前列腺癌的整合基因组分析

雄激素受体信号通路成员的常见基因组改变

我们还对AR进行了核心通路分析，AR对正常前列腺的生长和分化至关重要，并导致去势抵抗、转移性疾病的治疗失败(Chen等人，2004年;Tran等人，2009年). 如预期应收账通过突变、基因扩增和/或过度表达很常见，但只发生在转移性样本中（58%，图2A). 然而，AR通路分析（包括一些已知的AR辅激活物和辅抑制物）显示56%的原发灶和100%的转移灶发生了改变(图2A,图S2). 在AR通路基因中，最引人注目的发现是8q13.3的拷贝数增加峰值（与8q24的峰值相距约57兆碱基，通常归因于MYC公司更重要的是）跨越核受体辅激活因子基因NCOA2号机组（也称为SRC2/TIF2/GRIP1型). 百分之十七的肿瘤在该区域广泛生长NCOA2号机组8q时，6.2%的肿瘤（分别占原发性肿瘤和转移性肿瘤的1.9%和24.3%）有局灶性或高水平的位点扩增，并且这些与升高NCOA2号机组转录水平（p值<10⁻¹⁶,图S2A). 除了拷贝数和表达变化外，AR通路的改变还包括NCOA2号机组（2例确认为躯体疾病）以及NCOR2号机组（3个肿瘤），自然保护区1,秋明K2、和EP300型（每个肿瘤1个）。总的来说，8%的原发肿瘤和37%的转移瘤NCOA2号机组表达增益（确定为实验程序中描述的异常表达）或突变(图2A-B). 包括8q的更宽增益NCOA2号机组原发性和转移性肿瘤的改变率分别高达20%和63%。值得注意的是，编码2黑色素瘤和肺癌中也有突变报道，与此处检测到的前列腺突变一起，这些突变聚集在两个高度保守的区域。其中包括已知被磷酸化的富含丝氨酸/苏氨酸的链段（S/T）和介导与组蛋白乙酰转移酶（如CBP和p300）结合的活化结构域（AD1）(黄和程，2004) (图2C). 第三名患者使用A407SNCOA2号机组可能是生殖系的替代（在邻近正常前列腺中检测到的频率较低）。有趣的是，未去势的原发性肿瘤患者NCOA2号机组突变、过度表达或高水平扩增的复发率明显较高(图S2B).

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图2

原发性和转移性前列腺癌雄激素信号通路改变的多样性

A。显示频率的雄激素信号成分的变化应收账在原发性和转移性肿瘤中选择活化剂。变更被定义为具有离群值表达式的变更（如图1B和实验程序），或通过体细胞突变，并解释为激活（红色）或失活（蓝色）。B类雄激素信号基因的总基因组改变率。AR通路（A组）中的11个基因有体细胞突变（黑色、红色）和/或异常表达（过表达或欠表达，见实验程序），其中一个子集是拷贝数改变的结果（灰色、广泛和局部增减一个或多个拷贝，见补充信息). 原发性肿瘤在这11个AR通路基因中至少有一个（左）显示出中等程度的改变，而转移性肿瘤的改变率通常较高（右）。C、。类固醇受体共激活物NCOA2在原发性肿瘤中有两个新的体细胞点突变。这些聚集在黑色素瘤[G435S位于富含丝氨酸/苏氨酸（S/T）调节域]和肺癌[S1024N位于转录激活域1（AD1）]中已知NCOA2点突变的近位点。D类增加NCOA2水平会导致雄激素依赖性AR转录活性增加。将越来越多的NCOA2质粒转染到LNCaP细胞中，导致NCOA2蛋白表达（inset western blot）和ARE-核糖核酸酶报告活性。显示了代表S.E.M（平均值标准误差）的误差条，但代表信号的一小部分，因此不可见。E.公司。非癌原发肿瘤NCOA2号机组增益（定义为拷贝数扩增大于单拷贝增益、异常过度表达或突变）具有较高的雄激素信号（学生t检验，P<0.0001），通过29个雄激素应答基因的独立特征进行评估(Hieronymus等人，2006年). 另请参见图S2.

综上所述NCOA2号机组原发性肿瘤中的增益及其作为AR辅活化因子的已知作用(Agoulnik等人，2005年)提示这两个基因可能通过增强AR转录产物在前列腺癌早期进展中协同作用。我们通过在前列腺癌细胞中以固定内源性非扩增AR水平表达增加的NCOA2来探讨这种可能性(图2D)类似于NCOA2号机组mRNA水平高于整个前列腺癌队列中的平均水平。正如其他工作所预期的那样，当细胞以剂量依赖的方式用二氢睾酮（DHT）处理时，AR转录输出（使用雄激素反应报告结构测量）增加，但在1-10µM之间达到稳定(图2D). NCOA2水平的增加使DHT剂量反应曲线向左和向上移动，表明NCOA2不仅可以启动AR对较低雄激素浓度的反应，而且可以提高AR转录输出的总幅度。根据这些预测在体外数据显示，前列腺癌中的AR转录输出NCOA2号机组基因扩增应该大于没有扩增的。基于AR转录产物的29-基因特征，先前用于进行新抗雄激素小分子筛选(Hieronymus等人，2006年),NCOA2号机组-放大的原发性肿瘤显示AR信号增加(图2E). 总的来说，基因组和功能数据表明NCOA2号机组通过增加AR信号通路在原发性肿瘤中发挥驱动癌基因的作用，AR信号通路已知在早期和晚期前列腺癌中起关键作用。相反，应收账扩增在很大程度上仅限于去势抵抗的转移性疾病，更可能是耐药机制，而不是肿瘤进展的自然步骤。我们还建议NCOA2号机组和MYC公司这两个基因分别在8q13和8q24扩增子上起驱动癌基因的作用。

遗传改变与TMPRSS2-ERG公司

这个TMPRSS2-ERG公司融合是前列腺癌中最常见的一种分子病变(Tomlins等人，2005年). 功能研究TMPRSS2-ERG公司包括转基因在小鼠前列腺中的表达，已显示出适度的致癌活性证据(Carver等人，2009年;King等人，2009年;Klezovitch等人，2008年;Tomlins等人，2008年)这就增加了需要合作活动的可能性。

194例CNA相关肿瘤分析TMPRSS2-ERG公司融合显示了三个重要的拷贝数丢失区域：两个跨越肿瘤抑制因子PTEN公司和TP53型第三个跨越3p14的多基因区(图3A).PTEN公司损失最近被证明与TMPRSS2-ERG公司转基因小鼠和前列腺组织重建模型(Carver等人，2009年;King等人，2009年;Zong等人，2009年). 3p14缺失，其与TMPRSS2-ERG公司更为显著的是，以前没有报道过，并且只涉及8个基因。进一步调查2550个肿瘤和14种肿瘤类型的细胞系（急性淋巴细胞白血病、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质瘤、肝细胞癌、非小细胞肺、鳞状肺、髓母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生性、卵巢癌、肾癌和前列腺癌）该区域的CNAs表明这种缺失仅在前列腺癌中发现(Beroukhim等人，2010年). 事实上，在该区域发现的唯一其他焦点信号是黑色素瘤中的一个扩增子，该扩增子包括小眼相关转录因子(MITF公司)，之前报告的发现(Garraway等人，2005年).

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图3

TMPRSS2-ERG关联删除3p14.1-p13

A。TMPRSS2-ERG基因融合与前列腺癌基因组中的基因组畸变共现，包括编码位点的缺失TP53型（17p13.1）和PTEN公司（10q23.31），以及3p14.1-p13的局灶性缺失（基因按基因组顺序列出；绿线表示具有统计意义的关联，FDR≤1%）。染色体显示在环的周围。B。不同的基因组缺失（杂合和纯合缺失，分别为浅蓝色和深蓝色）以编码8个基因的3p14.1-p13的约2.2mb区域为靶点（见底部）。肿瘤排成一行，其中包含TMPRSS2-ERG融合或PTEN/TP53公司缺失（杂合缺失和纯合缺失分别为黑色和灰色）在右侧被识别。肿瘤根据其缺失位置进行分类，优先影响局灶性丢失FOXP1公司（顶部），RYBP公司和邻近基因上海第一季度（底部），或两个位点同时（中间）。插图显示了总基因组缺失与TMPRSS2-ERG相关缺失的显著性并列的显著性模式（分别为黑色和点蓝色）。C、。根据3p14.1-p13缺失靶向的三个基因的拷贝数状态的转录表达：FOXP1公司,RYBP公司、和上海第一季度，三者都是相关的（如图所示的p值，Anova）。EIF4E3和PPP4R2的表达与拷贝数的丢失也相关，但这两个基因均未被3p14.1-p13缺失所针对。D。随着全基因缺失上海第一季度（b组），我们检测到一个带有CS域P22S体细胞突变的单个肿瘤，在肿瘤的三维结构中用红色表示SHQ1型酵母同源物（3eud）和蛋白质的线性表示（右上角）。此外，基因内缺失（如转移样本PCA0187所示）导致外显子特异性表达缺失，表明发生了截断事件（右下角）。

在我们的前列腺队列中对3p14缺失进行更仔细的检查发现，该区域内存在两个明显的关联峰，加上表达数据和局部缺失模式，仅涉及三个基因：福克斯1,RYBP公司和SHQ1型(图3B、3C). 一些跨越肿瘤的缺失FOXP1公司只有，而其他包括RYBP公司和上海第一季度，但幸免于难FOXP1公司.FOXP1公司编码叉头盒转录因子，在脊髓运动神经元规范以及胸腺细胞早期发育中发挥作用，与多种HOX公司基因(阿伯，2008;Pfaff，2008年). 角色FOXP1公司在乳腺癌和其他癌症中的表达减少，在某些淋巴恶性肿瘤中的表达增加，以及通过易位介导的融合到ERG公司同系物ETV1型至少有一例前列腺癌(Goatly等人，2008年;Hermans等人，2008年;Koon等人，2007年). 此外，最近的证据表明FoxP家族成员FOXP3公司前列腺癌的潜在抑癌剂(Wang等人，2009年).RYBP公司（Ring and YY1 Binding Protein）编码一个多梳组转录阻遏物，与同源发育有关，并可能通过抑制MDM2和随后的p53稳定而作为肿瘤抑制因子(Chen等人，2009年).上海第一季度编码H/ACA核糖核蛋白（RNP）组装的辅助因子，通过与核心RNP亚单位NAP57直接结合。错义突变NAP57标准破坏与SHQ1相互作用的细胞与骨髓衰竭综合征先天性角化不良有关，增加了与癌前综合征的潜在联系(Grozdanov等人，2009年).

为了进一步收集这些基因中任何一个潜在抑癌作用的证据，我们通过外显子重测序寻找点突变。我们在福克斯1或RYBP公司，但在上海第一季度（P22S）位于SHQ1功能所需的CS域的高度保守区域(Singh等人，2009年). 第二个肿瘤的中间有一个缺失上海第一季度导致产生在外显子6截短的异常mRNA物种的基因(图3D). 尽管这些数据进一步暗示上海第一季度作为该基因座的抑癌基因，一些3p14缺失的肿瘤上海第一季度(图3B)这就增加了该区域存在多种肿瘤抑制因子的可能性。

分析物提取和微阵列杂交

从含有70%以上肿瘤细胞的解剖组织以及七个细胞系和七个异种移植物中提取DNA和RNA（参见补充信息). 结果DNA和RNA分别与安捷伦244K阵列比较基因组杂交（aCGH）微阵列、Affymetrix人类外显子1.0 ST阵列和/或安捷伦microRNA V2阵列杂交(表2). DNA拷贝数和表达阵列数据的归一化和统计分析可在补充信息.

DNA测序

共对91份样本中138个癌相关基因的编码外显子和相邻内含子序列中的2.51亿碱基进行PCR扩增，并用Sanger毛细管测序法进行测序(表S5). 还使用iPLEX Sequenom平台对22个基因中95个已知突变位点进行了基因分型。全基因组扩增、测序、突变检测管道、突变验证、背景突变率分析和Sequenom基因分型的详细信息见补充信息.

离群表达式分析

如前所述，所有肿瘤中所有转录物的离群值和离群值赋值是根据规范化表达数据确定的(Ghosh和Chinnaiyan，2009年). 简单地说，在这种非参数方法中，使用29个正常前列腺组织中转录表达产生的经验分布函数来转换肿瘤样本中的表达，根据Benjamini和Hochberg算法中描述的标准确定异常值(本杰米尼和霍奇伯格，1995年)错误率（α）=0.01。

TMPRSS2-ERG公司融合分类

为了进行拷贝数变化之间的关联分析（详见补充信息)，我们仅从aCGH数据中对融合阳性肿瘤进行分类，以最大限度地提高我们仅在CNA数据中检测新关联的能力。如果肿瘤具有典型的21q22.2-3基因组缺失（D₀或D₁>0.9来自RAE分析），在ERG公司和TMPRSS2型分别伴有间质缺失，或在其中一个或两个基因的预期断点位置出现微缺失的样本与基因间二倍体相关。这种方法低估了TMPRSS2-ERG公司通过平衡重排排除肿瘤进行融合。因此，本研究中描述的所有其他分析TMPRSS2-ERG公司使用aCGH和表达数据的病例子集的状态。这里，融合阳性肿瘤是指那些具有上述基因组缺失或根据上述外显子表达阵列推断出的全转录异常表达的肿瘤。我们注意到TMPRSS2-ERG公司使用每个编码序列中预期断点附近的单个外显子表达状态产生了类似的结果。

路径分析

路径图的路径管理和基因选择的详细信息在补充信息为了确定通路改变频率，基因改变通过与正常前列腺相比的上调或下调（异常表达）或通过体细胞非同义突变来定义。如果路径中至少有一个基因发生改变，则认为给定的肿瘤发生了改变。已知频繁缺失或下调的基因突变被认为是失活突变（图中蓝色阴影），而已知频繁扩增或上调的基因突变被认为是激活突变（红色阴影）。此外，使用雄激素刺激的29个基因特征来评估NCOA2获得功能改变（异常过度表达或拷贝数扩增）与雄激素信号的关联(Hieronymus等人，2006年). 通过Student t检验在非去势原发性肿瘤中检验了这种相关性的重要性。

分层聚类

离散化拷贝数变更的无监督分层聚类（收益和损失，A₀和D₀≥ 0.75; 另外，RAE分析中的复制-中性）被分配到统一断点剖面的区域，不包括已知的CNV，使用曼哈顿距离测量和Ward的链接进行。

NCOA2和AR报告分析

对于NCOA2分析，将pCDNA3-NCOA2和PSA-Luc报告基因转染到雄激素保护的LNCaP细胞中（20小时），然后在另一个20小时后进行生长分析（One-Glo）。有关更多实验细节，请参阅补充信息.

这项工作是为了纪念我们的同事和朋友威廉·杰拉尔德，他发起了这个项目。我们感谢A.Viale（MSKCC Genomics Core）、K.Huberman、S.Thomas、O.Aminova（Beene转化肿瘤学核心）、A.Olshen、J.Satagopan（流行病学和生物统计）、L.Vargas、L.Chen（病理学）和A.Gabow（生物信息学核心）的技术援助和支持。这项工作得到了MSKCC前列腺SPORE CA092629和David H.Koch基金会的部分支持。C.L.S.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。