不同浓度的IAC处理HeLa细胞15小时,或用不同的siRNAs转染48小时。按照制造商的说明,使用EZ-Detect™Rac1/RhoA活化试剂盒(PIERCE)沉淀GTP-结合的Rac1或RhoA。
跨井运移实验
如上所述,用siRNAs转染HeLa细胞。HeLa细胞(2×105)或用siRNAs转染36小时的MEF或用不同浓度IAC处理的细胞,如果需要,首先用10μM的U0126处理2小时,然后接种到8μM的跨阱迁移室(Corning,#3422),并用来自小牛皮肤的0.1%I型胶原蛋白(Sigma,#C8919)预涂膜。将无血清RPMI或含10%FCS的RPMI添加到下室,刺激细胞。让细胞迁移12小时或过夜。用棉签刮去膜上部的细胞,将迁移的细胞固定在3.7%(v/v)多聚甲醛中,并用0.4%结晶紫在10%乙醇中染色。对于所描述的所有条件,实验分三次进行。从每个跨孔中,在相控显微镜下以×10倍放大率拍摄了若干图像,并考虑了两个宽场进行量化。如前所述,使用两种特殊算法进行分析(Dogan等人,2008年). 个别照片的分析结果在各种图表中以圆点表示。学生的t吨-进行测试以检查其重要性(*P(P)<0.05,**P(P)<0.01,***P(P)<0.005)。
斑马鱼注射和显微镜检查
斑马鱼的保养如前所述(韦斯特菲尔德,1995年). 斑马鱼胚胎在单细胞期注射表达质粒(每个25 ng/μl,以及编码Tol1转座酶的25 ng/微升mRNA,1.5 nl)。培养的胚胎在48 h.p.f.下筛选表达,脱胆碱,在4%多聚甲醛/PBS中固定过夜,然后冲洗并在4°C下储存在PBS中。为了进行图像记录,将胚胎植入1.2%超低熔点琼脂糖中,并使用蔡司LSM510共焦显微镜记录共焦Z堆栈。对于吖啶橙染色,将转基因表达活胚在48 h.p.f.的条件下浸泡在吖啶橙色(Invitrogen)中1 h,吖啶橙汁(Invitro)在30%达尼奥(Danieau's)、0.15 mM PTU、0.01%特里卡因中以1:1000的比例稀释,在不含染料的培养基中洗涤3×1 min,并如上所述进行包埋和成像。
泛化实验
用于检测Rac1的泛素化体内使用最终浓度为1μg/ml的聚乙烯亚胺(Polysciences)试剂,将myc–Rac1Q61L与HA-Ubi wt、加或不加XIAP、c-IAP1和c-IAP1H588A联合转染293T细胞48小时。细胞在含有50 mM Tris–HCl pH 7.5、250 mM NaCl、10%甘油、1%Triton-X、,0.01%2-巯基乙醇、1 mM原钒酸钠、1.5 mM氯化镁2、25 mM氟化钠、0.01%亮氨酸蛋白酶、0.01%抑肽酶、2 mM胃蛋白酶抑制素和1 mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF),并在旋转器上4°C培养30分钟。在14000转/分的条件下,通过离心15分钟清除裂解液。上清液与适当的抗体孵育15小时。抗原-抗体复合物通过琼脂糖偶联蛋白A/G珠(罗氏)沉淀。用裂解缓冲液清洗小球,并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析结合蛋白。为了避免泛素化蛋白的丢失,细胞在裂解前用10μM蛋白酶体抑制剂MG-132(钙生物化学)处理5-6小时。
根据先前公布的方案进行His–泛素下拉分析(Song等人,2010年). 简单地说,293T细胞与pRK5-myc–Rac1Q61L、pCS2-His–泛素、添加或不添加CMV Flag–c-IAP1在10 cm培养皿中共同转染。细胞在下拉前用MG132处理6小时。转染后48小时,细胞在缓冲液A(6 M胍-HCl,0.1 M Na)中溶解2高性能操作4/NaH(氢化钠)2人事军官4,10 mM咪唑,pH 8.0)和超声波处理。在室温下,每件样品使用50μl平衡Ni-NTA琼脂糖进行3小时的His–泛素下拉。最后,在变性条件下清洗珠子,并将结合蛋白在50μl的2×莱姆利/咪唑中洗脱并煮沸。用抗c-myc抗体对洗脱液进行western blot分析。
In-vitro公司用细菌纯化的Rac1Q61L对Rac1进行泛素化。泛素化反应在泛素化缓冲液(50 mM Tris–HCl,pH 7.5,100 mM NaCl,2.5 mM MgCl)存在下进行2、1 mM DTT)、100 nM c-IAP1(研发系统)、100 nM E1(波士顿生物化学)、150μM UbcH5a(波士顿生物化工)、107μM His-泛素(波士顿生物化学品)、50 mM EDTA、1×Mg-ATP(酶生命科学)、1 U无机焦磷酸酶(Fluka)和50 mM DTT。将反应在37°C下培养1 h。对于western blot分析,使用Laemmli缓冲液停止反应,并使用Rac1抗体(C11,Santa Cruz)观察Rac1。
细胞培养基质
细胞也培养在涂有0.1%(1 mg/ml)胶原蛋白(Sigma,#C8919)或0.1%明胶(Sigma#G2500)或1.6–2.4 mg/ml胶原蛋白(Advanced BioMatrix,#5005)的培养皿或培养板上,用于研究IAC的2D效应。为了测试IACs对3D基质的影响,将HeLa细胞与胶原蛋白(Millipore,#ECM 675)混合,然后根据制造商的说明添加到细胞培养板上。将嵌入基质中的细胞成像以获得3D效果。
致谢
我们感谢Genentech–Roche慷慨提供BV6-IAC化合物。我们感谢Sabine Haeder和Kristina Wagner提供的出色技术援助;Domagoj Vucic、Erez Raz、Richard Marais、Reza Ahmadian、Harald Wajant、Michael Rape和Metello Innocenti用于各种试剂和细胞系;David Vaux、Diep Chau和John Silke善意地提供了各种IAP缺陷MEF;以及P Friedl和E Sahai,为胶原蛋白基质提供建议。我们感谢伊万·迪基克对手稿的批判性阅读和他的支持。这项工作得到了DFG向KR提供的Emmy Noether项目拨款RA1739/1-1以及Helmholtz协会和DFG向RWK提供的资金(KO1949/3-1)的支持。
作者贡献TKO和TD进行了大部分实验,并分析了解释数据。JM、RPS和CLA进行了额外的实验。RKW、JCH和KN进行了斑马鱼实验,并分析了解释数据。CK、DMH、GS、GSH和MR提供了有价值的试剂/材料,并为显微镜/数据分析做出了贡献。AC和BM进行了质谱分析。KR构思设计了该项目,分析了解释数据,并根据所有作者的意见撰写了论文。
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