跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
分子生物学细胞。2004年1月；15(1): 371–383.
数字对象标识：10.1091/桶。E03-05-0338号
预防性维修识别码：项目经理307554
PMID：13679516

胞浆磷脂酶A的钙结合环2活性细胞中针对高尔基体和内质网的C2域指定V⃞

约翰·埃文斯,* 斯特凡·H·格伯,† 戴安娜·默里,‡和克里斯蒂娜·莱斯利*§
维维克·马霍特拉，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

胞浆磷脂酶A的转运2（cPLA2)高尔基体和内质网对细胞内钙动员的反应受其钙依赖性脂质结合域（C2）调控。尽管在体外进行了很好的研究，cPLA的生化特性2C2结构域在确定其细胞内靶向性方面没有预测价值。了解cPLA的分子基础2在体内，在Madin-Darby犬肾细胞中鉴定了突触结合蛋白1 C2A（Syt1C2A）和蛋白激酶CαC2（PKCαC2）结构域的细胞内靶点，并与含有cPLA钙结合环的杂交C2结构域进行了比较2在Syt1C2A和PKCαC2结构域主链上的C2。作为对细胞内钙增加的反应，PKCαC2靶向富含磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸的质膜区域，Syt1C2A表现出双相靶向模式，首先靶向质膜中富含磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸的区域，然后靶向反式-高尔基网络。相比之下，Syt1C2A/cPLA2C2和PKCαC2/cPLA2C2杂种以高尔基体/ER为靶点，与cPLA共定位2C2.这些杂种的静电特性表明，膜结合机制与cPLA类似2C2，但不是PKCαC2或Syt1C2A。这些结果表明，钙结合环1和3主要编码结构信息，指定cPLA的高尔基体/内质网靶向2C2和混合域。

引言

蛋白质对特定细胞位点的正确时空靶向在细胞信号调节中至关重要(Teruel和Meyer，2000年)，许多在膜表面起作用的细胞质信号蛋白依赖于模块结构域，如C2、pleckstrin同源性（PH）、Phox、FYVE和ENTH结构域(Rizo和Sudhof，1998年;伊藤和竹川，2002年)他们的目标。其中，C2结构域因对细胞内钙的反应而不同2+信号，从而在受体介导的钙之间提供链接2+宿主蛋白与膜的信号和相互作用(Oancea和Meyer，1998年;Teruel和Meyer，2002年).

对细胞内钙的反应2+信号，cPLA2易位到高尔基体和内质网，在那里催化磷脂释放花生四烯酸（AA）(手套等., 1995;希韦拉属等., 1995;平林等., 1999;佩里西奇等., 1999;舒克龙等., 2000;埃文斯等., 2001). 靶向特异性和钙敏感性2+由其N末端C2结构域提供给完整的酶(纳列夫斯基等., 1994;佩里西奇等., 1998;德森等., 1999;吉昂等., 1999;平林等., 1999;佩里西奇等., 1999;埃文斯等., 2001)，类似于其他信号蛋白的C2结构域，如PKCα和Syt1(萨顿等., 1995;Nalefski和Falke，1996年;邵等., 1998;维达格尔等., 1999) (图1，A和B). C2结构域由折叠成β三明治结构的约130个氨基酸组成，由于氨基酸序列中的循环排列，存在两种拓扑结构（I型和II型）(Nalefski和Falke，1996年). C2结构域之间的大部分同源性发现于支持表面暴露钙结合环（CBL）的保守核心区域(萨顿等., 1995). CBL与cPLA之间的同源性较低2C2在第一个CBL中具有独特的α-螺旋区域。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430001.jpg

cPLA的结构和序列比较2C2、PKCαC2和Syt1C2A结构域。（A） cPLA功能区图2C2、PKCαC2和Syt1C2A（蛋白质数据库条目分别为1RLW、1DSY和1BYN）显示cPLA的CBLs 1-3和β链2和32C2（与PKCαC2和Syt1C2A的β链3和4同源）。（B） cPLA的氨基酸序列比对2C2（残基17-138，AAB00789）、PKCαC2（残基158-277，P17252）和Syt1C2A结构域（残基140-262，P21707）。CBL中的残留物以灰色阴影显示，保守核心中的残渣位于黑线下方。

对于许多C2结构域，包括PKCαC2和synaptotagmin 1 C2A（Syt1C2A），Ca2+结合导致CBL区域的负静电势变为正，从而促进与负电荷膜的静电相互作用(邵等., 1997;Rizo和Sudhof，1998年;Murray和Honig，2002年). 因此，Syt1C2A和PKCαC2优先与阴离子磷脂结合，如磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇多磷酸盐，但不与中性头基磷脂结合，例如磷脂酰胆碱（PC）(斯齐亚沃等., 1996;阿卡罗等., 1998;达夫列托夫等., 1998;张等., 1998;科尔巴兰·加西亚（Corbalán-García et）其他。，1999;维达格尔等., 1999;格伯等., 2001;纳列夫斯基等., 2001;科胡特等., 2002;奥乔亚等., 2002). 与Syt1C2A和PKCαC2结构域相比，疏水相互作用在cPLA的相互作用中占主导地位2带膜的C2结构域和Ca2+结合可以中和cPLA尖端疏水残基周围的负静电势2C2 CBL 1和3，促进其渗透到膜表面(达夫列托夫等., 1998;佩里西奇等., 1998;徐等., 1998;比托瓦等., 1999;佩里西奇等., 1999;格伯等., 2001;纳列夫斯基等., 2001). 此外，与Syt1C2A和PKCαC2不同，cPLA2C2优先与完全由PC组成的脂质囊泡结合(纳列夫斯基等., 1997;达夫列托夫等., 1998;希克逊等., 1998;Nalefski和Falke，1998年;佩里西奇等., 1999;格伯等., 2001)但也能与部分但不是全部由阴离子磷脂组成的膜结合(达夫列托夫等., 1998;格伯等., 2001;纳列夫斯基等., 2001;斯塔赫林等., 2003). CBL在测定膜结合特性中的重要性在Syt1C2A的磷脂偏好转变为cPLA的磷脂偏爱的实验中得到了例证2通过接枝cPLA的CBL进行C22C2连接到Syt1C2A(格伯等., 2001).

尽管人们对C2结构域的结构特征、静电特性和脂质偏好已经了解了很多，但C2结构域靶向活细胞中特定膜的机制仍不清楚。这里，我们使用成像方法关联cPLA的结构特征2针对高尔基体和内质网的C2结构域对钙的反应2+动员。使用具有不同生化特性的荧光蛋白（FP）标记的C2结构域和FP标记的脂质特异性和细胞器特异性探针，我们首先表征了cPLA的时空特征2C2、Syt1C2A和PKCαC2结构域移位对细胞内钙（[Ca2+]我)增加。然后，我们直接比较了这些野生型C2域和混合型Syt1C2A/cPLA的靶向性2C2和PKCαC2/cPLA2包含cPLA的C2域2C2 CBL。

材料和方法

荧光蛋白构建体

pEGFP-cPLA2C2编码人类cPLA2如前所述，克隆融合到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的C2结构域（残基17-148，加入M72393）(埃文斯等., 2001). 通过聚合酶链反应（PCR）扩增pGEX65-4的C2结构域，构建与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）（残基140-267，pEYFP-Syt1C2A）融合的大鼠Syt1C2A(西基等., 1994)通过使用引物Syt1C2Afwd（CGCGGATCGAAAACTGGAAAGCTCACATATCACTG）和Syt1C2Arev（CCCAAGCTTTTCAGCGTCTGGATGCGCCACTC），将PCR产物亚克隆到Bgl公司二/后面的EYFP（C1）的III位置。编码大鼠Syt1C2A和大鼠cPLA三个钙结合环的结构2C2与EYFP融合（pEYFP-Syt1C2A_cPLA2C2_L1.2.3）通过连接巴姆HI（高）/后面的pGEXSyt1C2A_cPLA的III片段2αC2_L1.2.3(格伯等., 2001)进入Bgl公司二/后面的EYFP（C1）的III位置。通过将I.Weinstein（纽约哥伦比亚大学）赠送的pHACE-PKCα中的EcoR1片段插入pEGFP（C2）的EcoR2位点，构建了与EGFP融合的人PKCα（加入物X52479）。利用引物PKCαC2fwd（GTCAAGCTTAAAGAGGGGGCGGATTACTA）和PKCαC2 rev（CGTCGACTGGTACTCTTCTTG）对pEGFP-PKCα进行PCR扩增，构建了一个与ECFP融合的人PKCαC1结构域（残基158-286），并将PCR产物克隆到后面的三/萨尔ECFP（C3）的位置。通过定点突变（Stratagene，La Jolla，CA）产生pECFP-PKCαC2/N189F和pECFP-PKCαC2/N189F/T250Y。构造用人类cPLA编码人类PKCαC2域2C2钙结合环1和3或1、2和3（pECFP-PKCαC2_cPLA2C2_L1.3和pECFP-PKCαC2_cPLA2C2_L1.2.3）分别由pECFP-PKCαC2与PKCαC2fwd、PKCαC2引物和含有cPLA的引物扩增得到的重叠PCR片段组装而成2C2回路序列（PKCαC2_cPLA2C2_loop1rev=TGGAGTATCAAGCATGTCACCAAGGCCCCCTTTGTTAGATTTGCCTCGTACTGACAT GGAGC；PKCαC2_cPLA2C2_loop1fwd=ACAAGGGGCCTTTGGTG-ACA TGCTTGATACTCCAGATCCTTATGTGAAGCTGATACTCTCGAT CCC；PKCαC2_cPLA2C2_loop2rev=GTTTATGTCATTATTGAAGGT-TTGG TTTTTT GCTTGC；PKCαC2_cPLA2C2_loop2fwd=TTCAATAATA-CA TAAACCCGCAGTGAATGAGTCC；PKCαC2_cPLA2C2_loop3rev=TTCATCCATGATATATTGGCGTCCAGATTTCTACAGAGACAGTCG；PK CαC2_cPLA2C2_loop3fwd=GCCAATTATGTCATGGATGAATTCATGGGATCCTTCCTTTTGG）。通过PCR组装片段并克隆到后面的三/Sma公司ECFP（C3）的位置。pECFP-GT是从BD Biosciences Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）购买的，含有β-1,4-半乳糖基转移酶的N端82个氨基酸，融合到增强型氰基荧光蛋白（ECFP）。TGN38-ECFP和TGN38-EYFP是K.Simons（德国德累斯顿马克斯·普朗克研究所）赠送的礼物。EGFP-PLCδ1PH-domain是M.Lemmon（宾夕法尼亚大学医学院，宾夕法尼亚州费城）赠送的礼物。ECFP-Rab5是a.Sorkin（科罗拉多州丹佛科罗拉多大学健康科学中心）赠送的礼物。本研究中使用的pEYFP质粒是从BD Biosciences Clontech购买的pEYFP中构建的，通过定点突变（Stratagene）引入Q70M突变以提高其质量(格里斯贝克等., 2001). 通过替换产生不同的荧光蛋白构建体Nhe公司编码pECFP和pEYFP荧光蛋白编码区的I/BsrGI片段。所有结构均通过测序确认。

细胞培养

在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.292 mg/ml谷氨酰胺的DMEM中培养来自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）的MDCK细胞237°C时。次级流入细胞（1×104细胞/厘米2)按照制造商的方案，在含有0.2%牛血清白蛋白、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.292 mg/ml谷氨酰胺的DMEM中使用FuGEN-6（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）转染相关质粒。

荧光蛋白显微镜

将生长在MatTek平板上的转染Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞用Hanks的平衡盐溶液清洗，并在Hanks平衡盐溶液中孵育，再加上25 mM HEPES缓冲液，pH 7.4（HEPES-银行平衡盐溶液）。使用配备60×1.25数字孔径油浸物镜、蓝荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）发射滤光片（Chroma Technology，Brattleboro，VT）的Olympus倒置显微镜在Sutter滤光轮、CFP/YFP双色镜、，和TILL Imago电荷耦合设备相机（TILL Photonics，Gräfelfing，德国）。使用多色IV单色仪（TILL Photonics）分别为CFP和YFP提供430 nm和510 nm的激发光。使用TILLvisION软件进行采集和分析。最终图像是使用Adobe Photoshop制作的。

针对与质膜或反式-高尔基网（TGN）采用以下方法。确定ROI的背景校正平均像素值TGN公司在每个时间点。由于实验过程中的光漂白，通过首先确定与整个细胞（ROI）相对应的ROI的背景校正平均像素值，计算每个时间点的漂白校正因子细胞)然后将这些值标准化为t=0时的初始值。背景和漂白校正荧光值，Ft吨，通过将每个时间点每个ROI的背景校正平均像素值除以相应时间点的漂白校正因子来计算。通过除以F计算质膜或TGN处的归一化荧光t吨通过t=0荧光值，F0，以产生Ft吨/F类0.

结构模型

蛋白质数据库(伯曼等., 2000)计算中使用的实验确定的C2畴结构的标识符如下：cPLA2C2（1RLW；佩里西奇等., 1998)，Syt1C2A（1BYN；邵等., 1998)和PKCαC2（1DSY；维达格尔等., 1999). 假设C2结构域结合了结构研究规定的钙离子数量。具体来说，钙结合形式的cPLA2静电计算中使用的C2、Syt1C2A和PKCαC2分别含有两个、三个和两个钙离子。图中所示的混合C2域模型​图4，4,​,9,9、和​和1010通过放置来自cPLA的各个环路区域来构建2C2连接到Syt1C2A和PKCαC2的结构核心上。Syt1C2A和PKCαC2的结构叠加在cPLA上2使用程序组合扩展的C2结构(辛迪亚洛夫和伯恩，1998年). 一旦结构对齐，cPLA的适当部分2C2蛋白质数据库文件替换了Syt1C2A和PKCαC2蛋白质数据库的区域，如图中所示的序列比对所示​图1，1,​,4,4、和​和9。9。混合C2域模型在程序Modeler中能量最小化(萨利和布伦德尔，1993年)修复各种结构段之间的任何不匹配。因为混合C2模型的钙配位方案与cPLA最接近2C2，假设混合C2模型以与cPLA相同的方式结合两个钙离子2C2.通过将模型在结构上叠加到实验确定的cPLA结构上，将钙离子对接到混合模型上2C2（1RLW）并从cPLA传输钙离子的坐标2C2坐标文件到模型的坐标文件。通过使用CHARMM程序在189和250位置构建适当的侧链，从PKCαC2的原始蛋白质数据库坐标中获得了PKCαC2N189F/T250Y突变体的模型(布鲁克斯等., 1983). 在CHARMM的结构和模型中，将氢原子添加到重原子中。对含氢结构进行共轭梯度最小化，谐波约束力为50 kcal/mol/O2应用于位于原始晶体学坐标的重原子。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zmk0010424430004.jpg

含有疏水残基的PKCαC2结构域靶向血浆和核膜，但不靶向高尔基体和内质网。显示了用10μM IONO处理150 s后，（a）EYFP-PKCαC2和（B）ECFP-PKC-αC2/N189F/T250Y共存的细胞图像。A和B中的插图显示了细胞的扩大区域，包括核膜。细胞共存的图像（C）EYFP-cPLA2显示了用10μM IONO处理240 s后的C2和（D）ECFP-PKCαC2/N189F/T250Y。C中的箭头指向高尔基，D中的箭头则指向与C中相同的区域。图像代表了在不同日期进行的至少五次实验。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430009.jpg

混合PKCαC2/cPLA2包含cPLA的C2域2C2钙2+-绑定循环与cPLA共定位2C2.（A）混合C2域与Ca的带状图2+-cPLA的绑定循环2PKCαC2主链上的C2（红色）（白色）。（B） 杂交体的氨基酸序列显示PKCαC2序列（黑色，K158-L183，D193-T214，P221-D246，F255-Y285）被插入cPLA中断2C2回路序列（红色，T31-P42，F63-I67，A94-E100）。细胞共存图像（C）ECFP-cPLA2C2和（D）EYFP-PKCαC2显示在用10μM IONO处理后45秒。（E） C和D的合并图像。共表达（F）EYFP cPLA的细胞的图像2C2和（G）ECFP-PKCαC2_cPLA2图中显示了用10μM IONO处理后90秒的C2_L1.2.3。（H） 合并后的图像显示F和G的重叠。共存细胞的图像（I）EYFP-cPLA2C2和（J）ECFP-PKCαC2_cPLA2补充5 mM CaCl的培养基中的C2_L1.32处理后42秒，显示10μM IONO。（K） 合并后的图像显示I和J的重叠。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430010.jpg

已知结构、突变体和混合模型C2域的静电特性。在每个面板中，结构或模型表示为Cα主干蠕虫（白色），钙离子表示为黄色球体。静电势在GRASP中进行了计算和可视化(Nicholls等人，1991年)0.1 M KCl。红色和蓝色网格分别表示-25和+25 mV等电位剖面。（A） PKCαC2。（B） 系统1C2A。（C） 中国解放军2C2.（D）PKCαC2/N189F/T250Y；F189和Y250用绿色箭头表示。（E） PKCαC2_cPLA2C2_L1.2.3.（F）系统C2A_cPLA2C2_L1.2.3。A、B和C中的结构取自蛋白质数据库，D、E和F中的杂交模型按照材料和方法中的描述构建。

膜模型

如前所述，建立了2:1 PC/PS双层的结构模型(Ben-Tal公司等., 1996). 因为计算的目的表1是为了量化C2结构域与带电膜表面相互作用的静电自由能的变化，假设脂类在与蛋白质相互作用时既不改变结构也不改变位置。这些近似值对于Syt1和PKCα的C2结构域是合理的，因为它们都是高电荷的，并且在很大程度上不会穿透膜界面。在以前的计算工作中，对C2域进行了类似的处理(Murray和Honig，2002年).

表1。

计算的静电相互作用自由能（ΔG埃尔)钙的2+-用在0.1M KCl中含有33摩尔%酸性脂质的膜结合C2结构域。详见材料和方法。

C2域（ΔG埃尔)，千卡/摩尔
PKCαC2-4.5
系统1C2A-5.6
中国解放军2指挥与控制+0.6
系统1C2A_cPLA2C2_L1.2.3号机组0
PKCαC2_cPLA2C2_L1.2.3号机组-0.5

静电计算

在图10已知结构的C2结构域、PKCaC2/N189F/T250Y突变体和Syt1C2A/cPLA的静电特性2C2和PKCαC2/cPLA2C2杂种计算了0.1 M KCl，并在GRASP中可视化(尼科尔斯等., 1991).

对于中描述的计算表1，如前所述获得静电势和自由能(Murray和Honig，2002年). 有限差分泊松-玻尔兹曼（FDPB）方法已被证明与多肽和蛋白质与带电膜（Ben-Tal等.,1996,1997;默里等., 1998;Murray和Honig，2002年). 静电自由能由计算出的电势获得(夏普和霍尼格，1990年)，相互作用的静电自由能被确定为C2畴在相对于膜表面的特定方向上的静电自由能量G之间的差值埃尔（P·M），以及C2域的静电自由能，G埃尔（P） ，和膜，G埃尔（M） ，相隔无限远，即分开取：

方程式M1

钙结合的Syt1C2A和PKCαC2畴的膜相关取向是最小静电自由能取向。这些是通过比较在GRASP中通过目视检查静电势分布获得的方向上取样的不同方向相互作用的静电自由能来确定的。先前的工作已经确定，对于外围结合，相对结合自由能和静电对绝对结合自由能的贡献都可以通过单独考虑最小自由能方向来很好地描述（Ben-Tal等.,1996,1997;默里等., 1998). cPLA的膜相关取向2为了进行比较，C2和混合模型与Syt1C2A和PKCαC2域的模型相似。

结果

我们首先进行了实验，以建立三个生化多样的C2域的时空靶向模式：cPLA2C2、PKCαC2和Syt1C2A。

cPLA的细胞内靶向性2C2域

我们之前已经证明cPLA的FP融合2（FP cPLA2)和解放军2C2域（FP-cPLA2C2）Ca后完全共定位2+-介导的易位，证明C2结构域完全负责酶的靶向。我们之前也证明了FP-cPLA2与golgin 97，a共同定位顺式-高尔基池标记物和FP-cPLA2C2与ECFP-GT共定位，后者是内侧和外侧反式-高尔基池，但不是TGN(夏基等., 1997; 埃文斯等.,2001,2003). 更好地定义cPLA2靶向性，我们比较了FP-cPLA的共定位2C2带FP-TGN38，TGN标记(凯勒等., 2001)和FP-GT。MDCK细胞与FP-cPLA共存2用10μM离子霉素（IONO）刺激C2和FP-GT，并通过延时显微镜成像。图像显示FP-cPLA的共定位2C2在高尔基与FP-GT(图2A-C和图2C视频）以及ER和核膜。这些图像还显示了动态的核内陷，看起来像核内小管，cPLA位于其中2C2易位(埃伦伯格等., 1997;弗里克等., 1997;埃文斯等., 2001). 为了确定高尔基池是否能与TGN分化，对FP-GT和FP-TGN38共存的MDCK细胞进行成像。FP-GT和FP-TGN38信号并列，但几乎没有重叠(图2D-F和图2F视频）。大多数重叠出现在细胞核附近，细胞核是细胞最厚的地方，这表明荧光重叠可能是由于高尔基体池和TGN的重叠，而不是标记物在同一膜上的共定位。根据这些观察结果，我们预计cPLA2C2靶向与TGN不同。在IONO处理的MDCK细胞中，FP-cPLA共存2C2和FP-TGN38，FP-cPLA2C2和FP-TGN38信号以类似于TGN38和GT的方式并置(图2，G-I)，但除了靠近原子核外，没有很好地重叠。这些结果表明cPLA的C2域2优先靶向内质网和高尔基体池，尽管可能有一小部分cPLA2C2也定位到TGN。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430002.jpg

中国解放军2C2域靶向高尔基体和内质网。细胞共表达（a）EYFP-cPLA的图像2显示了用10μM IONO处理后27 s的C2和（B）ECFP-GT。合并图像（C）显示了来自A和B的高尔基体区域。显示了细胞共存的图像（D）ECFP-GT和（E）TGN38-EYFP，以及（F）TGN和高尔基体地区D和E的合并图像。细胞共存图像（G）ECFP-cPLA2显示了用10μM IONO处理后30 s的C2和（H）TGN38-EYFP。合并后的图像（I）显示了TGN的区域。图像代表至少五个实验。

PKCαC2结构域的细胞内靶向

许多报道表明，PKCα及其C2结构域在[Ca2+]我增加(米诺等., 1998;阿尔姆霍尔特等., 1999;科尔巴兰·加西亚（Corbalán-García et）其他。，1999;Maasch等人其他。，2000;博尔索沃等., 2003). 除了其C2结构域外，PKCα还有一个C1结构域，该结构域靶向质膜中的二酰基甘油，在缺乏钙的情况下可以促进PKCα向质膜的移位2+信号(Oancea和Meyer，1998年). 因此，C1或其他结构域可能会修饰Ca2+-和PKCα的C2域依赖性靶向。为了确定PKCαC2结构域是否仅负责Ca2+-依赖性膜靶向，如cPLA的情况2全长PKCα和分离的C2结构域的FP融合在MDCK细胞中共表达，用IONO刺激，并通过延时显微镜成像。在未刺激的细胞中，PKCα主要局限于细胞质，而C2结构域也存在于核质中（我们的未发表数据）。PKCα(图3A)和PKCαC2(图3B)在IONO的作用下，它们迅速从细胞质移动到质膜上的区域，在那里它们完全重叠(图3C). 这一结果表明，PKCαC2结构域负责靶向全酶，以响应[Ca的增加2+]我PKCα和PKCαC2在质膜上的分布不均匀，但在背侧细胞表面呈点状分布(图3D)腹部表面斑驳(图3G和图3G视频），类似于以前的报告(马施等., 2000)与PLCδ的报告分布相似1PH域(斯塔弗等., 1998;瓦尔奈和巴拉，1998年). 事实上，为了响应IONO，FP-PKCαC2(图3、D和G)和FL-PLCδ1PH荧光(图3、E和H)背侧和腹侧细胞表面重叠(图3、F和I）。然而，与PKCαC2不同，PLCδ1PH在数十秒内失去点状和不规则分布，因为[Ca2+]我细胞溶质中增加并变得均匀(图3H视频），如前所述(瓦尔奈和巴拉，1998年). 因为PLCδ1PH特异性识别磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2)在质膜中(斯塔弗等., 1998;瓦尔奈和巴拉，1998年;巴拉和瓦尔奈，2002年)这些结果表明PKCαC2特异性靶向富含PIP的质膜区域2，与PKCαC2偏好阴离子膜磷脂的观察结果一致(科尔巴兰·加西亚（Corbalán-García et）其他。，1999;维达格尔等., 1999;科胡特等., 2002;奥乔亚等., 2002)PKCαC2的β3和4链参与PIP的特异性结合2(科尔巴兰·加西亚（Corbalán-García et）其他。，2003).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430003.jpg

PKCαC2结构域负责PKCα靶向和靶向PIP2-质膜中丰富的区域。显示了用10μM IONO处理后15s共表达（a）ECFP-PKCα和（B）EYFP-PKCαC2的细胞的图像。（C） A和B的合并图像。共存（D）EYFP-PKCαC2和（E）ECFP-PLCδ的细胞图像1显示了用10μM IONO处理10 s后的PH值。聚焦于细胞的背表面。D和E中的插图显示了细胞扩大的区域。合并后的图像（F）显示单元格的较小区域。细胞共表达（G）EYFP-PKCαC2和（H）ECFP-PLCδ的图像1显示了用10μM IONO处理后21秒的PH值。聚焦在细胞的腹部表面。合并后的图像（I）显示图像G和H的重叠。图像代表至少五个实验。

PKCαC2突变体的细胞内靶向性

解放军CBL1和CBL3的提示2C2含有插入双层膜疏水核心的疏水残基。特别是，已证明回路1上的F35和回路3上的Y96很好地渗透到膜中(Nalefski和Falke，1998年; 佩里西奇等.,1998,1999;比托瓦等., 1999;弗雷泽等., 2002;斯塔赫林等., 2003). 为了确定在PKCαC2上添加疏水残基是否会导致ER/Galgi靶向，构建了FP-PKCαC2/N189F/T250Y突变体，并与FP-PKC-αC2在细胞中共表达。PKCαC2 N189位于CBL1的尖端，PKCαC2T250位于与cPLA结构相似的位置2C2 Y96，均位于CBL3中。FP-PKCαC2/N189F/T250Y(图4B)靶向质膜，以及FP-PKCαC2(图4A); 然而，与野生型PKCαC2结构域不同，突变体也以核膜为靶点。如中所示图4C在之前的工作中，中国人民解放军2C2靶向高尔基体（箭头）、内质网和核膜，包括核膜内陷。FP-PKCαC2/N189F/T250Y与FP-cPLA共存的细胞内2C2和IONO处理后，在质膜上观察到突变并与FP-cPLA共定位2C2位于核膜及其内陷处，但在内质网或高尔基体处未能共存(图4、C和D、箭头和图4D视频）。FP-PKCαC2/N189F也获得了类似的结果（我们未公布的数据）。PKCαC2和PKCαC2/N189F/T250Y静电分布模型的比较(图10，A和D（分别是）表明它们非常相似。因此，如果静电决定簇在膜靶向中很重要，那么PKCαC2和PKCαC2/N189F/T250Y将表现出类似的靶向。总之，这些结果表明，在PKCαC2中添加疏水性残基会使核膜进入其靶向模式，但不能赋予类似于cPLA的ER/高尔基体靶向2C2或更改静电配置文件。

Syt1C2A结构域的细胞内靶向

虽然Syt1是一种完整的膜蛋白，其C2A结构域介导膜结合但不易位(Davletov和Sudhof，1993年;查普曼和扬，1994年;格佩特等., 1994;Sudhof和Rizo，1996年;张等., 1998)，分析其细胞内靶向模式有助于揭示赋予细胞内靶点的C2结构域的特性。表达FP融合到Syt1C2A（FP-Syt1C2A）的MDCK细胞用IONO处理并通过延时显微镜成像。与cPLA相比2C2和PKCαC2，Syt1C2A的易位需要培养基中添加5 mM CaCl2（最终细胞外钙（[Ca2+]e（电子）)=6.3 mM），这反映了Syt1C2A对Ca的亲和力较低2+相对于cPLA2C2和PKCαC2(Nalefski和Newton，2001年;科胡特等., 2002). 在未刺激的MDCK细胞中，FP-Syt1C2A均匀分布在细胞质和核质中。作为对IONO的反应，FP-Syt1C2A表现出双相靶向模式，并首次以与FP-PKCαC2相似的模式靶向质膜区域(图5，A和B、和图5视频）。然而，与FP-PKCαC2不同，FP-Syt1C2A在IONO处理数秒后部分从质膜分离并移向近核区(图5C和图5视频）。FP-Syt1C2A易位的定量分析(图5D)显示了Syt1C2A靶向的双相性质。尽管实验之间的时间不同，但始终观察到FP-Syt1C2A首先向质膜移动，然后向相邻区域移动的模式。为了鉴定FP-Syt1C2A靶向的特定膜结构域和细胞器，进行了与上述类似的实验。FP-Syt1C2A和FP-PLCδ共存的细胞1PH用IONO处理并通过延时显微镜成像。FP-PLCδ的分布1如前所述，PH呈点状和不规则(图6A). FP-Syt1C2A易位早期（9 s；图6B)，FP-PLCδ部分重叠1电池边缘的PH和FP-Syt1C2A信号(图6C). 这些结果表明，最初，FP-Syt1C2A专门针对富含PIP的质膜区域2以类似于FP-PKCαC2的方式。无法对FP-PLCδ的共定位进行成像1由于FP-PLCδ的快速离解，随后的PH和FP-Syt1C2A1来自质膜的PH。因为后来看到的FP-Syt1C2A的并列靶向性使人想起高尔基池或TGN(图2)，探针用于识别Syt1C2A易位后期的靶向结构。细胞内的FP-TGN38荧光大部分位于代表TGN的相邻位置；然而，有一小部分荧光位于小的活动结构上，可能是内体和质膜上(图6D). 经过IONO处理后，FP-Syt1C2A(图6E)与FP-TGN38荧光的TGN部分重叠，但不与内胚体或质膜部分重叠(图6F). 相反，当FP-Syt1C2A与FP-GT共存时(图6，H和G），或使用FP-Rab5(图6，K和J），早期内体的标记(Novick和Zerial，1997年)，只有一小部分荧光重叠(图6，I和L). FP-Syt1C2A和FP-Rab5之间的空间关系(图6L)与FP-Syt1C2A和FP-TGN38鉴定的内体相似(图6F). 使用晚期内体标记FP-Rab8的类似实验表明，荧光与Syt1C2A没有重叠（我们的未发表数据）。通过联合显像细胞表达FP-cPLA，TGN被进一步确定为Syt1C2A易位位点2C2和FP-Syt1C2A响应[Ca2+]我在100μM brefeldin A（BFA）中孵育1.5小时后动员，这会破坏高尔基池，但不会破坏TGN(利平科特·施瓦茨等., 1989;Chege和Pfeffer，1990年). 针对[Ca增加2+]我，没有明确的cPLA2观察到高尔基体的C2靶向性（比较图6M带数字​图3，三,​,8,8、和​和9），9)证明了BFA打乱了对高尔基的瞄准，正如我们之前所展示的那样(埃文斯等., 2001). 然而，BFA对Syt1C2A易位没有影响(图6N). 这些结果表明TGN是Syt1C2A易位后期的主要靶点。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430005.jpg

Syt1C2A结构域表现出双相易位模式。在添加5 mM CaCl的培养基中表达EYFP-Syt1C2A的细胞图像2用10μM IONO处理后，在添加IONO之前、（B）40 s和（C）90 s显示Syt1C2A（A）的分布。（D） 量化图像A-C中细胞质膜（PM，实线）和近核（JN，虚线）区域对应区域的荧光变化。图像和图形是六个独立实验的代表。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430006.jpg

Syt1C2A针对TGN和PIP2-质膜中丰富的区域。细胞共存图像（a）ECFP-PLCδ1添加5 mM CaCl的培养基中的PH和（B）EYFP-Syt1C2A2图中显示了用10μM IONO处理后的9秒。合并图像（C）显示了细胞膜的一个区域。在添加5 mM CaCl的培养基中共存（D）TGN38-ECFP和（E）EYFP-Syt1C2A的细胞图像2显示了用10μM IONO处理56秒后的情况。合并后的图像（F）显示TGN的区域。在添加5 mM CaCl的培养基中共存（G）ECFP-GT和（H）EYFP-Syt1C2A的细胞图像2显示了用10μM IONO处理20秒后的情况。合并后的图像（I）显示了TGN和高尔基的区域。在添加5 mM CaCl的培养基中共存（J）ECFP-Rab5和（K）EYFP-Syt1C2A的细胞图像2显示了用10μM IONO处理20秒后的情况。合并图像（L）显示早期内体和TGN区域。细胞共存（M）ECFP-cPLA2C2和（N）EYFP-Syt1C2A在37°C下用100μM BFA处理1.5小时，然后在添加5 mM CaCl的培养基中用10μM IONO刺激2刺激后20秒出现图像。图像代表至少五个实验。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zmk0010424430008.jpg

混合型Syt1C2A/cPLA2含有cPLA的C2结构域2C2钙2+-绑定循环与cPLA共定位2C2.（A）混合C2域与Ca的带状图2+-cPLA的绑定循环2Syt1C2A主干上的C2（红色）（白色）。（B） 杂交的氨基酸序列显示Syt1C2A序列（黑色，E140-A165，D178-T195，N203-T223，G241-K267）被cPLA插入中断2C2回路序列（红色，T28-P42，R61-I67，L87-I102）。共表达ECFP-cPLA的细胞图像2补充5 mM CaCl的培养基中的C2（C）和EYFP-Syt1C2A（D）2显示了用10μM IONO处理后的55秒。（E） C和D的合并图像。共表达（F）EYFP cPLA的细胞的图像2C2和（G）ECFP-Syt1C2A_cPLA2补充5 mM CaCl的培养基中的C2_L1.2.32显示了用10μM IONO处理后70秒的情况。（H） F和G的合并图像。

Syt1C2A和PKCαC2膜结合的生化和静电特性非常相似(纳列夫斯基等., 2001;科胡特等., 2002;Murray和Honig，2002年)令人意外的是，这两个C2域将显示不同的目标轮廓。因为Syt1C2A需要增加[Ca2+]e（电子）对于易位，我们检测了PKCαC2是否也靶向TGN，并显示了双相靶向模式，以响应[Ca增加2+]e（电子）在添加5 mM CaCl的培养基中用IONO刺激FP-PKCαC2和FP-Syt1C2A共存的细胞2并通过延时显微镜成像。在含有～1.3 mM的培养基中，PKCαC2的靶向性无差异(图3B)或～6.3 mM(图7A)氯化钙2因此，Syt1C2A和PKCαC2靶向模式之间的差异(图7，A-C)不是增加[Ca的伪影2+]e（电子）.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zmk0010424430007.jpg

Syt1C2A和PKCαC2针对不同的亚细胞细胞器对[Ca2+]我增加。在添加5 mM CaCl的培养基中共存（A）ECFP-PKCαC2和（B）EYFP-Syt1C2A的细胞2显示了用10μM IONO处理后的55秒。（C） A和B的合并图像是至少五个实验的代表。

Syt1C2A/cPLA的细胞内靶向性2C2混合C2域

在建立了各个C2域的靶向模式后，我们开始研究cPLA的重要性2C2 CBL在确定cPLA细胞内靶向性中的作用2C2.由cPLA组成的混合C2域的FP融合2使用替换为Syt1C2A的C2 CBL(图8，A和B) (格伯等., 2001). 在脂质体结合分析中，混合Syt1C2A/cPLA2C2结构域显示类似于cPLA的脂质特异性2指挥与控制(格伯等., 2001). 因为cPLA2C2和Syt1C2A分别显示高尔基体/ER和质膜/TGN靶向，我们期望观察到Ca与2+-cPLA的依赖靶向模式2C2和Syt1C2A在同一小区中。针对添加5 mM CaCl的培养基中的IONO2，中国人民解放军2C2显示了ER、高尔基体和核膜的通常靶向性(图8C). 相反，Syt1C2A主要在TGN处观察到(图8D). 与我们之前的观察一致，FP-cPLA2C2和FP-Syt1C2A荧光信号主要并置，高尔基地区仅部分重叠(图8E). 特别有趣的是观察到Syt1C2A未能靶向核膜内陷或ER；事实上，FP-Syt1C2A荧光被排除在内质网区域之外。相反，来自cPLA的含有CBLs1、2和3的FP标记的杂交C2结构域2在Syt1C2A主干网上（Syt1C2A_cPLA2C2_L1.2.3；图8G和图8G视频）显示了与cPLA无法区分的细胞内靶向模式2C2，尽管杂种的易位需要更高的（6.3 mM）[Ca2+]e（电子）本系统C2A/cPLA2C2杂交靶向高尔基体、ER和核膜内陷，但不靶向质膜或TGN。这一结果表明，cPLA的CBL区域2C2授予高尔基和ER目标，以及替代cPLA的目标2C2 CBL导致目标模式完全切换。然而，这个Syt1C2A/cPLA2C2混合域还包括cPLA的一部分2低于Ca的C2β链2+-结合区域(图8，A和B)，这可能会影响目标定位。

PKCαC2/cPLA的细胞内靶向性2C2混合C2域

研究特定cPLA的作用2C2 CBL更详细，FP标记的PKCαC2/cPLA2构建了含有cPLA的C2杂种2PKCαC2主干上的C2 CBL 1、2和3，或1和3。PKCαC2/cPLA中的CBL2C2杂种比Syt1C2A/cPLA中的CBL含有更少的残基2C2混合(图9，A和B). 验证cPLA的不同靶向模式2C2和PKCαC2，细胞共存FP-cPLA2C2和FP-PKCαC2用IONO处理并成像。FP中央解放军2指挥与控制(图9A)和FP-PKCαC2(图9B)转移到细胞的不同区域(图9E)如上所述。与FP-PKCαC2靶向相反，PKCαC2/cPLA2包含所有三个cPLA的C2混合构造2C2 CBL（PKCαC2_cPLA2C2_L1.2.3；图9G和图9G视频）以类似于cPLA的模式转移到高尔基体、内质网和核膜2指挥与控制(图9，F和H). 为了进一步缩小高尔基体/ER靶向所需的结构，用PKCαC2/cPLA进行了类似的实验2包含cPLA的C2混合构造2C2 CBL 1和3（PKCαC2_cPLA2C2_L1.3；图9J和图9J视频）。观察到该结构以类似于cPLA的模式易位到高尔基体2指挥与控制(图9F). 然而，PKCαC2_cPLA2C2_L1.3需要更高的[Ca2+]e（电子）PKCαC2（6.3 mM），在内质网或核膜上未观察到(图9K). 在ER和核膜上观察到靶向性，但仅当细胞用极高的[Ca2+]e（电子）（>25 mM），这也导致内质网囊泡化和质膜起泡（我们未发表的数据）。我们之前已经展示了cPLA2C2在低[Ca时易位到高尔基体2+]我而不是对内质网和核膜(埃文斯等., 2001)，因此观察到PKCαC2_cPLA的优先高尔基体靶向2C2_L1.3构造并非意外。总之，这些结果表明cPLA2CBLs 1和CBLs 3赋予高尔基体/内质网靶向性，CBL2的加入提高了Ca2+杂种的结合特性。

静电Ca2+Syt1C2A/cPLA的绑定2C2和PKCαC2/cPLA2C2混合动力

最近使用FDPB方法对C2结构域与磷脂膜的关联进行了计算研究，从而深入了解了C2结构域/膜相互作用的物理基础。例如，Ca相互作用的静电自由能2+-与含有33 mol%酸性脂质（2:1 PC/PS）的膜结合的Syt1C2A预计为-5.6 kcal/mol，并且高度依赖于溶液的离子强度(表1,图10B)与实验测量值吻合良好(格伯等., 2001;张等., 1998;纳列夫斯基等., 2001)并表明静电相互作用足以介导显著的膜结合。然而，Ca2+-绑定cPLA2在类似方向上，由于静电斥力，C2与2:1 PC/PS的相互作用具有正的静电自由能（+0.6 kcal/mol）(表1，+0.6千卡，图10C). 钙的良好静电相互作用自由能2+-结合态Syt1C2A与Ca的不利静电自由能形成巨大对比2+-绑定cPLA2C2位于膜表面，并强调Syt1C2A（主要是有利的静电）和cPLA之间的机械差异2C2（主要是疏水性）与膜的相互作用。为了确定静电对本研究中考虑的其他C2结构域的膜结合的贡献，使用PKCαC2和混合C2结构域分子模型以及在0.1 M KCl中的2:1 PC/PS膜进行了FDPB计算(表1，数字10安,第10页、和10华氏度). 钙离子膜相互作用的静电自由能2+-结合PKCαC2为-4.5 kcal/mol，与Ca相似2+-结合Syt1C2A（-5.6 kcal/mol）(Murray和Honig，2002年). 相反，PKCαC2/cPLA膜相互作用的静电自由能2C2和Syt1C2A/cPLA2含有所有三种CBL的C2杂种分别为-0.5和0.0 kcal/mol，这让人想起cPLA经历的排斥静电相互作用2C2.因此，与Syt1C2A或PKCαC2不同，但与cPLA类似2C2，静电吸引对杂交种膜结合的贡献可以忽略不计，膜结合很可能是由于疏水相互作用(表1).

讨论

通过比较野生型和突变或杂交C2结构域之间的时空易位模式，我们能够关联cPLA的结构特征2具有Ca的C2结构域2+-依赖性靶向高尔基体和内质网。有趣的是，cPLA之间的拓扑差异2C2和Syt1C2A或PKCαC2结构域被发现相对不重要，因为我们能够在I型（Syt1C2A和PKCαC1）和II型（cPLA）之间自由交换同源结构2C2）C2域。这里使用的共成像方法允许我们在生理环境中的相同条件下直接比较任何两个结构域的易位，从而为细胞器形态、[Ca的振幅和动力学中的细胞间异质性提供“内置”控制2+]我增加。双成像方法也使我们能够很容易地看到突变和杂交结构域靶向的细微或明显变化。

C2结构域靶向质膜

质膜的内叶是一个平台，在这个平台上，许多信号复合物形成，以响应不同的细胞信号，包括[Ca的增加2+]我我们在此证明C2结构域将PKCα特异性靶向富含PIP的质膜区域2这与最近的报告一致，即PKCαC2β3和4链中的赖氨酸残基特异性结合PIP2在体外(科尔巴兰·加西亚（Corbalán-García et）其他。，2003). 然而，β3-4链区域在靶向中的主要作用值得怀疑，因为尽管PKCαC2/cPLA2C2杂交结构域具有完整的PKCαC2β3-4链，它们不能靶向PIP2-质膜的丰富区域。因为许多报道表明PKCαC2与PS的特异性结合在膜相互作用中很重要(维达格尔等., 1999;科内萨·扎莫拉等., 2001;奥乔亚等., 2002)，还需要进一步的工作来区分非特异性静电的作用和PKCαC2与内叶PS或PIP之间的特异性相互作用2膜靶向。

与PKCαC2结构域相反，Syt1C2A结构域在[Ca2+]我信号。此处观察到孤立的Syt1C2A定位于富含PIP的区域2与Syt1C2A与含有PIP的脂质体结合的观察结果一致2和非特异性结合含有阴离子磷脂的膜(张等., 1998;Murray和Honig，2002年). 另一方面，我们发现Syt1C2A表现出双相时空靶向模式，次要靶点是TGN，但不是紧密相关的膜结构域，这表明膜特异性决定簇，无论是脂质还是蛋白质，都有助于Syt1C2A-膜结合。TGN的靶向可能是由于蛋白质相互作用(查普曼等., 1995;邵等., 1997;Sugita和Sudhof，2000年). 例如，Syt1C2A与Ca中syntaxin 1a的N末端区域结合2+-依赖方式(查普曼等., 1995;邵等., 1997)和突触蛋白6，与突触蛋白1a的N末端区域具有同源性(米苏拉等., 2002)发现于TGN(博克等., 1997). 或者，靶向TGN的Syt1C2A可能涉及特定磷脂相互作用、静电和疏水力的更复杂的相互作用。例如，通过使用磷脂酰肌醇-4-磷酸适配器蛋白1 PH结构域作为探针，磷脂酰肌糖醇-4-磷酸酯已被鉴定为MDCK细胞中TGN的组成部分（Evans，未发表的观察结果；道勒牌汽车等., 2000;巴拉和瓦尔奈，2002年)虽然Syt1C2A与膜的结合本质上主要是静电作用，但一些报告表明，Syt1C2A的CBL3可以渗透到膜的脂核中，尽管没有cPLA那么深2(蔡等., 1998;查普曼和戴维斯，1998年;弗雷泽等., 2003). 也许静电和疏水力共同调节Syt1C2A与膜的相互作用。鉴于PKCαC2和Syt1C2A之间的生化和静电相似性，令人惊讶的是观察到靶向模式的差异，这可能代表了这些结构域之间膜相互作用模式的根本差异。

针对高尔基和ER的C2域

细胞内靶向[Ca的C2结构域2+]我信号已经过研究，cPLA2C2结构域的独特之处在于它只针对细胞膜。这并不完全出乎意料，因为靶向ER和核膜可能促进cPLA的偶联2环氧化酶和5-脂氧合酶，代谢cPLA产生的AA的酶2分别位于内质网和核膜(Funk，2001年).

cPLA的靶向2高尔基体、内质网和核膜非常特异。我们之前已经报道过中国人民解放军2高尔基体易位对BFA治疗敏感，在诺康唑治疗的高尔基体“微层”可见易位，cPLA2与golgin 97，a共同定位顺式-高尔基标记和GT，中间标记和反式-高尔基标记（Evans等.,2001,2003). 我们扩展了这些观察结果，在这里报告了解放军2C2未能与TGN实现实质上的协同定位(图2，D-I). TGN38与cPLA并列定位2C2与TGN38在高尔基体池标记物GalNAc转移酶II上的定位在PtK中非常相似2单元格(凯勒等., 2001). 如果cPLA2靶向性需要特定的蛋白质或脂质决定簇，这些决定簇可能不存在于TGN膜中。

Syt1C2A/cPLA的观察结果2C2混合忠实地再现了cPLA2C2靶向性表明CBL在高尔基球/ER靶向性中的重要作用。较高[Ca2+]e（电子）与cPLA相比，杂交易位需要2C2与显著降低的Ca一致2+Syt1C2A/cPLA的亲和力2C2混合与cPLA的比较2C2与脂质体结合，可能是由于Ca的几何结构不正确2+-配位残基(格伯等., 2001). 选择PKCαC2结构域来制造杂种是因为，像cPLA一样2C2结合两个Ca2+与cPLA有显著同源性2C2位于核心区域。这些杂种包含交换环，其残基比Syt1C2A/cPLA中的类似交换小2到9个2C2混合动力（图​（图7B7亿和​和8B）。8B类). PKCαC2/cPLA2只有交换CBL1的C2杂种即使在[Ca2+]e（电子）被提升到非常高的水平（我们未公布的数据），可能是由于无法结合Ca2+与Syt1C2A/cPLA的情况一样2仅含CBL3或CBLs1和2的C2混合体(格伯等., 2001). 然而，添加cPLA2C2 CBLs 1和3对PKCαC2产生高尔基体靶向性，但也需要较高的[Ca2+]e（电子）.钙亲和力较低2+CBL1.3杂种的原因可能是缺乏钙2+配位残基N65，位于cPLA的CBL2中2指挥与控制(佩里西奇等., 1998;徐等., 1998). CBL 1.3混合动力车可在高[Ca时行驶至ER2+]e（电子）与我们的结果一致，我们的结果表明cPLA2C2在低[Ca时优先转运到高尔基体2+]我(埃文斯等., 2001). CBL 1.2.3杂种在不增加[Ca的情况下易位到高尔基体和内质网2+]e（电子），再次表明CBL2对[Ca很重要2+]我结合，但不涉及靶向高尔基体和内质网膜。这些结果表明，CBL足以用于高尔基体/ER靶向。反向混合C2结构域，其中PKCαC2 CBL融合到cPLA2C2主干未能瞄准高尔基球/ER，表明cPLA2C2 CBL既必要又充分，在cPLA的其余部分没有其他高尔基体/ER靶向决定因素2C2域（Evans，未发表的观察结果）。类似地，我们发现简单地替换PKCαC2 CBLs 1和3末端的疏水残基并不能将PKCα的靶向模式改变为类似于cPLA的模式2指挥与控制。

静电等电位分布定性地表明钙的结合2+PKCαC2和Syt1C2A依赖于静电力，FDPB计算表明，相互作用的静电自由能有利于PKCαC1和Syt1C2 A与含有阴离子脂质的膜的静电相互作用(Murray和Honig，2002年). 这与cPLA获得的FDPB结果形成了鲜明对比2C2和Syt1C2A/cPLA2C2和PKCαC2/cPLA2C2杂交，这表明在所有模拟条件下，这些畴与膜之间相互作用的静电自由能都是不利的(Murray和Honig，2002年). 因此，cPLA的结合2C2和膜上的杂交C2结构域很可能依赖于钙结合促进的疏水相互作用2+通过中和带负电荷的Ca，降低了作为膜渗透功能的相互作用自由能2+-结合残基(图10C)从而允许膜渗透。

本研究的结果有助于理解靶向高尔基体和内质网膜所需的结构元素和静电变化。有人认为cPLA易位2C2到内膜是由于PC的分布(斯塔赫林等., 2003). 然而，一项对CHO细胞不同膜室中脂质含量的研究表明，高尔基体和质膜中PC含量相当丰富，占总磷脂的百分比(Gkantiragas公司等., 2001). 我们发现cPLA的目标2中国仓鼠卵巢细胞中的C2与MDCK细胞中观察到的C2相同（Evans，未发表的观察结果）。这些观察结果表明，这些膜中的其他因素可能在cPLA中起作用2C2靶向，这得到了[Ca2+]我cPLA所需2活细胞中C2膜的结合比体外与PC囊泡结合的报道低一个数量级。以前的报告表明，PIP2在激活cPLA中起作用2(Leslie和Channon，1990年;莫索尔等., 1998)最近的一份报告表明，cPLA中的残留物2催化域结合PIP2(Six和Dennis，2003年). 然而，在我们的结果中，我们没有发现C2域靶向富含PIP区域的证据2由FP标记的PLCδ确定1PH域定位。然而，谷胱甘肽的高分辨率研究S公司-传输标签PLCδ1PH结构域只显示了PIP的一小部分2在高尔基堆栈和ER(瓦特等., 2002)，表明少量PIP2可能在解放军中发挥作用2激活，但不是瞄准。神经酰胺是高尔基体的一种成分，已被证明能与cPLA结合2C2域并增加cPLA的比例2钙增加时与膜结合2+可能是通过改变膜中的磷脂组织(佐藤等., 1999;Kitatani公司等., 2000;胡维勒等., 2001). 一些蛋白质已被证明与cPLA相互作用2体外C2，包括膜联蛋白(巴克兰和威尔顿，1998年;索利托等., 1998)，波形蛋白(中谷等., 2000)和PLIP(谢里丹等., 2001)但他们在目标定位中的作用尚不明确。进一步的研究将旨在确定高尔基体中有助于cPLA的脂质或蛋白质成分2瞄准。

除了在AA生成中的作用外，cPLA的一个有趣作用2可能是膜重塑，这对膜运输很重要。最近的许多研究都牵涉到解放军2构成膜贩运活动(舒克龙等., 2000;棕色等., 2003). 然而，大多数报告都牵涉到钙非依赖性解放军2异构体和因为cPLA2仅在[Ca增加后出现在膜上2+]我，这将不是监管构成性贩运的好人选。另一方面，解放军2可能在应对[Ca2+]我信号，尽管还没有研究调查这种可能性。

补充材料

MBC视频：

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院资助HL-61378和HL-34303（给C.C.L.）、国家个人研究服务奖（HL10507）、国家犹太医学和研究中心阿伦森奖学金（给J.H.E.）以及国家卫生研究所资助GM-66147（给D.M.）的支持。

笔记

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。细胞10.1091/mbc。E03-05-0338。文章和出版日期可在www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E03-05-0338号.

使用的缩写：BFA，brefeldin A；中国解放军2，胞浆磷脂酶A2; 荧光蛋白；GT，β1,4半乳糖基转移酶；IONO，离子霉素；磷脂酰胆碱；PH、pleckstrin同源性；项目实施计划2磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸；PS，磷脂酰丝氨酸；Syt1C2A、synaptotagmin I C2A。

V⃞本文的在线版本包含一些数字的视频。在线版本位于网址：www.molbiolcell.org.

工具书类

  • Almholt，K.、Arkhammar，P.O.、Thastrup，O.和Tullin，S.（1999）。蛋白激酶Cα-绿色荧光蛋白杂交物易位和细胞内钙浓度的同步可视化。生物化学。J。 337, 211-218.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Arcaro，A.、Volinia，S.、Zvelebil，M.J、Stein，R.、Watton，S.J.、Layton，M.J.、Gout，I.、Ahmadi，K.、Downward，J.和Waterfield，M.D.（1998年）。人磷脂酰肌醇3-激酶C2β，钙和C2结构域在酶活性中的作用。生物学杂志。化学。 273, 33082-33090. [公共医学][谷歌学者]
  • Balla，T.和Varnai，P.（2002年）。用GFP融合蛋白模块可视化细胞磷脂池。科学的Stke:信号转导知识环境.PL3。[公共医学]
  • Ben-Tal，N.、Honig，B.、Miller，C.和McLaughlin，S.（1997年）。蛋白质与膜的静电结合。鱼腥草毒素和磷脂囊泡的理论预测和实验结果。生物物理学。J。 73, 1717-1727.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ben-Tal，N.、Honig，B.、Peitzsch，R.M.、Denisov，G.和McLaughlin，S.（1996年）。碱性小肽与酸性脂质膜的结合：理论模型和实验结果。生物物理学。J。 71, 561-575.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Berman，H.M.、Westbrook，J.、Feng，Z.、Gilliland，G.、Bhat，T.N.、Weissig，H.、Shindyalov，I.N.和Bourne，P.E.（2000年）。蛋白质数据库。核酸研究。 28, 235-242.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bittova，L.、Sumandea，M.和Cho，W.（1999年）。胞浆型磷脂酶A C2结构域的结构与功能研究2.生物学杂志。化学。 274, 9665-9672. [公共医学][谷歌学者]
  • Bock，J.B.、Klumperman，J.、Davanger，S.和Scheller，R.H.（1997年）。Syntaxin 6在反高尔基网络囊泡运输中发挥作用。分子生物学。单元格 8, 1261-1271.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bolsover，S.R.、Gomez-Fernandez，J.C.和Corbalan-Garcia，S.（2003）。钙的作用2+/蛋白激酶Cα向质膜移位中C2结构域的磷脂酰丝氨酸结合区。生物学杂志。化学。 278, 10282-10290. [公共医学][谷歌学者]
  • Brooks，B.R.、Bruccoleri，R.E.、Olafson，B.D.、States，D.J.、Swaminathan，S.和Karplus，M.（1983）。CHARMM：一个用于大分子能量、最小化和动力学计算的程序。J.公司。化学。 4, 187-217.[谷歌学者]
  • Brown，W.J.、Chambers，K.和Doody，A.（2003年）。磷脂酶A2（解放军2)膜运输中的酶：膜形状和功能的介质。交通 4, 214-221. [公共医学][谷歌学者]
  • Buckland，A.G.和Wilton，D.C.（1998年）。人细胞溶质磷脂酶A的抑制作用2人类annexin V。生物化学。J。 329, 369-372.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chae，Y.K.、Abildgaard，F.、Chapman，E.R.和Markley，J.L.（1998年）。核磁共振波谱显示突触结合蛋白I C2A结构域环2和环3上的脂质结合脊。生物学杂志。化学。 273, 25659-25663. [公共医学][谷歌学者]
  • Chapman，E.R.和Davis，A.F.（1998年）。钙的直接相互作用2+-突触球蛋白与脂质双层的结合环。生物学杂志。化学。 273, 13995-14001. [公共医学][谷歌学者]
  • Chapman，E.R.、Hanson，P.I.、An，S.和Jahn，R.（1995）。钙2+调节突触结合蛋白和突触蛋白1之间的相互作用。生物学杂志。化学。 270, 23667-23671. [公共医学][谷歌学者]
  • Chapman，E.R.和Jahn，R.（1994年）。突触蛋白细胞质区与膜的钙依赖性相互作用。单个C2-homologous域的自治功能。生物学杂志。化学。 269, 5735-5741. [公共医学][谷歌学者]
  • Chege，N.W.和Pfeffer，S.R.（1990年）。高尔基复合体的划分：brefeldin-A区分了反高尔基池和反高尔基网络。细胞生物学杂志。 111, 893-899.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Choukroun，G.J.、Marshansky，V.、Gustafson，C.E.、McKee，M.、Hajjar，R.J.、Rosenzweig，A.、Brown，D.和Bonventre，J.V.（2000年）。胞浆磷脂酶A2调节高尔基体结构并调节细胞内膜蛋白的运输。临床杂志。投资。 106, 983-993.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Conesa-Zamora，P.、Lopez-Andreo，M.J.、Gomez-Fernandez，J.C.和Corbalan-Garcia，S.（2001）。C2结构域中磷脂酰丝氨酸结合位点的鉴定对PKCα活化和体内细胞定位很重要。生物化学 40, 13898-13905. [公共医学][谷歌学者]
  • 科尔巴兰·加西亚（Corbalán-García，S.）、加西亚·加西亚（Garcáa，J.）、罗德里格斯·阿尔法罗（Rodríguez-Alfaro，J.a.）和哥梅斯·费尔南德斯（Gómez-Fernández，J.C.）（2003年）。一个新的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸结合位点位于蛋白激酶Cα的C2结构域。生物学杂志。化学。 278, 4972-4980. [公共医学][谷歌学者]
  • Corbalán-García，S.、Rodríguez-Alfaro，J.a.和Gómez-Fernández，J.C.（1999）。测定蛋白激酶CαC2结构域的钙结合位点，这些钙结合位点对其向质膜的转运至关重要。生物化学。J。 337, 513-521.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Davletov，B.、Perisic，O.和Williams，R.L.（1998年）。钙依赖性膜渗透是胞浆磷脂酶a C2结构域的标志2而突触球蛋白的C2A结构域静电结合膜。生物学杂志。化学。 273, 19093-19096. [公共医学][谷歌学者]
  • Davletov，B.A.和Sudhof，T.C.（1993）。synaptotagmin I的单个C2结构域足以产生高亲和力的Ca2+/磷脂结合。生物学杂志。化学。 268, 26386-26390. [公共医学][谷歌学者]
  • Dessen，A.、Tang，J.、Schmidt，H.、Stahl，M.、Clark，J.D.、Seehra，J.和Somers，W.S.（1999）。人细胞溶质磷脂酶A的晶体结构2揭示了一种新颖的拓扑结构和催化机理。单元格 97, 349-360. [公共医学][谷歌学者]
  • Dowler，S.、Currie，R.A.、Campbell，D.G.、Deak，M.、Kular，G.、Downes，C.P.和Alessi，D.R.（2000）。具有新的磷酸肌醇结合特异性的含有pleckstring同源结构域的蛋白质的鉴定。生物化学。J。 351, 19-31.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ellenberg，J.、Siggia，E.D.、Moreira，J.E.、Smith，C.L.、Presley，J.F.、Worman，H.J.和Lippincott-Schwartz，J.（1997）。活细胞中的核膜动力学和重组：在间期和有丝分裂中靶向内核膜蛋白。细胞生物学杂志。 138, 1193-1206.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Evans，J.H.、Fergus，D.J.和Leslie，C.C.（2003）。胞浆磷脂酶A的调节2易位。高级酶调节。 43, 229-244. [公共医学][谷歌学者]
  • Evans，J.H.、Spencer，D.M.、Zweifach，A.和Leslie，C.C.（2001）。细胞内钙信号调节胞浆磷脂酶A2转移到内膜。生物学杂志。化学。 276, 30150-30160. [公共医学][谷歌学者]
  • Frazier，A.A.、Roller，C.R.、Havelka，J.J.、Hinderliter，A.和Cafeso，D.S.（2003）。通过定点定向自旋标记确定突触结合蛋白I C2A结构域的膜结合方向和位置。生物化学 42, 96-105. [公共医学][谷歌学者]
  • Frazier，A.A.、Wisner，M.A.、Malmberg，N.J.、Victor，K.G.、Fanucci，G.E.、Nalefski，E.A.、Falke，J.J.和Cafeso，D.S.（2002年）。cPLA C2结构域的膜取向和位置2通过定点自旋标记。生物化学 41, 6282-6292. [公共医学][谷歌学者]
  • Fricker，M.、Hollinshed，M.，White，N.和Vaux，D.（1997年）。许多哺乳动物细胞类型的间期核含有深的、动态的、管状膜结合的核膜内陷。细胞生物学杂志。 136, 531-544.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Funk，C.D.（2001年）。前列腺素和白三烯：类二十烷生物学进展。科学类 294, 1871-1875. [公共医学][谷歌学者]
  • Geppert，M.、Goda，Y.、Hammer，R.E.、Li，C.、Rosahl，T.W.、Stevens，C.F.和Sudhof，T.C.（1994）。突触结合蛋白I：一种主要的钙2+中央突触释放传送器的传感器。单元格 79, 717-727. [公共医学][谷歌学者]
  • Gerber，S.H.、Rizo，J.和Sudhof，T.C.（2001）。突触素和磷脂酶A C2结构域的顶环2控制功能特异性。生物学杂志。化学。 276, 32288-32292. [公共医学][谷歌学者]
  • Gijón，M.A.、Spencer，D.M.、Kaiser，A.L.和Leslie，C.C.（1999）。磷酸化位点和C2结构域在胞浆磷脂酶A调控中的作用2.细胞生物学杂志。 145, 1219-1232.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gkantiragas，I.、Brugger，B.、Stuven，E.、Kaloyanova，D.、Li，X.Y.、Lohr，K.、Lottspeich，F.、Wieland，F.T.和Helms，J.B.（2001年）。高尔基复合体中富含鞘氨醇的微域。分子生物学。单元格 12, 1819-1833.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Glover，S.、de Carvalho，M.S.、Bayburt，T.、Jonas，M.、Chi，E.、Leslie，C.C.和Gelb，M.H.（1995）。85-kDa磷脂酶A的转运2钙离子载体或IgE/抗原刺激的大鼠嗜碱性白血病细胞的胞浆到核膜。生物学杂志。化学。 270, 15359-15367. [公共医学][谷歌学者]
  • Griesbeck，O.、Baird，G.S.、Campbell，R.E.、Zacharias，D.A.和Tsien，R.Y.（2001）。降低黄色荧光蛋白的环境敏感性。机制和应用。生物学杂志。化学。 276, 29188-29194. [公共医学][谷歌学者]
  • Hirabayashi，T.、Kume，K.、Hirose，K.、Yokomizo，T.、Iino，M.、Itoh，H.和Shimizu，T.（1999）。细胞内钙的临界持续时间2+持续易位和激活胞质磷脂酶A所需的反应2.生物学杂志。化学。 274, 5163-5169. [公共医学][谷歌学者]
  • Hixon，M.S.、Ball，A.和Gelb，M.H.（1998年）。细胞溶质Ⅳ型磷脂酶A的钙依赖和非钙依赖界面结合及催化作用2.生物化学 37, 8516-8526. [公共医学][谷歌学者]
  • Huwiler，A.、Johansen，B.、Skarstad，A.和Pfeilschifter，J.（2001）。神经酰胺与胞浆磷脂酶A的CaLB结构域结合2促进其膜对接和花生四烯酸释放。美国财务会计准则委员会J。 15, 7-9. [公共医学][谷歌学者]
  • Itoh，T.和Takenawa，T.（2002年）。磷脂酰肌醇结合域：细胞内信号的时间和空间调节功能单位。细胞信号。 14, 733-743. [公共医学][谷歌学者]
  • Keller，P.、Toomre，D.、Diaz，E.、White，J.和Simons，K.（2001年）。活细胞高尔基后分类和贩运的多色成像。自然细胞生物学。 三, 140-149. [公共医学][谷歌学者]
  • Kitatani，K.、Oka，T.、Murata，T.，Hayama，M.、Akiba，S.和Sato，T.（2000）。神经酰胺促进磷脂酶A钙依赖性移位2从细胞质到血小板膜。架构（architecture）。生物化学。生物物理学。 382, 296-302. [公共医学][谷歌学者]
  • Kohout，S.C.、Corbalan-Garcia，S.、Torrecillas，A.、Gomez-Fernandez，J.C.和Falke，J.J.（2002）。蛋白激酶C亚型α、β和γ的C2域：膜结合状态的激活参数和钙化学计量学。生物化学 41, 11411-11424.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Leslie，C.C.和Channon，J.Y.（1990年）。阴离子磷脂刺激花生酰水解磷脂酶A2并降低钙的活性需求。生物化学。生物物理学。Acta公司 1045, 261-270. [公共医学][谷歌学者]
  • Lippincott-Schwartz，J.、Yuan，L.C.、Bonifacino，J.S.和Klausner，R.D.（1989）。在用布雷费尔丁A处理的细胞中，高尔基体蛋白迅速重新分布到内质网：高尔基体到内质网上膜循环的证据。单元格 56, 801-813.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Maasch，C.、Wagner，S.、Lindschau，C.、Alexander，G.、Buchner，K.、Gollasch，M.、Luft，F.C.和Haller，H.（2000）。蛋白激酶Cα靶向性受细胞内游离钙浓度的时空变化调节2+]我.美国财务会计准则委员会J。 14, 1653-1663. [公共医学][谷歌学者]
  • Mineo，C.、Ying，Y.S.、Chapline，C.、Jaken，S.和Anderson，R.G.（1998年）。蛋白激酶Cα靶向小窝。细胞生物学杂志。 141, 601-610.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Misura，K.M.、Bock，J.B.、Gonzalez，L.C.，Jr.、Scheller，R.H.和Weis，W.I.（2002）。突触蛋白6（SNAP-25 C同源物）氨基末端结构域的三维结构。程序。国家。阿卡德。科学。美国 99, 9184-9189.[谷歌学者]
  • Mosior，M.，Six，D.A.和Dennis，E.A.（1998年）。IV组细胞溶质磷脂酶A2与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸结合具有高亲和力和特异性，导致活性显著增加。生物学杂志。化学。 273, 2184-2191. [公共医学][谷歌学者]
  • Murray，D.、Hermida-Matsumoto，L.、Buser，C.A.、Tsang，J.、Sigal，C.T.、Ben-Tal，N.、Honig，B.、Resh，M.D.和McLaughlin，S.（1998年）。静电学与锶的膜结合：理论与实验。生物化学 37, 2145-2159. [公共医学][谷歌学者]
  • Murray，D.和Honig，B.（2002年）。C2域膜靶向的静电控制。分子电池 9, 145-154. [公共医学][谷歌学者]
  • Nakatani，Y.、Tanioka，T.、Sunaga，S.、Murakami，M.和Kudo，I.（2000年）。与胞浆磷脂酶a C2结构域功能相互作用的细胞蛋白的鉴定2阿尔法。生物学杂志。化学。 275, 1161-1168. [公共医学][谷歌学者]
  • Nalefski，E.A.和Falke，J.J.（1996年）。C2域钙结合基序：结构和功能多样性。蛋白质科学。 5, 2375-2390.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nalefski，E.A.和Falke，J.J.（1998年）。膜对接面在Ca上的位置2+-胞质磷脂酶A的活化C2结构域2.生物化学 37, 17642-17650. [公共医学][谷歌学者]
  • Nalefski，E.A.和Newton，A.C.（2001年）。C2结构域介导的蛋白激酶CβII的膜结合动力学。生物化学 40, 13216-13229. [公共医学][谷歌学者]
  • Nalefski，E.A.、Slazas，M.M.和Falke，J.J.（1997）。钙2+-膜对接C2结构域的信号传导周期。生物化学 36, 12011-12018. [公共医学][谷歌学者]
  • Nalefski，E.A.、Sultzman，L.A.、Martin，D.M.、Kriz，R.W.、Towler，P.S.、Knopf，J.L.和Clark，J.D.（1994年）。细胞溶质磷脂酶A两个功能不同的结构域的描述2，一种调节性钙2+-依赖性脂质结合域和钙2+-独立催化域。生物学杂志。化学。 269, 18239-18249. [公共医学][谷歌学者]
  • Nalefski，E.A.、Wisner，M.A.、Chen，J.Z.、Sprang，S.R.、Fukuda，M.、Mikoshiba，K.和Falke，J.J.（2001）。来自不同Ca的C2结构域2+信号通路表现出功能和机制的多样性。生物化学 40, 3089-3100.[谷歌学者]
  • Nicholls，A.、Sharp，K.A.和Honig，B.（1991年）。蛋白质折叠和缔合：从碳氢化合物的界面和热力学性质中获得的见解。蛋白质 11, 281-296. [公共医学][谷歌学者]
  • Nishiki，T.，Kamata，Y.，Nemoto，Y.、Omori，A.、Ito，T.、Takahashi，M.和Kozaki，S.（1994年）。大鼠脑突触体B型肉毒梭菌神经毒素蛋白受体的鉴定。生物学杂志。化学。 269, 10498-10503. [公共医学][谷歌学者]
  • Novick，P.和Zerial，M.（1997年）。囊泡转运中Rab蛋白的多样性。货币。操作。细胞生物学。 9, 496-504. [公共医学][谷歌学者]
  • Oancea，E.和Meyer，T.（1998年）。蛋白激酶C作为解码钙和二酰甘油信号的分子机器。单元格 95, 307-318. [公共医学][谷歌学者]
  • Ochoa，W.F.、Corbalan-Garcia，S.、Eritja，R.、Rodriguez-Alfaro，J.A.、Gomez-Fernandez，J.C.、Fita，I.和Verdaguer，N.（2002年）。蛋白激酶Calpha C2结构域复合体晶体结构中阴离子磷脂和钙离子的额外结合位点。分子生物学杂志。 320, 277-291. [公共医学][谷歌学者]
  • Perisic，O.、Fong，S.、Lynch，D.E.、Bycroft，M.和Williams，R.L.（1998年）。胞浆磷脂酶a钙磷脂结合域的晶体结构2.生物学杂志。化学。 273, 1596-1604. [公共医学][谷歌学者]
  • Perisic，O.、Paterson，H.F.、Mosedale，G.、Lara-González，S.和Williams，R.L.（1999）。从胞浆磷脂酶A定位磷脂结合表面和C2结构域的易位决定簇2.生物学杂志。化学。 274, 14979-14987. [公共医学][谷歌学者]
  • Rizo，J.和Sudhof，T.C.（1998年）。通用Ca的C2-域、结构和功能2+-绑定域。生物学杂志。化学。 273, 15879-15882. [公共医学][谷歌学者]
  • Sali，A.和Blundell，T.L.（1993年）。通过满足空间约束进行比较蛋白质建模。分子生物学杂志。 234, 779-815. [公共医学][谷歌学者]
  • Sato，T.、Kageura，T.、Hashizume，T.、Hayama，M.、Kitatani，K.和Akiba，S.（1999年）。磷脂酶A神经酰胺刺激2通过与磷脂酶C启动的兔血小板信号通路相关的机制激活。生物化学杂志。 125, 96-102. [公共医学][谷歌学者]
  • Schiavo，G.、Gu，Q.M.、Prestwich，G.D.、Sollner，T.H.和Rothman，J.E.（1996年）。磷酸肌醇与突触素结合特异性的钙依赖性转换。程序。国家。阿卡德。科学。美国 93, 13327-13332.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Schievella，A.R.、Regier，M.K.、Smith，W.L.和Lin，L.-L.（1995）。钙介导的胞浆磷脂酶A移位2到核膜和内质网。生物学杂志。化学。 270, 30749-30754. [公共医学][谷歌学者]
  • Sciaky，N.、Presley，J.、Smith，C.、Zaal，K.J.、Cole，N.、Moreira，J.E.、Terasaki，M.、Siggia，E.和Lippincott Schwartz，J.（1997）。在活细胞中观察到高尔基管交通和布雷菲尔丁A的作用。细胞生物学杂志。 139, 1137-1155.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shao，X.、Fernandez，I.、Sudhof，T.C.和Rizo，J.（1998）。钙的溶液结构2+-游离钙2+-synaptotagmin I的结合C2A结构域：钙是否2+诱导构象变化？生物化学 37, 16106-16115. [公共医学][谷歌学者]
  • Shao，X.、Li，C.、Fernandez，I.、Zhang，X.，Sudhof，T.C.和Rizo，J.（1997）。突触结合蛋白与突触结合素的相互作用：C2结构域作为Ca2+-独立静电开关。神经元 18, 133-142. [公共医学][谷歌学者]
  • Sharp，K.A.和Honig，B.H.（1990年）。用非线性泊松-玻尔兹曼方程计算静电总能量。《物理学杂志》。化学。 94, 7684-7692.[谷歌学者]
  • Sheridan，A.M.、Force，T.、Yoon，H.J.、O'Leary，E.、Choukroun，G.、Taheri，M.R.和Bonbentre，J.V.（2001年）。PLIP是Tip60的一种新的剪接变体，与第IV组胞浆磷脂酶a相互作用2诱导细胞凋亡，并增强前列腺素的生成。分子细胞生物学。 21, 4470-4481.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shindyalov，I.N.和Bourne，P.E.（1998年）。通过最优路径的增量组合扩展（CE）进行蛋白质结构比对。蛋白质工程。 11, 739-747. [公共医学][谷歌学者]
  • Six，D.A.和Dennis，E.A.（2003年）。必需钙2+-IVA组胞浆磷脂酶A的独立作用2用于界面活性的C2结构域。生物学杂志。化学。[公共医学]
  • Solito，E.、Raguenes-Nicol，C.、de Coupade，C.、Bisagni-Faure，A.和Russo-Marie，F.（1998）。缺乏内源性膜联蛋白1的U937细胞显示PLA增加2活动。英国药理学杂志。 124, 1675-1683.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stahelin，R.V.、Rafter，J.D.、Das，S.和Cho，W.（2003）。蛋白激酶C-α和IVa族胞浆磷脂酶A C2结构域亚细胞差异定位的分子基础2.生物学杂志。化学。 278, 12452-12460. [公共医学][谷歌学者]
  • Stauffer，T.P.、Ahn，S.和Meyer，T.（1998）。受体诱导的质膜PtdIns（4，5）P的瞬时还原2活细胞中监测的浓度。货币。生物。 8, 343-346. [公共医学][谷歌学者]
  • Sudhof，T.C.和Rizo，J.（1996年）。突触结合蛋白：调节膜交通的C2域蛋白质。神经元 17, 379-388. [公共医学][谷歌学者]
  • Sugita，S.和Sudhof，T.C.（2000年）。钙的特异性2+-突触蛋白C2A结构域介导的依赖性蛋白质相互作用。生物化学 39, 2940-2949. [公共医学][谷歌学者]
  • Sutton，R.B.、Davletov，B.A.、Berghuis，A.M.、Sudhof，T.C.和Sprang，S.R.（1995）。突触结合蛋白I第一个C2结构域的结构：一种新的钙2+/磷脂结合褶皱。单元格 80, 929-938. [公共医学][谷歌学者]
  • Teruel，M.N.和Meyer，T.（2000年）。信号蛋白的转位和可逆定位：信号转导的动态前景。单元格 103, 181-184. [公共医学][谷歌学者]
  • Teruel，M.N.和Meyer，T.（2002年）。钙敏感蛋白模块受体触发膜移位的平行单细胞监测。科学类 295, 1910-1912. [公共医学][谷歌学者]
  • Varnai，P.和Balla，T.（1998年）。结合pleckstrin同源结构域的磷脂酰肌醇的可视化：钙和激动剂诱导的动态变化及其与肌的关系-[三H] 肌醇标记的磷脂酰肌醇池。细胞生物学杂志。 143, 501-510.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Verdaguer，N.、Corbalan-Garcia，S.、Ochoa，W.F.、Fita，I.和Gomez-Fernandez，J.C.（1999）。钙2+将蛋白激酶Cα的C2膜结合域直接桥接到磷脂酰丝氨酸。EMBO J。 18, 6329-6338.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Watt，S.A.、Kular，G.、Fleming，I.N.、Downes，C.P.和Lucocq，J.M.（2002年）。利用磷脂酶C delta1的pleckstrin同源结构域对磷脂酰肌醇4,5-二磷酸进行亚细胞定位。生物化学。J。 363, 657-666.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xu，G.-Y.、McDonagh，T.、Hsiang Ai，Y.、Nalefski，E.A.、Clark，J.D.和Cumming，D.A.（1998年）。胞浆磷脂酶A C2结构域的溶液结构和膜相互作用2.分子生物学杂志。 280, 485-500. [公共医学][谷歌学者]
  • Zhang，X.、Rizo，J.和Sudhof，T.C.（1998年）。突触素ⅠC2A结构域与磷脂结合的机制。生物化学 37, 12395-12403. [公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会