实验衍生的进化保守翻译后修饰对多个基因组的自动注释

蛋白质及其保守结构域

智人，小家鼠和黑腹果蝇蛋白质序列从RefSeq下载(51). RefSeq旨在成为一组全面且非冗余的蛋白质序列，为基因组注释提供稳定的参考。共有39172个人类、36422只小鼠和21779个果蝇序列。每个序列都用一个整数GI来标识。

为了比较基因组序列，我们使用了NCBI CDD数据库（2.22版）中的域模型。这些域由PSSM-ID（职位特定评分矩阵ID）标识。NCBI CDD中用于标记蛋白质结构域分配的严格性有两个级别(38)给定蛋白质序列。RPS-BLAST识别蛋白质序列中存在的蛋白质结构域的足迹。再次评估特定查询区域的最高评分分配（域模型），以查看分数是否高于预先计算的特定于域的分数阈值。这些高置信度任务，也称为特定命中率，表示查询蛋白序列属于同一蛋白质家庭作为序列用于创建领域模型并提供最准确的函数推断。如果没有特定命中率可以分配，RPS-BLAST默认表示域中的成员身份超级家庭.RPS-BLAST查询蛋白质序列的搜索结果如所示图1.

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图1。

蛋白质查询中注释的NCBI保守域。（a） RPS-BLAST用于使用丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶作为蛋白质查询来查找域足迹和衍生功能位点（GI 110349738）。以红色显示的是一个特定的命中，即一个高置信度的蛋白质亚家族。(b条)表示CDD域的多序列比对（MSA）示例。可对齐区域（结构化块或块对齐）以大写块显示，而未对齐区域以小写和间隙显示。NCBI CDD还可以提供功能站点注释。哈希标记表示激活循环（A-loop）的注释。以“query”开头的行显示蛋白质查询（GI:110349738）以及起始和终止位点。

我们分析的第一步是确定特定命中率在这里研究的三种生物的每个蛋白质组中。给定GI序列标识符，对应于特定命中率对序列的结构域进行了识别。该信息是从CDART数据库中检索到的(52)，存储蛋白质保守结构域的预先计算的RPS-BLAST点击。有12 929名人类GI至少有一个域分配被标识为“特定命中”。类似地，有11个603和7587只老鼠和苍蝇GI映射到至少一个“特定命中”。这些序列在人类、老鼠和苍蝇中的记录分别映射到2495次、2376次和1632次独特的“特定点击”。这三种生物共有1469次“特定点击”。

磷灰石的进化守恒

从Tan提供的补充信息中获得了实验人类磷灰石数据等。(30). 作者从两个在线数据库Phospho中获得并处理了人类磷酸肽数据集。榆树(53)和磷灰石(54)，其存储从低吞吐量（LTP）、高通量（HTP）和细胞信号技术（CST）获得的磷酸化位点。总的来说，6456个ENSEMBL id蛋白中有23977个独特的人类磷酸化位点。果蝇磷酸肽组是从Gygi实验室提供的基于质谱的蛋白质组学数据中获得的(8)，磷酸肽的大规模鉴定结果果蝇属胚胎。顺序(14)用于从MS/MS光谱中鉴定磷酸肽，随后又鉴定Ascore(21)用于为磷酸肽内的磷酸位点定位赋值置信度。根据LC-MS/MS分析D.黑腹果蝇，在2702个FlyBase-ids蛋白中鉴定出13720个独特的磷酸化位点。小鼠磷脂酶数据集来自两个不同的来源(6,7)其中5635个位点与2328个IPI蛋白相匹配，5433个位点与1808个IPI-蛋白相匹配。当Ascore用于其中一个鼠标数据集时(7)在苍蝇磷酸肽组中，我们需要95%的位点定位确定性。在其他鼠标数据集中(6)，MaxQuant(55)使用吉祥物进行序列搜索后，用于指定磷酸化位点(15). 然后将所有磷酸肽数据映射到带有匹配分类标识符的RefSeq序列记录上，以获得GI和开始和停止位置。

给定GI和磷酸化位点位置，我们确定了域模型比对上的相应位置，这些位置通过特定点击映射到实验确定的磷酸化位点。域模型由对齐的块和这些块之间未对齐的区域组成，如所示图1b.由于域模型中的未对齐区域不能可靠地相互对齐，因此我们只检查了映射到结构化对齐块的磷位点的分布。

在人类蛋白质组中，2378个磷酸化位点可以被映射到853个特定结构域中的结构块上。一百六十九个果蝇磷酸化位点可以映射到99个特定域点击中的结构化块，196个小鼠磷酸化位点可映射到119个特定域命中中的结构块。在这些特定的点击中，有29个PSSM-ID在所有三种生物体中被发现。需要对磷酸化位点进行位置保护，得到26个独特的磷酸化位点，它们被映射到所有3种生物体的19个公共域模型（相同的PSSM-ID）。在这26个位点中，在RRM域中发现了1个位点，目前在CDD中没有详细的子家族层次结构。图2显示了映射到结构对齐块的人类、小鼠和苍蝇之间保守的磷酸化位点的数量。

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图2。

进化上保守的磷酸化位点。将每个实验性磷酸肽数据集映射到保守的域特异性点击上，并检查域模型上的位点位置是否重叠。维恩图显示了每个物种之间以及所有三个物种之间重叠的地点数量。所有物种共有25个高度保守的磷酸化位点。

以这种方式识别的保守磷脂酶的数量可能很小，至少有两个原因：（i）首先，在特定点击中发现的来自苍蝇和老鼠数据集的磷脂酶数量很小，因为数据集不完整；（ii）其次，研究中3个基因组共享的特定域分配的总数为1469，这是每个基因组中蛋白质及其组成域总数的一小部分。然而，随着时间的推移，来自这些物种的实验数据量以及通过管理领域数据库可获得的特定任务数量应该会大幅增加。

要求对一个保守的磷酸化位点进行三次单独鉴定的理由是基于这样一个事实，即从高通量磷酸化蛋白质组学数据中鉴定的磷酸化位置存在一些模糊性(56). 这种位点定位模糊可能来自实验问题，例如不稳定的翻译后修饰，也可能来自计算方法，例如无法在磷酸化肽中指定磷酸化位点。来自一种以上生物体的磷酸酯酶证据应该有助于减少假阳性。为了了解这种影响，我们检测了50个在人类和苍蝇中保存的位点。其中，20个站点已经在CDD中进行了注释。也有证据表明，在已发表的文献中还有12个以上的网站。这排除了18个位点，其中3个位点在序列记录中被注释为基于质谱的大规模磷酸蛋白质组学实验中观察到的位点，与当前研究中使用的数据类似。其余15个位点（约占总位点的30%）的序列记录中没有磷酸化的证据。其中一些可能是新的保守性位点，而另一种生物的证据可能会证实它们。当我们需要3个物种来确认磷酸化位点时，共鉴定出25个位点。在这些网站中，有12个已经在CDD中进行了注释。在其余13个位点中，有12个位点的文献支持实验证据，而核糖体蛋白L11中确定的位点没有低通量实验证据，但注释为使用高通量方法确定。

磷灰石的大规模自动标注

目前，验证已鉴定的磷酸肽的方法包括手工处理(三)使用站点定位算法自动管理(8–10). 在这里，我们提出，如在三种不同的生物体中观察到的，在进化上保守的位置鉴定磷位点，为保守的、具有生物意义的磷酸化位点提供了有力证据。考虑到这一证据的强度，将保守位点注释转移到跨越这些生物体的整个分支的相应进化保守位置似乎是合理的。

利用人类、小鼠和果蝇之间似乎保守的位点，我们尝试对体腔数据中的多个基因组进行大规模自动注释，体腔数据是涵盖这三个物种的常见分类节点。目前，该分支包含来自RefSeq数据库的910530个独特蛋白质序列，跨越1869个不同的生物体。注释程序在53个不同物种的12068个序列记录中产生了18818个注释磷酸化位点。在真核生物中，蛋白质磷酸化通常发生在丝氨酸（S）、苏氨酸（T）或酪氨酸（Y）侧链上。当然，将磷酸化位点映射到不适合磷酸化的氨基酸上是没有意义的，并且限制这些位点包含丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，导致53种不同生物体9088个序列记录中的11755个磷酸化位点。有几个可能的原因导致了通过比对映射可以注释的假定磷酸化位点总数与实际适合磷酸化的结果位点数量之间的差异。CDD中蛋白质结构域家族的一小部分尚未在亚家族层次结构水平上完全表征，导致过度通用的“特定点击”，并导致磷酸化位点在相应蛋白质结构域家庭所涵盖的序列记录子集上的不正确映射。其中一个家族是RNA识别基序（RRM），它包含本分析中确定的一个保守位点。将该位点注释转移到体腔数据序列中，得到了总共15162个推定位点，并将这些位点限制为S/T/Y，得到8502个位点（56%）。这种相对较低的注释率可能表明RRM的一些亚家族不包含这种磷酸化位点，这也是为什么CDD中详细的亚家族层次结构可以用于定义蛋白质功能的一个例子。从分析结果中排除RRM位点后，在可能的3656个位点中，3253个位点包含S/T/Y，表明89%的位点易于磷酸化。这种更高的注释率突显了在领域分类中保持进化和功能亚家族的重要性，因为一些亚家族可能具有不同的生物功能，而这些生物功能并不具有或需要磷脂酶(57). 因此，我们的分析仅限于功能性子家族。

假定磷酸化位点被映射到不相容残基类型的另一个原因是，修饰注释到其他序列记录的自动转移取决于定义域的多重比对模型的准确性。为了估计比对模糊性的影响，我们分析了排除RRM后剩余的位点。尽管不可磷酸化的位点数量很小（总共403个），但我们检查了错位或位点模糊性对蛋白质家族多序列比对的影响。为此，我们检查了注释序列中感兴趣位点周围的氨基酸，并在相对于该位点的±1至±3对齐位置的偏移范围内寻找可能的磷酸化位点。随着偏移量的增加，有利于磷酸化的额外位点的数量减少。例如，±1AA的偏移导致119个位点可以被磷酸化，而对于±2AA，这是22个位点，对于±3AA，只有1个位点可以磷酸化。考虑到偏离±1AA到±2AA的位点仅占磷脂酶总数的3%，表明CDD内的排列具有位置特异性。因此，映射到功能亚家族的进化保守位点总数为25个，不包括RRM域，该域目前在CDD中没有详细的子家族层次结构。表1列出了具有保守站点的NCBI CDD数据库中的PSSM-ID和域模型的名称。

理论域及其分布

在分析时，RefSeq（第41版）包含了10567种生物体中近1000万个蛋白质序列。为了确定这些蛋白质中的“特定点击”，使用CDART数据库(52). 为了理解蛋白质组内的蛋白质域映射，我们使用RPS-BLAST和Fong描述的算法确定了所有至少映射到一个“特定命中”的序列记录等。(64). 我们还确定了这三个物种共有的“特定点击数”。

磷灰石的进化守恒

下面概述了将磷酸肽映射到RefSeq中的蛋白质序列，然后映射到蛋白质结构域（如果有）的步骤，包括结构域模型上磷酸化位点的位置。

确定保存地点

如果一个蛋白质家族有一个磷酸化位点，从所有三种物种（人类、小鼠和苍蝇）中绘制，我们将该位点视为保守位点。该算法以流程图的形式给出图3.

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图3。

算法流程图。该流程图简要解释了如何从三个物种的实验磷酸肽数据集中获得保守位点。首先，一个磷酸肽被映射到它的蛋白质序列，然后被映射到特定的点击，如果有的话。如果这三个物种的磷酸化位点在特定的命中部位上映射到相同的位置，我们认为该位点是保守的。

我们感谢Naigong Zhang提供了将保守结构域映射到蛋白质上的数据。我们还感谢NCBI信息工程部在本文中使用了大量软件。