miR-200c通过氧化应激上调，并通过ZEB1抑制诱导内皮细胞凋亡和衰老

miR-200基因家族由H诱导₂O（运行）₂

miR-200c与其他四个额外成员属于miR-200基因家族。miR-200c和miR-141聚集在12号染色体上，而miR-200a、miR-200b和miR-429聚集在1号染色体上。我们确定了整个miR-200家族是否受到H的正向调节₂O（运行）₂我们发现miR-141的诱导作用与miR-200c相似(图3). 另外三个簇成员miR-200a、miR-200b和miR-429也被H诱导₂O（运行）₂尽管水平较低(图3a和b).

在单独的窗口中打开

图3

小时₂O（运行）₂诱导HUVEC中miR-200家族表达。(一)热图表示暴露于200μ月H₂O（运行）₂在指定的时间内。调制用对数2标度（-ΔΔCt）表示。绿色和红色分别表示下调和上调。实验进行了四次，结果相似。(b条)中描述的实验平均结果(一)，使用线性比例显示。在H上₂O（运行）₂治疗miR-141表现出与miR-200c相当的诱导作用，并在暴露于氧化应激16小时后达到峰值水平。其他miRNAs均由H诱导₂O（运行）₂但到了较低的水平，即增加了～3～8倍。每个miRNA的表达水平表示为折叠诱导与未经处理的细胞(n个每个时间点=4；^*P（P）<0.05;^**P（P）<0.01;^***P（P）<0.001; 不显著=不显著）

值得注意的是，miR-200c在HUVEC中表达良好，而其他家族miRNAs几乎无法检测到；因此，miR-200c可能是氧化应激诱导生物反应的主要效应器。

miR-200c调节EC增殖、凋亡和衰老

为了确定miR-200c上调的生理相关性，HUVEC感染了表达前miR-200c或对照序列的慢病毒。我们发现miR-200c过度表达显著抑制细胞增殖(图4a); 与对照组相比，过度表达miR-200c的HUVEC的DNA合成减少支持了这一结果(图4c). 此外，血清剥夺导致细胞数量和溴脱氧尿苷（BrdU）掺入量减少(图4b和c)miR-200c过度表达后进一步减少(图4b和c).

在单独的窗口中打开

图4

miR-200c抑制EC增殖和BrdU掺入。HUVEC感染了编码miR-200c的慢病毒或对照病毒。24小时后，用嘌呤霉素筛选细胞并进行细胞培养。(一)与对照组相比，miR-200c过表达抑制了细胞增殖；在不同的时间点对细胞进行计数(n个每个时间点=5；^#P（P）<0.05;^*P（P）<0.001). (b条)用miR-200c或对照病毒转导的HUVEC在指定时间内去除血清。在不同的时间点对细胞进行计数，两组细胞的数量都呈现出逐渐减少的趋势，这在miR-200c过度表达的细胞中更为明显与控制(n个每个时间点=5；^*P（P）<0.05). (c（c）)用miR-200c或对照病毒转导的HUVEC被剥夺血清或在对照条件下保存40 h。此后，收集细胞前用BrdU脉冲标记30 min，固定，然后用碘化丙啶和α-BrdU抗体。miR-200c过表达降低了BrdU阳性细胞的百分比，并且这种作用在饥饿条件下保存的细胞中得到了放大(n个=3;^#P（P）<0.05;^*P（P）<0.01)

还检测了miR-200c对细胞死亡的影响。在正常生长介质中，miR-200c的过度表达增强了凋亡DNA片段和显示亚倍体DNA含量的细胞百分比(图5a和b); 当细胞处于饥饿状态时，miR-200c的这些作用被放大了(图5a和b).

在单独的窗口中打开

图5

miR-200c诱导EC凋亡和衰老。在感染编码miR-200c或干扰序列（miR-scramb）的慢病毒的HUVEC中评估miR-200c强制表达的效果。在24小时和嘌呤霉素选择后，在最终分析之前，将HUVEC保存在对照培养基或血清中再剥夺40小时。细胞凋亡由以下因素决定(一)细胞DNA片段化(n个=3;^*P（P）<0.05）或(b条)流式细胞术显示碘化丙啶染色细胞亚倍体DNA含量的百分比(n个=3；^#P（P）<0.01;^*P（P）<0.001). miR-200c的过度表达诱导了细胞凋亡，并且这种作用在饥饿条件下的细胞中增强。(c（c）)用miR-200c或对照病毒转导的HUVEC固定并染色以检测SA-β-加仑。miR-200c的过度表达导致SA的强烈增加-β-gal阳性细胞与对照组比较(n个=3;^*P（P）<0.001). (d日)HUVEC用miR-200c或对照病毒转导。选择后，在相同的汇流处将细胞电镀并在8小时后收集。典型的western blot显示miR-200c诱导p21蛋白。实验进行了三次，结果相似。浴缸指示α-微管蛋白

最后，评估miR-200c对增殖的抑制是否也与衰老有关。为此，我们测试了miR-200c过度表达对衰老相关基因的影响β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，这是衰老相关生长停滞的特征，以及p21蛋白的表达，p21蛋白在氧化应激反应中增加，在永久性生长停滞/衰老中起主要作用。¹³在用miR-200c转导的HUVEC中，SA的百分比-β-与对照组相比，gal阳性细胞显著增加(图5c). 此外，mir-200c过度表达显著增强p21(图5d)而另一种衰老相关蛋白p16NK4A没有增加（未显示）。

接下来，我们评估了miR-200c抑制是否能够阻止氧化应激诱导的效应。为此，用抗miR-200c或干扰寡核苷酸转染HUVEC，然后暴露于H₂O（运行）₂导致.miR-200c抑制，就其本身而言，BrdU掺入量略有增加，且H上仍存在这种上调₂O（运行）₂处理(图6a). 此外，抗miR-200c转染的HUVEC中凋亡DNA片段减少，H₂O（运行）₂-处理过的细胞(图6b). 最后，miR-200c阻断也抑制了细胞衰老。事实上，H上调p21₂O（运行）₂在表达抗miR-200c的细胞中部分被阻止(图6c).

在单独的窗口中打开

图6

miR-200c抑制可部分缓解氧化应激诱导的效应。(一)HUVEC被打乱（anti-cr）或anti-miR-200c（anti-miR-200c）LNA寡核苷酸转染。16小时后，细胞与新鲜培养基孵育8小时，然后200小时μ月H₂O（运行）₂将其添加到细胞中额外40 h。然后收集细胞前用BrdU脉冲标记30 min，固定，然后用碘化丙啶和α-BrdU抗体。代表BrdU掺入的条形图显示，与对照组相比，转染抗miR-200c抗体的HUVEC在没有氧化应激和存在氧化应激的情况下DNA合成增加(n个=3；^*P（P）<0.01;^#P（P）<0.05). (b条)用抗填塞或抗200c LNA寡核苷酸转染HUVEC，24小时后，细胞暴露于200μ月H₂O（运行）₂再持续40 h。然后通过测定细胞DNA片段来测量细胞凋亡。转染抗miR-200c抗体的细胞在缺乏氧化应激和存在氧化应激的情况下均表现出凋亡减少(n个=5;^*P（P）<0.01;^#P（P）<0.05). (c（c）)用抗填塞或抗200c LNA寡核苷酸转染HUVEC；24小时后，细胞暴露于200μ月H₂O（运行）₂额外16小时。抗p21的免疫印迹显示，抗miR-200c部分阻止了h引起的p21诱导₂O（运行）₂实验进行了三次，结果相似。浴缸，α-微管蛋白

氧化应激通过miR-200c下调ZEB1蛋白

由于先前的研究已经确定miR-200家族成员调节ZEB1和ZEB2的表达，¹⁴我们检查了H₂O（运行）₂对这些目标的影响。HUVEC暴露于200μ月H₂O（运行）₂在2到24小时内，ZEB1蛋白在8小时时明显下调₂O（运行）₂暴露并持续24小时(图7a). 在接受BCNU治疗的HUVEC中也观察到ZEB1下调，这可以通过NAC预处理来预防(图7b，量化见补充图S2A）。此外，发现H₂O（运行）₂ZEB1 mRNA下调，暴露于h 16 h后达到最低表达水平₂O（运行）₂(图7c); 值得注意的是，ZEB1 mRNA与miR-200c和miR-141诱导呈负相关（比较图1a,​,2,2,​,3三具有图7c). H₂O（运行）₂由于在HUVEC中无法检测到ZEB2蛋白的水平，因此无法确定其对ZEB2蛋白质的影响。相反，ZEB2 mRNA表达，但H₂O（运行）₂效果相对较小，仅在治疗2小时后，与对照组的差异具有统计学意义（补充图S2B）。

在单独的窗口中打开

图7

氧化应激下调ZEB1。(一)HUVEC用200μ月H₂O（运行）₂持续2–24小时，并通过蛋白质印迹分析评估ZEB-1蛋白。氧化应激降低ZEB1；暴露在h中8小时后，这种效果很明显₂O（运行）₂并持续整个24小时的研究过程。这个实验重复了四次，结果相似。(b条)HUVEC在暴露于0.25 mM BCNU 2 h之前用10 mM NAC预孵育或假孵育30 min。典型的western blot显示，BCNU下调ZEB1蛋白，并且通过预处理氧化应激清除剂NAC可以阻止这种降低。这个实验重复了三次，结果相似。(c（c）)HUVEC用200μ月H₂O（运行）₂2~24h，用qPCR定量ZEB1 mRNA；ZEB1最低表达水平与暴露于氧化应激16小时后达到控制(n个每个时间点=4；^*P（P）<0.01;^#P（P）<0.05). (d日)左面板：HUVEC感染了编码miR-200c或miR-scramb的慢病毒载体。24h后，用嘌呤霉素筛选细胞，用qPCR定量ZEB1 mRNA；miR-200c过度表达下调ZEB1 mRNA(n个=3;^*P（P）<0.001). 右面板：HUVEC是用miR-200c或对照病毒转导的。在选择细胞后，在相同的汇流处电镀细胞，并在8小时后收集。典型的western blot显示miR-200c过度表达下调了ZEB1。该实验进行了四次，结果相似。浴缸指示α-微管蛋白(n个=4)

miR-200c-过度表达的HUVEC显示ZEB1 mRNA减少53%(图7d，左面板），而ZEB2 mRNA的减少较小，且无统计学意义（补充图S2C）。正如预期的那样，ZEB1蛋白被miR-200c过度表达下调(图7d，右侧面板）。

ZEB1敲除调节EC增殖、凋亡和衰老

随后，我们询问miR-200c过表达效应是否可以通过ZEB1缺失来重现。为此，HUVEC感染了编码ZEB1特异性shRNA序列或控制序列的慢病毒。我们发现ZEB1敲低显著抑制细胞增殖(图8a)和诱导细胞死亡(图8b). 最后，缺乏ZEB1的HUVEC表现出衰老诱导，显示出较高的SA百分比-β-gal阳性细胞(图8c，左面板），p21蛋白增加(图8c，右侧面板）。此外，在ZEB1敲除的HUVEC中，p16INK4A没有增加（未显示）。

在单独的窗口中打开

图8

ZEB1基因敲除在EC中的功能效应(一)左图：HUVEC感染了携带ZEB1特异性shRNA的慢病毒或对照病毒。24小时后，用嘌呤霉素筛选细胞并进行细胞培养。与对照组相比，ZEB1敲除抑制了细胞增殖(n个=3;^*P（P）<0.05). 右面板：HUVEC被shRNA-ZEB1或对照病毒转导。选择后，将细胞进行电镀，40小时后用BrdU脉冲标记30分钟，然后收集、固定，然后用碘化丙啶和α-BrdU抗体。代表BrdU掺入的条形图显示，与对照细胞相比，ZEB1敲除的HUVEC中DNA合成减少(n个=3;^*P（P）<0.05). (b条)HUVEC用shRNA-ZEB1或对照病毒转导。选择细胞后，进行细胞培养，40 h后检测细胞凋亡。左图：通过细胞DNA片段测定ZEB1缺失诱导的细胞凋亡(n个=3;^*P（P）<0.05). 右侧面板：通过流式细胞术显示亚倍体DNA含量的细胞百分比，ZEB1缺失增加了细胞周期亚G1期的细胞数量(n个=3;^*P（P）<0.05). (c（c）)左幅：接种转shRNA-ZEB1或对照病毒的HUVEC，8小时后固定并染色SA-β-加仑。ZEB1击倒提高了SA的百分比-β-gal阳性细胞与对照组比较(n个=3;^*P（P）<0.05). 右侧面板：代表性的western blot显示，与对照病毒感染细胞相比，感染了编码ZEB1特异性shRNA序列的慢病毒的HUVEC中ZEB1表达降低70%。与对照组相比，用ZEB1特异性shRNA转导的HUVEC显示p21上调。相同的蛋白质提取物在6%SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测ZEB1，在12%上检测p21。该实验进行了三次，结果相似。塔布，α-微管蛋白

由于非靶RNA干扰（RNAi）效应，这些结果不太可能出现，因为其他三种独立的shRNA（ZEB1-a、ZEB1-b和ZEB1-c）也获得了类似的结果，它们有效地抑制了ZEB1的表达（补充图S3）。

miR-200c介导的效应需要ZEB1下调

我们研究了ZEB1下调是否是miR-200c诱导表型的组成部分。为此，miR-200c在HUVEC中过度表达，而ZEB1等位基因缺乏大多数3′-UTR序列（ZEB1Δ），因此，miR-200家族miRNAs不能作为靶点(图9a). 慢病毒表达ZEB1Δ和miR-200c。ZEB1Δ和miR-200c同时表达可促进细胞增殖并显著抑制miR-200c-诱导的凋亡(图9b和c). 最后，ZEB1Δ和miR-200c的共表达阻止了miR-200c依赖性衰老(图9d). 重要的是要强调ZEB1Δ的表达没有影响就其本身而言。

在单独的窗口中打开

图9

ZEB1下调是miR-200-c介导的生长抑制、凋亡和衰老诱导所必需的。将HUVEC与编码miR-200c和ZEB1Δ的慢病毒联合感染2 h。分别与ZEB1△骨干载体（vec）或miR-scramb病毒一起进行miR-200c或ZEB1δ的单一感染。对照细胞同时感染miR-scramb和vec病毒。感染后，让细胞在完全新鲜的培养基中再恢复72小时，无需选择嘌呤霉素，然后进行电镀。(一)代表性的western blot显示，在与miR-200c和ZEB1ΔmiR-200c共同感染的细胞中，ZEB1的表达水平降低了ZEB1，但在表达ZEB1△的细胞中这种作用受到很大抑制。该实验进行了三次，结果相似。浴缸，α-微管蛋白。(b条)与miR-200c过表达细胞相比，联合感染miR-200c和ZEB1Δ的HUVEC的增殖率更高(n个每个时间点=5；^*P（P）<0.001；^#P（P）<0.05). (c（c）)HUVEC感染ZEB1Δ、miR-200c、miR-200 c和ZEB1△或对照病毒。72小时后，细胞被镀上，40小时后通过细胞DNA片段测定细胞凋亡。miR-200c的促凋亡作用被ZEB1Δ的表达所抵消(n个=3;^*P（P）<0.05). (d日)HUVEC感染ZEB1Δ、miR-200c、miR-200 c和ZEB1△或对照病毒。72小时后，接种细胞，8小时后固定并染色SA-β-加仑。miR-200c和ZEB1Δ共同感染的细胞SA百分比下降-β-gal阳性细胞与miR-200c感染细胞的比较(n个=3;^*P（P）<0.001)

H诱导miR-200c的机制₂O（运行）₂

确定H是否₂O（运行）₂-介导的miR-200c上调是转录调控的，我们分析了H₂O（运行）₂-治疗HUVEC。miR-200c和miR-141在一个共同的前体中共同转录（pri-miR-200c-141）。我们发现H₂O（运行）₂处理诱导了pri-miR-200c-141的表达。有趣的是，pri-miR-200c-141诱导的时间进程与成熟物种相似，从2小时开始，6小时达到峰值（比较图10a,图1a和图3). 不幸的是，我们无法在实验条件下检测到miR-200c前体。我们还分析了miR-200c和miR-141共同启动子对H的反应₂O（运行）₂转染程序对HUVEC具有高度毒性，因此本实验在C2C12成肌细胞中进行。miR-200c启动子几乎被H诱导了两倍₂O（运行）₂（补充图S4A）。类似地，在采用的实验条件下，miR-200c RNA显示出类似的诱导水平（补充图S4B）。此外，在两个ZEB1保守结合位点（Z1/2盒）突变的miR-200c启动子与重量（补充图S4A），确认ZEB1/miR-200c基因抑制。¹⁴与此结果一致，H₂O（运行）₂诱导Z1/Z2突变启动子活性没有显著增加，表明H₂O（运行）₂启动子的诱导主要由ZEB1下调介导（补充图S4A）。最后，为了进一步证明ZEB1/miR-200双负反馈环在HUVEC中的存在，我们分析了ZEB1敲除细胞中miR-200家族的表达水平。我们发现ZEB1的抑制作用通过HUVEC中的RNAi诱导所有家族成员上调：miR-200c和miR-141达到最高水平（补充图S4C）。

在单独的窗口中打开

图10

H诱导miR-200c的机制₂O（运行）₂. (一)HUVEC暴露于200μM小时₂O（运行）₂持续2–24小时；pri-miR-200c水平表示为折叠诱导与每个时间点的未处理细胞。小时₂O（运行）₂暴露于氧化应激16小时后，pri-miR-200c表达增强并达到峰值(n个每个时间点=3；^*P（P）<0.001;^#P（P）<0.01;^§P（P）<0.05). (b条)HUVEC感染了编码miR-200c的病毒或对照病毒。选择后，在相同的汇流处将细胞电镀，并用200μ月H₂O（运行）₂然后收集。使用pan-pRb抗体或磷酸-pRb抗体进行免疫印迹。一个典型的western blot显示miR-200c诱导的pRb去磷酸化与H诱导的pR去磷酸化相当₂O（运行）₂灰色箭头表示pRb的低磷酸化形式；黑色箭头表示过磷酸化形式。实验进行了三次，结果相似。浴缸指示α-微管蛋白。(c（c）)HUVEC被打乱（anti-cr）或anti-miR-200c（anti-miR-200c）LNA寡核苷酸转染。16小时后，细胞与新鲜培养基孵育8小时，然后200小时μM小时₂O（运行）₂将其添加到细胞中额外16 h。使用磷酸化pRb抗体的代表性western blot显示，在h₂O（运行）₂与对照细胞相比，抗200c转染细胞的pRb去磷酸化处理较低。(d日)卢比^{液氧磷/液氧磷}用空载体和表达Cre重组酶的腺病毒感染的MEFs用200μ月H₂O（运行）₂16小时后，pRb中miR-200c上调更高^{液氧磷/液氧磷}MEF与卢比^−/−MEF公司(n个=3;^*P（P）<0.01). (e（电子）)HUVEC感染对照（shRNA-ctrl）或干扰逆转录病毒的p53（shRNA-p53）。选择后，用200μ月H₂O（运行）₂在16小时内，p53基因敲除显著抑制miR-200c在h₂O（运行）₂处理(n个=3;^*P（P）<0.001). (（f）)感染48小时后收集感染对照病毒（Ad-null）或编码p53的腺病毒（Ad-p53）（MOI:50）的HUVEC。p53过度表达强烈诱导miR-200c表达(n个=3;^*P（P）<0.001)

随后，我们研究了调节细胞增殖和衰老的pRb是否参与H₂O（运行）₂-介导的miR-200c上调。正如预期的那样，miR-200c过度表达诱导pRb去磷酸化，其水平相当于16 h h₂O（运行）₂暴露，曝光(图10b). pRb磷酸化通过western blotting进行分析，两者均使用pRb磷特异性抗体^7,8以及测量缓慢迁移、低磷酸化形式的pRb的丰度。此外，转染抗miR-200c或干扰寡核苷酸的HUVEC暴露于H₂O（运行）₂持续16小时(图10c). 引起miR-200c抑制，就其本身而言pRb磷酸化略有增加；在H上₂O（运行）₂抗miR-200c转染细胞中pRb脱磷酸化的暴露水平显著低于对照细胞(图10c). 这些数据与我们之前的结果一致，与对照组相比，抗miR-200c转染细胞中BrdU掺入增强(图6a). 由于ZEB1转录已被证明受pRb家族/E2F细胞周期途径控制，¹⁵我们研究了pRb是否与miR-200c上调有关。为此，我们利用携带条件卢比等位基因(卢比^{LoxP/LoxP公司}MEFs），其中两个LoxP位点插入卢比基因。卢比^{LoxP/LoxP公司}感染了表达Cre重组酶（AdCre）的腺病毒的MEF可以切除外显子19，从而产生pRb截短的细胞(卢比^−/−MEF）；卢比^{LoxP/LoxP公司}用不表达Cre转基因的腺病毒感染的MEFs作为对照(卢比^{LoxP/LoxP公司}). 在H上₂O（运行）₂治疗miR-200c增加卢比^−/−MEF明显低于卢比^{LoxP/LoxP公司}MEF，表明pRb在H上调miR-200c中的积极作用₂O（运行）₂(图10d).

鉴于p53在EC对氧化应激反应中的重要性，我们评估了p53是否也与H₂O（运行）₂-介导miR-200c诱导。为此，我们用编码p53特异性shRNA的逆转录病毒或对照病毒感染HUVEC（p53表达参见补充图S5A）。有趣的是，p53基因敲除显著抑制miR-200c在16小时后的上调₂O（运行）₂暴露，曝光(图10e). 然后我们确定p53过度表达是否诱导miR-200c。用编码p53的腺病毒或对照病毒感染的HUVEC（见p53表达的补充图S5B）显示，p53强制表达显著增强了miR-200c水平(图10f).

药物治疗

用以下药物处理细胞。小时₂O（运行）₂（30%wt/wt溶液；Sigma，St.Louis，MO，USA）作为100 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液给细胞；1,2-双（2-氨基苯氧基）。N个-将乙酰半胱氨酸（Sigma）和1,3-双（2-氯乙基）-1-亚硝基脲（Sigma-）溶解在水中。

蛋白质印迹

细胞在含有100 mM Tris（pH 6.8）、20%甘油和4%十二烷基硫酸钠的缓冲液中溶解。蛋白质含量由BCA蛋白质分析试剂盒测定（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国）。然后添加DTT（200 mM）并将裂解物煮沸5分钟。蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离，并按照标准程序转移到硝化纤维素中。以下抗体用于检测感兴趣的蛋白质：抗ZEB1（H-102；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA，USA）；抗ZEB2（H260；圣克鲁斯生物技术公司）；反-α-微管蛋白（Ab-1；癌基因研究产品，加利福尼亚州拉霍亚，美国）；抗p21（C19-Santa Cruz Biotechnology）；抗pRb（G3-245；Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）；抗磷酸-pRb-苏氨酸826（44-576；Biosource International，Camarillo，CA，USA），抗p53（DO1-Santa Cruz Biotechnology）；抗肌动蛋白（AC40，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）。使用GS-710扫描仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和Quantity One软件（Bio-Read）通过密度分析评估表达水平。蛋白质表达标准化α-微管蛋白水平。

表达质粒的产生

为了过表达miR-200c，miR-200c前序列，包括35nt的侧翼序列，被克隆在生态RI和年龄从Sigma购买的plKo.1载体中的I限制位点。

使用的前miR-200c寡核苷酸序列为：正向：5′-CCGGGCTGCCTGACCCAGGTGGCTGGGCTGGCGCCCTCTCTCTACCCAGCGAGTGTTTGGGTGCGTTGGGAGTCTATACTACTGGGTATATGGCCCCTGTCCCTGTGTCAGCACACATCCACTCGCCTCATTTTTG-3′反面：5′-AATTCAAAAATGAGGCGATGTGCTGACAGAGGAGAGGCGCCATTACCCGGCAGATAGAGACTCCCAACCGCAACACTCTGGGTAAGAGCGCGCCCCCCGCCCAGCCCCCCCCTTGGGTCAGGCAGC-3′。通过DNA测序检查结构。

设计了一个不能被miR-200家族miRNAs靶向的ZEB1等位基因（ZEB1Δ）。从pCI-Neo-ZEB1中切下ZEB1 cDNA³⁶使用Xho公司我和Xba公司我和克隆人之间萨尔我和Nhe公司pRRLsin中的I限制性位点。幻灯片演示文件。CMV公司。MCS公司。MM.Wpre使用标准程序。因此，删除了ZEB1 cDNA（NM_030751.5）的最后2552 bp，包括miR-200家族成员的结合位点。

慢病毒感染

使用标准程序制备慢病毒上清液。³⁷简单地说，用慢病毒上清液感染HUVEC 2 h，然后在完全新鲜的培养基中再恢复24 h。然后，在含有嘌呤霉素的培养基（0.5μg/ml，Sigma）添加到细胞中。

任务shRNA慢病毒对照和ZEB1特异性结构物购自Sigma。

ZEB1 shRNA序列为：shRNAZEB1:5′-CCGGGCTGTTGTTCTGCCAAACAGATCTCTCGACAGAGAGAGACATTTTTT-3′shRNAZEB1-a:5′-CGGGCTGCCAAAAGCAAACGAGAATCGTTCTTATGGCAGCTTTT-3’shRNAZEB1-b:5′-CCGGCTCTCTGAAAGACACACATCTGAGAGTAATGTCGAGAACAGAGATCTT-3′shRNAZEB1-c:5′-CGCGCAAGCAAGAGAGAGAATCTTACATTTT-3 TATTGCGCGTTTTT-3′。

miRNA过度表达

使用miR-200c前体慢病毒上清液通过慢病毒感染产生稳定表达miR-200c或miR-control的HUVEC（参见上述方法）。感染miR-200c慢病毒的HUVEC显示miR-200c的表达是对照组的5000倍以上。

通过与两种慢病毒上清液共同感染细胞2 h，产生HUVEC共表达miR-200c和ZEB1Δ。对照细胞与miR-scramb序列和ZEBΔ骨干载体（pRRLsin.PPT.CMV.MCS.MM.Wpre）上清液共感染。使用miR-200c或ZEB1Δ与pRRLsin进行单次感染。第页。CMV公司。MCS公司。MM或miR-加扰病毒分别培养2 h。然后，让细胞在完全新鲜的培养基中再培养72 h，无需选择嘌呤霉素。western blot和qPCR分别证实ZEB1和miR-200c的过度表达。

逆转录病毒感染

将pSUPER或pSUPER-shRNA-p53（Carlo Gaetano博士和Stefania Mattiussi博士的礼物，意大利罗马皮肤病研究所）转染Phoenix-ampho细胞（美国型培养物收集）。转染后48和72小时收集含有新出现的逆转录病毒的培养基。然后感染HUVEC并用含嘌呤霉素的培养基（Sigma；0.5μg/ml）。

腺病毒感染

如前所述进行腺病毒感染。⁷用Ad-null和Ad-p53感染HUVEC每个细胞50个斑块形成单位，再培养48小时，然后收集。

抗miRNAs

用siRNA转染试剂（Santa Cruz Biotechnology）在40%融合的HUVEC（5000/cm）中转染针对miR-200c或控制序列bgv（Exiqon）的锁定核酸寡核苷酸²)最终浓度为40 nM。16小时后，细胞与新鲜培养基孵育8小时，然后200小时μ月H₂O（运行）₂将miR-200c添加到细胞中额外40 h。通过qRT-PCR评估转染抗miR-200c的HUVEC中miR-200b的表达水平，并与对照序列转染的细胞进行比较。miR-200c表达水平为对照组的68±0.08%，P（P）<0.05.

流式细胞术

HUVEC与20μM溴脱氧尿苷（Sigma），然后用70%乙醇固定。使用Becton Dickinson流式细胞仪（美国新泽西州富兰克林湖Becton Deckinson），通过BrdU和碘化丙啶联合染色进行细胞周期分析。使用Cell Quest软件测定BrdU阳性细胞的百分比。

细胞凋亡测定

根据制造商的说明，通过细胞死亡检测Elisa（Roche，Basel，Switzerland）测量细胞DNA凋亡断裂过程中产生的核小体数量来评估细胞凋亡。

衰老相关β–半乳糖苷酶染色

在使用嘌呤霉素进行选择后的第4天，根据制造商的说明，使用表达前miR-200c或干扰对照的慢病毒载体感染HUVEC，并使用衰老细胞染色试剂盒（Sigma-Aldrich）进行固定和染色。简单地说，接种后8小时，用β-半乳糖苷酶染色液在37°C下再放置24小时。通过添加PBS停止反应，并对至少600个细胞进行评估β-半乳糖苷酶表达。作为阳性对照，感染对照病毒的HUVEC被剥夺血清64小时。

miRNA和mRNA定量

使用TRIzol（英国佩斯利Invitrogen）和TissueLyser系统（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）提取总RNA。使用TaqMan定量实时PCR（qPCR；每次1 ng）分析miRNA水平，并使用ABI Prism 7000 SDS（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行定量。

miR-200c、miR-200a、miR-2002b、miR-429、miR-1、miR-147、miR-16引物以及逆转录酶和qPCR反应试剂均来自Applied Biosystems。Pre-miR-200c引物由Applied Biosystems定制生产（测定ID:CSX0ZQL）。

在本研究的实验条件下，miR-16不受H₂O（运行）₂（见补充表S1）。使用SYBR-GREEN qPCR方法分析mRNAs水平（每个分析5 ng，Qiagen），并使用ABI Prism 7000 SDS（Applied Biosystems）进行定量。使用比较Ct法计算相对表达（2^–ΔΔCt).³⁸β-2-微球蛋白（B2M）水平的mRNA表达标准化。

以下引物用于SYBR-GREEN实时PCR：ZEB1人：正向：5′-GGGAGAGCAGTGAAAGAGA-3′反向：5′-TTTTCTCCCTTTCTG-3′。ZEB2人：正向：5′-AAGCCAGGAGATCAC-3′反向：5′-CCACACTCTGTGCATGAACT-3′。B2M人类：正向：5′-TTCTGGCCTTGGAGGCTATC-3′反向：5′-TCAGGAAATTTGACTTCCATTC-3′。Pri-miR-200c-141：正向：5′-CTTAAGCCCCTCGTCTCC-3′反向：5′-AGGGGTGAAGGTCAGAGGTT-3′。

动物模型和手术程序

所有实验程序均符合意大利国家卫生研究院指南和《实验动物护理和使用指南》（美国马里兰州贝塞斯达国家科学院实验动物资源研究所），并得到了机构动物护理和利用委员会的批准。2至3个月大的129 Sv-Ev p66诱发后肢缺血^ShcA公司重量和p66^ShcA−/−除p66外，具有相同遗传背景的雄性小鼠^ShcA公司轨迹。³⁹小鼠，129 Sv-Ev p66^ShcA公司wt和−/−通过腹腔注射2%阿维汀盐水进行麻醉，25μl/g体重（阿维汀：1 g/ml 2,2,2-三溴乙醇第三种-戊醇，西格玛）。如前所述，左股动脉剥离导致后肢缺血。²在手术后的不同时间收集内收肌和胫骨前肌进行RNA提取。

荧光素酶活性测定

在两个ZEB1结合位点（Z-box）突变的hsa-miR-200c启动子荧光素酶质粒和hsa-miR-200c启动子荧光素酶质粒是Thomas Brabletz博士（德国弗莱堡弗莱堡大学）的馈赠。⁴⁰

Fugene6（Roche）转染C2C12成肌细胞，其中1μg pGL3-hsa-miR-200c启动子结构或1μg pGL3-hsa-miR-200c启动子Z1/Z2突变质粒和200 ng pRL-null肾素荧光素酶编码质粒。转染C2C12后36小时，用200μ月H₂O（运行）₂根据制造商的说明，使用协同HT光度计（Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA），对细胞提取物进行双重荧光素酶检测（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。根据肾素荧光素酶活性对数值进行标准化。

这项工作得到了Ministero della Salute的部分支持（R.C.07-1.13，RF07-56.1，RC4.01，RF07 85.1，RF07 onc 26.1，RFS07）。