Alpha-Synuclein的表达增加通过抑制细胞内吞后突触小泡重新聚集减少神经递质释放

α-突触核蛋白过度表达抑制突触小泡胞吐

为了确定αsyn表达增加是否影响突触小泡循环，我们对转染神经元进行场刺激，并对VGLUT1-pHfluorin成像。与对照组相比，过度表达野生型αsyn的神经元由于刺激而荧光增加较少(图1A,S1D、E). 自从αsyn被证明在酵母分泌途径的早期破坏膜运输以来(Cooper等人，2006年;Gitler等人，2008年)，我们使用NH₄Cl使酸性细胞内室碱化，并显示出细胞内猝灭的VGLUT1 pH氟的池。图1B结果表明，两组受试者的总数没有差异，因此无法解释受试者对刺激反应的差异。绘制所有响应的频率作为ΔF/F的函数₀，αsyn的过度表达将整个峰值向左移动(图1E)，表明对所有突触的胞吐都有影响，而不是一个离散的亚群。

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图1

α-突触核蛋白过度表达抑制突触小泡胞吐

（A） 与野生型人类αsyn或空载体共转染的神经元在10 Hz刺激60 s期间和之后VGLUT1-pHfluorin荧光变化的时间进程。用50 mM NH碱化₄Cl显示总VGLUT1-pHfluorin（箭头）。n=3个盖玻片，每种情况60磅。（B） 通过添加NH显示VGLUT1-pHfluorin的总荧光₄Cl表明，αsyn的过度表达不会改变报告蛋白在所有突触小泡上的表达。将值归一化为矢量控制中获得的荧光。（C） 10Hz刺激结束时的内吞率（τ）由单指数拟合确定，且αsyn过度表达没有影响。（D） 峰值ΔF/F₀归一化为载体控制显示过度表达野生型αsyn.*的细胞减少，αsyn与对照组的p＜0.05，双尾，非配对t检验。对于B–D组，n=9个盖玻片，每种情况下180个神经末梢和3个独立转染。（E） 峰值ΔF/F的频率直方图₀10 Hz刺激60 s后，从大量突触中提取。n=9个来自3个独立转染的盖玻片，1809个用于载体，1428个用于αsyn（F）野生型或α-突触核蛋白敲除小鼠海马神经元在10 Hz刺激60 s期间和之后VGLUT1-pHfluorin荧光变化的时间进程。n=3个盖玻片，每种情况60磅。（G） 峰值ΔF/F₀在10 Hz 60 s刺激归一化为总突触小泡池大小后（通过添加NH显示₄Cl）在野生型和αsyn KO或α/β双KO神经元之间无显著差异。n=6个盖玻片，每种情况下120个神经末梢，2个独立的转染。数值代表平均值±SEM。

然后我们使用VGLUT1-pHfluorin报告器对突触小泡周期的其他方面进行成像。αSyn过表达不影响刺激后荧光衰减的时间进程(图1C)，不包括对代偿性内吞作用的影响。然而，α-syn也不能改变因胞吐而引起的荧光增强速率。相反，峰值ΔF/F的定量₀显示了αsyn对突触小泡胞吐的程度而不是速率的特殊影响(图1D). 在VGLUT1-pHfluorin在细胞表面积累到足以检测其内在化的水平之前，人类αsyn过度表达的影响也在刺激早期出现(Voglmaier等人，2006年)进一步排除了刺激期间可能发生的对内吞作用的影响(Ferguson等人，2007年).

由于大多数神经元表达大量内源性αsyn，我们在αsyn敲除（KO）小鼠出生后的海马培养物中也过度表达了人类蛋白(Abeliovich等人，2000年). 人类αsyn对诱发的突触小泡胞吐作用的影响与大鼠海马培养物中的作用大致相同(图S1F). 为了更直接地确定内源性α-syn是否影响释放，我们还将VGLUT1-pHfluorin单独转染到α-syn-KO小鼠和野生型室友的出生后海马培养物中。KO显示出增加诱发发射器释放的趋势，但差异没有达到统计学意义。在相同的实验范式中，αsyn的过度表达对递质释放的影响大于synuclein的丢失。

抑制α-突触核蛋白转基因小鼠的突触传递

确定αsyn是否影响突触传递体内我们用电生理学方法记录了过度表达野生型人αsyn的转基因小鼠急性海马脑片的突触后反应。使用朊病毒启动子序列产生，该序列驱动神经元中广泛的αsyn表达(图2A)通过定量西方分析，转基因小鼠表达的αsyn约为内源性的3倍，抗体可识别啮齿动物和人类αsyn(图2B、C)非常类似于文化中的过度表达。我们也没有观察到明显的病理学或光学显微镜下的αsyn-immunoactive沉淀物，或western分析中的αsyn免疫活性聚集物(图S2). 利用转基因动物和野生型同窝动物的海马切片，我们记录了CA3 Schaffer侧支在CA1放射层树突上形成的突触的场兴奋性突触后电位（fEPSP）。在一系列刺激强度下，转基因小鼠的基线传播率明显低于野生型(图2D)，并且抑制的程度类似于在培养物中观察到的αsyn过度表达。为了确定这种减少是否反映了突触前效应，我们测量了配对脉冲比率（PPR）。Schaffer侧支循环因残余Ca而表现出促进作用²⁺在终端中，抑制释放的操作通常会增加PPR。与突触前机制一致，我们观察到PPR小而显著的增加(图2E). 此外，突触核蛋白的过度表达降低了自发释放的频率，而不影响量子大小(图2F). 因此，对脑片中突触传递的分析有力地支持了分离培养中观察到的受损突触小泡胞吐的生理意义。

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图2

转基因小鼠α-突触核蛋白过表达抑制突触传递

（A） 使用15G7抗体对3周龄转基因小鼠（tg）和野生型（wt）窝鼠的大脑切片进行双重染色，以检测人类αsyn，并使用识别突触蛋白I和II的抗体检测突触蛋白。（B） 使用肌动蛋白抗体和鼠和人αsyn的syn-1抗体，对αsyn转基因小鼠和wt窝鼠的皮层或海马提取物（10μg）进行免疫印迹，共三次。（C） B所示的西方分析定量表明，转基因小鼠中α-突触核蛋白的过度表达约为3倍。每只动物的样品一式三份，在同一个印迹中检测到syn-1免疫反应归一化为肌动蛋白。n=3只动物（D）来自3-5周龄转基因小鼠和野生型同窝鼠CA1放射层的代表性fEPSP示踪，以应对Schaffer侧支的增加刺激（左）。纤维束振幅与fEPSP斜率的输入-输出曲线显示，αsyn转基因小鼠的突触后反应显著低于野生型同窝小鼠（右）。通过双尾t检验，所有点p<0.005；n=44片wt，48片转基因小鼠，来自11只小鼠，在CA1放射层对Schaffer侧支循环的配对脉冲刺激（刺激间隔40 ms）的每个（E）fEPSP反应。左面板显示了野生型（顶部）和转基因动物（底部）切片中记录的具有代表性的fEPSP。非配对双尾t检验p<0.05；n=体重为45片，转基因小鼠为47片。（F） αsyn转基因过表达降低了自发释放频率（右），但不降低mEPSC振幅（左）。数值代表平均值±SEM。

α-突触核蛋白抑制中脑多巴胺神经元突触小泡胞吐

由于黑质多巴胺神经元的缺失是帕金森病的一个决定性特征，我们还将人类αsyn与VGLUT1-氟共转染到大鼠腹侧中脑的出生后培养物中，这些培养物确实被证明可以释放谷氨酸和多巴胺，并表达相关的亚型VGLUT2(苏尔寿等人，1998年;Dal Bo等人，2004年). 这些培养物通常含有90%以上的多巴胺神经元，但所有的盖玻片都经过固定和免疫染色，以供TH选择儿茶酚胺香精进行分析(图3A). 与海马神经元类似，过表达αsyn的多巴胺神经元与对照转染多巴胺神经元相比，突触小泡胞吐较少(图3B). 这种效应似乎大于海马神经元，但这可能反映了多巴胺神经元释放特性的差异，而不是αsyn的不同效应。事实上，多巴胺神经元的突触小泡循环特性仍不清楚，而且由于αsyn过度表达的总体影响在两种培养系统中似乎相似，我们进一步描述了海马神经元的机制，在晚期PD和路易体痴呆中通常表达αsyn并积累蛋白质(Braak等人，2003年).

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图3

α-突触核蛋白抑制中脑多巴胺神经元突触小泡胞吐

（A） 将与VGLUT1-pHfluorin和人类αsyn或空载体共同转染的出生后中脑神经元培养为14-21 DIV，并使用人类特异性αsyn抗体15G7对人类αsym进行免疫染色，使用GFP单克隆抗体对VGLUT1-pHflucorin进行免疫染色以及使用多克隆抗体对酪氨酸羟化酶（TH）进行免疫染色。箭头表示TH⁺表达VGLUT1-pHfluorin的酒石酸，有或没有人αsyn。比例尺=5μm。（B） TH对10 Hz刺激60 s的响应时间过程⁺表达VGLUT1-氟和野生型人αsyn或空载体的神经元。插图，峰值ΔF/F₀值标准化为转染空载体的细胞的反应。p<0.001，n=7个盖玻片，载体116个神经末梢，2个独立转染的αsyn盖玻片8个，神经末梢84个。数值表示平均值±SEM。

α-突触核蛋白的过度表达减少了容易释放和循环的突触囊泡池

αSyn可能干扰突触小泡的动员、启动、对接或融合。为了评估融合的影响，我们检测了停靠并准备胞吐的囊泡的释放（即易释放池，RRP）。以30Hz刺激3s，选择性激活RRP(Pyle等人，2000年)αsyn过表达抑制释放的程度与长时间刺激相同(图4A). 高渗蔗糖的反应也被用来定义RRP(罗森蒙德和史蒂文斯，1996年)但折射率的变化使成像复杂化。因此，我们使用液泡H⁺-ATP酶抑制剂bafilomycin可防止胞吐后的小泡再酸化，并在添加高渗蔗糖之前和细胞返回等渗培养基之后对细胞进行成像。使用这种方法，αsyn也会降低峰值荧光(图4B)支持αsyn对RRP的作用。因为高渗蔗糖的释放不需要钙(罗森蒙德和史蒂文斯，1996年)αsyn对突触小泡胞吐的影响不涉及钙进入或敏感性的改变。

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图4

α-突触核蛋白减少突触小泡的循环池

（A） 与VGLUT1-pHfluorin和人类αsyn或空载体共同转染的海马神经元以30 Hz的频率刺激3 s，以特异性激活容易释放的突触小泡池。n=3个盖玻片，每种情况60次。插图，峰值ΔF/F₀根据载体控制中的响应标准化的值显示，过度表达人αsyn的细胞数量显著减少。n=6张盖玻片，每种情况下120磅，来自2次独立转染。通过双尾非配对t检验，p<0.0001。（B） 表达VGLUT1-pHfluorin的神经元在1μM bafilmycin的存在下，用含有500 mM蔗糖的Tyrode溶液刺激，以防止内化小泡的再酸化，并在刺激前后在没有蔗糖的情况下成像（以避免因折射率变化而变形）。ΔF/F的变化₀归一化为矢量控制显示过度表达人类αsyn的神经元减少。n=9个盖玻片，每种条件180磅，来自3个独立转染。双尾非配对t检验p<0.05。（C） 转染αsyn-IRES2-GFP或IRES2-GFP的海马神经元通过10 Hz刺激加载15μM FM 4-64 60 s，在染料中再维持60 s以允许完全内吞，并在10 Hz脱染120 s之前进行广泛清洗。n=3个盖玻片，α同步转染者71个，载体73个神经末梢。αsyn过表达降低了可释放染料摄取量（插图）。p<0.05，n=6个盖玻片，αsyn-over表达细胞153个bouton，载体控制208个booton，来自2个独立的转染。（D） 将转染VGLUT1-pHfluorin和人类αsyn或空载体的海马神经元在1μM巴非霉素存在下以10 Hz刺激150 s，以显示完整的循环池，然后用NH处理₄Cl（箭头）以揭示总突触小泡池。n=每种情况下3个盖玻片中的60个鲍顿（E）左面板培养物像在C中一样被转染和刺激，但对照组在1 mM和2 mM Ca的存在下被刺激²⁺.n=每种情况下从3个盖玻片中取出60磅。右侧面板-峰值ΔF/F₀添加NH之前₄Cl（归一化为2 mM Ca²⁺对照组）显示过量表达的αsyn减少，但在1 mM Ca中刺激的对照Bouton没有显著减少²⁺通过Tukey的事后检验进行单因素方差分析，p<0.01，对于2 mM Ca中的载体，p>0.05²⁺相对于1mM Ca中的载体²⁺，2 mM Ca中载体的p<0.01²⁺与2 mM Ca中的αsyn²⁺1 mM Ca中载体的p<0.05²⁺与2 mM Ca中的αsyn²⁺n=每种情况下6张盖玻片中的120磅，以及2次独立转染。数值代表平均值±SEM。

αsyn降低RRP表明融合事件时或接近融合事件时突触小泡胞吐功能有缺陷，但也可能是由于可用小泡数量减少，而融合速度没有改变。为了区分这些可能性，我们检测了共存αsyn和GFP的神经元或单独GFP对苯乙烯基染料FM4-64的摄取（以鉴定转染细胞）。在以10 Hz刺激加载60 s，并在染料中再孵育60 s以允许完全内吞后，通过10 Hz刺激卸载神经元120 s。第二次刺激释放的染料量提供了可释放的囊泡池（循环池）的测量值。表达αsyn的Boutons显示特定FM染料摄取量减少约50%(图4C)然而，染料流出率不受αsyn过度表达的影响（载体τ=49.8±9.5 s，αsynτ=37.9±5.9 s，p=0.32）。因此，αSyn减少了突触小泡循环池的大小，而不影响融合动力学。由于RRP的大小通常与回收池的大小成比例(Mozhayeva等人，2002年)，αsyn对RRP的影响可能反映了回收池大小的减少。

突触小泡循环池的大小也可以通过刺激在H存在下表达VGLUT1-pHfluorin的神经元来测量⁺泵抑制剂巴非霉素。由于巴非霉素阻断了内吞作用后突触小泡的再酸化，长时间的刺激导致未受抑制的报告子在所有经历胞吐作用的突触小囊中积聚，从而揭示了整个循环池。图4D表明αsyn减少了循环池的大小，而NH显示的泡囊池总大小没有变化₄Cl，与使用FM 4-64获得的结果一致。然而，如果刺激持续时间不足以释放回收池中的所有小泡，则释放速度减慢可能会导致回收池大小明显减小。为了解决这种可能性，我们确定了一种外部钙浓度，它可以将初始荧光增加速率降低到αsyn过度表达时观察到的速率。以1 mM Ca计²⁺，对照细胞（表达VGLUT1-pHfluorin，但不表达人类αsyn）的初始荧光增强速率与表达人类αsyn的细胞非常相似，但随着巴非霉素刺激时间的延长，显示在2 mM Ca中循环池大小接近对照细胞²⁺(图4E). 相反，表达αsyn（2 mM Ca）的细胞的循环池²⁺)永远不要接近控制。因此，α-syn过表达专门降低了回收池的大小，而不是融合率。

抑制递质释放需要突触核蛋白的N末端膜结合域，并显示出对突触核素表达的线性剂量反应

转染的人αsyn抑制突触小泡胞吐的能力为识别相关序列提供了一个实验上易于控制的系统。首次评估了与家族性帕金森病相关的三点突变的影响(Polymeropoulos等人，1997年;Kruger等人，1998年;Zarranz等人，2004年)包括A30P突变，此前已证明该突变破坏了αsyn的膜结合和突触定位(Jo等人，2002年;Fortin等人，2004年). 用VGLUT1-pHfluorin转染海马神经元后，A30Pαsyn确实不抑制突触小泡的胞吐(图5A、B)尽管C末端抗体的免疫荧光表达水平相当于野生型蛋白，但该抗体不受N末端A30P突变的影响(图S3). 由于A30P突变破坏了αsyn的膜结合体内(Fortin等人，2004年)膜结合和相关联的突触富集似乎是抑制递质释放所必需的。A30Pαsyn缺乏抑制作用也可作为野生型αsyn的额外控制。与A30Pαsyn相比，其他PD-相关突变体A53T和E46K保留膜结合(Bussell和Eliezer，2004年;Fredenburg等人，2007年)并禁止发射器释放(图5B).

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图5

α-突触核蛋白的N端而非C端是抑制突触小泡胞吐所必需的

（A） 表达载体、αsyn或PD-相关突变体A30P的神经元在10 Hz刺激60秒期间VGLUT1-pHfluorin荧光的时间进程。（B） 峰值ΔF/F₀归一化为载体控制反应表明，A30P突变消除了αsyn对神经递质释放的抑制，但A53T和E46K突变没有影响。通过单因素方差分析，p＜0.0001。通过Tukey的多重比较测试，A30P与野生型的p<0.001。n=180次，每次9次盖玻片，3次独立转染。（C） 与载体控制相比，转染野生型αsyn和C末端截短1–110的神经元也表现出类似的对突触小泡胞吐的抑制。（D） 峰值ΔF/F₀归一化为载体控制反应表明，C末端的缺失对αsyn抑制神经递质释放没有影响。密切相关的亚型βsyn在类似程度上抑制神经递质释放。单因素方差分析显示p<0.01，而1–110和Tukey多重比较测试显示βsyn与野生型的p>0.05。n=每种情况下6张盖玻片中的120磅，以及2次独立转染。数值代表平均值±SEM。（E）在10 Hz刺激60秒期间和之后，转染1.5μg VGLUT1-pHfluorin和1.5μg矢量控制（vec）、1.5μgαsyn或1.0μg矢量和0.5μgαsyn（0.5μgγsyn）的神经元中，VGLUT1-pHflu in荧光变化的时间进程。n=3个盖玻片，每个条件60磅。（F） 峰值ΔF/F₀刺激结束时的价值观。将值归一化为矢量控制条件下的响应。n=3个盖玻片，每个条件60磅。条形图表示平均值±SEM。

αsyn的高电荷C末端被认为与磷脂酶D和肌动蛋白细胞骨架等其他蛋白质相互作用(Payton等人，2004年)，并包含一系列可能影响聚集的潜在磷酸化位点(Chen和Feany，2005年;Smith等人，2005年). 然而，删除最后10、20和30个残基对αsyn抑制递质释放没有影响(图5C、D，数据未显示）。因此，αsyn的N末端足以抑制突触小泡的胞吐，支持膜结合域的主要作用。

我们发现β-synuclein（β-syn）的过度表达也抑制了递质释放，这与高度保守的N末端的作用一致(图5D). 由于大多数神经元表达βsyn和αsyn，因此冗余可能解释了αsyn KO对上述突触小泡胞吐的最小影响。为了测试这种可能性，我们分析了α–/β-syn双KO小鼠，并观察到释放增加的趋势，但没有达到显著性(图1G).

KO和野生型小鼠在这些和以前的实验中的相似性增加了αsyn对突触传递的影响可能需要高水平表达的可能性。由于最初的滴定显示表达与转染的cDNA数量成比例(图S1数据未显示），我们也转染了三分之一正常数量的神经元。这些细胞显示出对递质释放的抑制，但程度低于表达更多人类αsyn的神经元(图5E、F). 在另一组培养物中，我们使用了两倍于平时的αsyncDNA，基本上消除了荧光反应(图S1D). 因此，对突触小泡胞吐的抑制显示出对突触核蛋白过度表达的大致线性剂量反应，远远超出基线水平。除了反对可能暗示毒性的阈值效应外，这种剂量反应还预测，敲除对传输器释放的影响很小，很难检测到高于背景的变化。

α-突触核蛋白对神经末梢生化成分和超微结构的影响

为了确定αsyn的过度表达是否影响神经末梢的生化成分，我们利用转基因小鼠。与培养中少量转染神经元表达人αsyn相反，转基因小鼠中的广泛表达应使任何变化更容易检测。使用西方定量分析，我们发现v-和t-SNARE融合蛋白、钙传感器突触结合蛋白、SM蛋白、rab3和其他功能未知的蛋白如突触素和SV2的数量没有变化(图6). 完整的突触小泡膜蛋白的保存量进一步支持了成像结果，即αsyn对突触小囊数量没有影响(图1A、B) (Rosahl等人，1995年). 然而，我们确实发现突触蛋白（尤其是突触蛋白IIb）和复合蛋白2有特定的减少(图6). 因此，αsyn的过度表达似乎减少了与突触小泡相关的两种外周膜蛋白的数量。

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图6

α-突触核蛋白导致突触蛋白和复合蛋白水平选择性降低

使用荧光二级抗体对α-syn转基因小鼠和野生型同窝小鼠的大脑提取物进行的西方分析表明，突触蛋白（a）和复合蛋白（B）减少。（C） 定量显示许多其他突触蛋白的水平没有变化。n=3只动物/基因型。数值代表平均值±SEM。

我们利用电子显微镜进一步评估过表达的人类αsyn对突触超微结构的影响，由于过表达的相对一致性，我们再次依赖转基因小鼠。与聚集在活性区的野生型小鼠的突触囊泡相比，转基因动物的突触小泡在同一部分含有活性区的囊泡和其他不含活性区的小泡中表现出减少的聚集性(图7B、C). 转基因突触在其他方面表现正常，突触密度没有变化（转基因突触的密度为0.75±0.08，而转基因突触为0.77±0.08末端/10μm²在野生型中，p=0.79），没有聚集物或毒性证据，尽管定量显示转基因小鼠突触后密度略有增大(图7D). 与活体成像和生物化学一致，与活性区相关的突触小泡总数在野生型和转基因之间没有差异(图7E). 然而，囊泡密度显著降低(图7F). 定量囊泡密度作为与活性区距离的函数确实表明，αsyn过度表达减少了活性区附近囊泡的数量，但增加了距离较远的囊泡数量(图7G).

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图7

α-突触核蛋白过度表达破坏突触小泡聚集

（A） 野生型小鼠海马区CA1放射层的电子显微照片显示，末端（T）中聚集的小泡（*）与树突棘（S）的突触后密度密切相关。虽然神经末梢和远端轴突（A）是相对较大的结构，但它们的突触小泡簇（*），使大多数轴浆体未被占据。（B） 在一个具有代表性的性别匹配的转基因兄弟姐妹中，突触小泡在活动区的聚集较少，并占据了远端轴突的全部体积（*）。（C） 转基因小鼠的远端轴突显示突触小泡分散在轴突中。比例尺：100 nm（A–C）。（D） 转基因小鼠的突触后密度稍长（p<0.05，野生型为217，转基因小鼠为199）。与特定活动区（E）相关联的突触囊泡数量的定量显示野生型和转基因小鼠之间没有显著差异（p=0.37，n=199218）。（F） 相比之下，转基因小鼠突触泡中的突触小泡密度相对于野生型显著降低（p<0.0001，野生型为217，转基因小鼠为201）。（G） 带箱子的直方图显示了与活性区的以下距离：1:25–50 nm、2:50–75 nm、3:75–100 nm、4:100–125 nm、5:125–150 nm、6:150–175 nm、7:175–200 nm、8:200–225 nm、9:225–250 nm、10:250–275 nm、11:275–300 nm、12:300–325 nm、13:325–350 nm。n=2714个野生型囊泡和3193个转基因囊泡。齐方检验显示，标有*的箱子p<0.05，标有***的箱子p<0.0001。

活细胞成像

如前所述，在室温（24°C）下于14-21 DIV之间对转基因神经元进行成像(Voglmaier等人，2006年)除非另有说明。为了在更高的生理温度下成像，使用TC-344B双自动舞台温度控制器（华纳仪器）将舞台加热至35°C。图像是在63x1.2NA水物镜和ORCA ER CCD相机（哈马松）的外荧光照明下，使用2×2片上像素拼接获得的。通过手动将4×4个ROI放置在荧光点中心，对单个突触束的荧光进行定量。取这些区域的荧光平均值，减去无细胞体或过程区域的3个ROI平均值，以及荧光随时间的变化分数归一化为初始荧光（ΔF/F₀). 痕迹代表单个实验，其中每个盖玻片选择20个波顿，3个盖玻片的数据取平均值。量化峰值ΔF/F₀每个盖玻片选择20个玻片，从3个独立转染的盖玻片中平均选择9个。所有成像和定量均对转染的构建物进行盲法。

为了使用FM4-64测量回收池大小，将转染有pCAGGS-IRES2-GFP或pCAGGS-αsyn-IRES2-GFP的神经元培养在含有15μM FM4-64的Tyrode缓冲液中，并在10 Hz下刺激60秒。刺激结束后1分钟将染料洗掉，使其充分内化，细胞在Tyrode的缓冲液中再清洗10–15分钟，然后以10 Hz的频率卸载120秒。通过量化第二刺激物在表达GFP的波顿处释放的FM荧光量来确定池的大小。

为了使用VGLUT1-pHfluorin量化再循环和总池大小，在1μM bafilomycin（Calbiochem）存在下，以10 Hz的频率刺激转染了VGLUT1-pHflucorin+矢量控制或VGLUT-1-pHflu in+αsyn的神经元150秒，以显示再循环池的总大小。刺激结束时，Tyrode含有50 mM NH₄加入Cl以揭示突触小泡池的总大小。

为了评估突触囊泡的分散，在含有25 mM HEPES和119 mM NaCl的Tyrode溶液中以10 Hz的频率刺激转染VGLUT1-GFP和载体控制或αsyn的神经元60秒。如上所述，使用100x1.49 NA油物镜在0.2 Hz的外荧光照明下采集图像10分钟。神经末梢的荧光通过勾画突触泡的周长并计算平均荧光强度来量化。分散程度(D类)通过五个ΔF/F的平均值确定₀荧光峰值周围的值发生变化。重新聚集的程度(R（右）)通过测量刺激停止后的荧光平台来确定。重新聚集部分(F类_第页)计算为<trans data-src="F">F类</trans><trans data-src="r">第页</trans><trans data-src="=">=</trans><trans data-src="R">R（右）</trans><trans data-src="−">−</trans><trans data-src="D">D类</trans><trans data-src="D">D类</trans>.仅对荧光恢复符合单个指数的波顿进行了重新聚集动力学分析A类–B(1–e（电子）^−千吨). 未显示荧光恢复或恢复不符合单个指数的Bouton分为bin 100(图8C).

我们感谢E.Wallender和B.Mukherjee的技术支持，K.Thorn和UCSF尼康中心的成像协助，M.Larsson的电子显微镜帮助，A.Frigessi的统计分析指导，以及R.Tsien的周到讨论。这项工作得到了UCSF MSTP和Hillblom基金会（到V.M.N.）的博士前研究金的支持，Hillblom基金会（去K.N.）、美国心脏协会（W.L.）、奥斯陆大学（V.B.）、挪威研究委员会（F.a.C.）、国家心理健康研究院（R.a.N.和R.H.E.）的博士后研究金，国家帕金森基金会和迈克尔·福克斯基金会（R.H.E.）。