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EMBO J。2000年11月1日；19(21): 5720–5728.
数字对象标识：10.1093/emboj/19.21.5720号
预防性维修识别码：项目经理305793
PMID：11060023

LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜

Kabeya由纪子，1 Noboru水岛，1,2 上野隆，三 山本昭一，4 高叶纪彦（Takayoshi Kirisako），1,5 野田毅，1,5 Eiki Kominami公司，三 Ohsumi吉诺里，1,5和吉森田松（Tamotsu Yoshimori）1,5,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

关于哺乳动物细胞自噬体膜的蛋白质成分知之甚少。在这里，我们证明大鼠微管相关蛋白1轻链3（LC3）是酵母自噬所必需的Apg8p的同源物，与加工后的自噬体膜相关。两种形式的LC3，称为LC3-I和-II，在不同的细胞中翻译后产生。LC3-I是细胞溶质，而LC3-II是膜结合的。从饥饿大鼠肝脏制备的自噬空泡部分富含LC3-II。LC3的免疫电镜显示，除了细胞质标记外，还对自噬体膜进行了特异性标记。LC3-II在自噬体内外均存在。突变分析表明，LC3-I是通过从新合成的LC3中去除C末端22个氨基酸，然后将LC3-I的一部分转化为LC3-II而形成的。LC3-II的数量与自噬体形成的程度相关。LC3-II是第一个与自噬体膜特异相关的哺乳动物蛋白。

关键词：APG/自噬体/自噬菌体/哺乳动物同源物/蛋白质裂解

介绍

蛋白质降解和合成对细胞的正常活动至关重要。为了降解细胞内蛋白质，所有真核细胞都有两个主要机制，即泛素-蛋白酶体系统和自噬。自噬是饥饿、分化和正常生长控制期间生存的一个关键生理过程，并可能通过细胞大分子和细胞器的周转在各种其他细胞功能中发挥许多作用。它被定义为将细胞质蛋白质或甚至整个细胞器隔离到溶酶体/液泡（有关综述，请参阅Seglen和Bohley，1992年;邓恩，1994;布洛马特等., 1997;Klinsky和Ohsumi，1999年). 自噬的初始步骤是由单个隔离膜包围细胞的细胞质和细胞器部分。膜囊边缘相互融合形成闭合的双层膜结构，称为自噬体或未成熟自噬空泡（AVi）。最后，自噬体与溶酶体融合成为自溶体或降解自噬空泡（AVd）。在AVd室中，隔离的内容物被溶酶体水解酶降解。在这两种途径的早期阶段，已经观察到自噬和内体运输之间的趋同(图兹等., 1990;利乌等., 1997). 尽管自噬是一种构成性细胞事件，但在某些情况下，如营养或血清饥饿、激素刺激和药物治疗，自噬会增强。

虽然对动物（包括人类）自噬的形态和调控进行了广泛的研究，但对其过程的分子机制却知之甚少。为了鉴定参与自噬的蛋白质，我们分离出自噬缺陷的酵母突变体(Tsukada和Ohsumi，1993年). 我们确定了13个APG公司自噬所必需的基因及其产物的特征(Klinsky和Ohsumi，1999年). 我们还通过搜索表达序列标签（EST）数据库发现，哺乳动物中大多数Apg蛋白都有相关蛋白，这意味着自噬的分子基础在酵母和人类之间可能是保守的。事实上，我们发现了Apg12p（hApg12）与Apg5p（hApg5）的人类同源物的独特共价修饰(水岛等人，1998年b)，相当于我们之前报道的酵母Apg12p–Apg5p结合系统，该系统对自噬至关重要(水岛等人，1998年a). 此外，Liang等人（1999）最近显示，人类Apg6p同源物beclin 1促进了人类乳腺癌MCF7细胞的自噬。为了阐明动物自噬的分子机制，我们对Apg同源物进行了系统表征。

在这里，我们分析了大鼠微管相关蛋白1轻链3（LC3）的细胞内定位和加工。LC3最初被鉴定为一种与大鼠脑微管相关蛋白1A和1B共同纯化的蛋白质(Mann和Hammarback，1994年). 它显示了28%的氨基酸与Apg8/Aut7p的同源性，这对酵母自噬至关重要(梁等., 1999). 我们最近对酵母中Apg8/Aut7p的研究表明，该蛋白在自噬体的形成中起着关键作用(基里萨科等., 1999). 我们在细胞中发现了两种形式的LC3分子。我们认为一种是细胞质形式，并被加工成与自噬体膜相关的另一种形式。据我们所知，LC3是第一个定位于自噬体膜的哺乳动物蛋白。

结果

存在两种形式的LC3，显示出不同的亚细胞分布

在使用针对与大鼠LC3的N末端区域相对应的合成肽的抗体进行免疫印迹分析时，我们在包括大鼠大脑在内的各种细胞的裂解液中检测到LC3作为18和16 kDa的两条带（图1A、 左侧车道），PC12单元（图1A、 右车道）和HeLa单元（图1B） ●●●●。与丰富的18kDa分子相比，16kDa的分子量因细胞而异，在大脑中处于较低水平（图1A、 左车道）。这可能解释了以下事实：第一份关于LC3的报告的作者仅描述了大鼠脑提取物中的18kDa带(Mann和Hammarback，1994年). 当抗原肽与抗体一起过量添加时，未观察到18和16 kDa带。针对全长重组LC3分子的抗体也能识别相同的条带（数据未显示）。因此，我们得出结论，16kDa带是抗体特异性结合的LC3相关蛋白。此外，通过标记的LC3 cDNA的表达揭示了两条与两个内源性LC3相似的条带（图6，lane 3），这意味着18和16kDa条带都来自相同的mRNA。LC3的18和16KDa形式分别称为LC3-I和LC3-II。

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图1。细胞内不同位置产生并发现两种形式的LC3。(A类)用抗LC3多肽抗体对大鼠脑（左车道）和PC12细胞（右车道）的裂解液进行免疫印迹分析。(B类)用饥饿的HeLa细胞（T）制备的细胞匀浆通过10万离心分离成上清液（S）和颗粒（P）克使用LC3、醛缩酶（细胞溶质标记物）和转铁蛋白受体（膜蛋白标记物）抗体通过免疫印迹分析这些组分。分别在（A）和（B）中使用15%和12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。

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图6。LC3的翻译后处理。(A类)LC3及其同源物的C末端片段的氨基酸序列比对。与LC3相同的残留物用黑色阴影表示。雷诺数，褐家鼠; Hs、，智人; 理科，酿酒酵母; 在，拟南芥; 总工程师，秀丽隐杆线虫; 磅，双色拉克里亚从EST克隆（au96a10.y1）推导出HsLC3的序列。(B类)（C）中使用的蛋白质的结构。显示了N端的Myc表位标签、C端的HA表位标签和假设的裂解位点Gly120残基。建造LC3G120A型，LC3中引入了一个单点突变，导致氨基酸在120位从甘氨酸替换为丙氨酸。建造LC3ΔC22，22个C末端残基被PCR删除。生命周期3ΔC22、G120A也通过LC3的定点突变产生ΔC22ΔC22突变体仅在N-teminus用Myc表位标记。(C类)HeLa细胞瞬时转染Myc-LC3-HA（1-3和13-15道）、Myc-LC3G120A型-HA（4-6车道和16-18车道）、Myc-LC3ΔC22（7–9车道）或Myc-LC3ΔC22、G120A（10–12车道）。细胞被标记为[35S] 甲硫氨酸/半胱氨酸4分钟，并在37°C下追赶0、6和90分钟。细胞裂解物用抗Myc表位抗体（1-12道）或抗HA表位抗体进行免疫沉淀（13-18道），免疫沉淀用SDS-PAGE和生物图像分析仪进行分析。

接下来，我们通过亚细胞分离研究LC3-I和-II的细胞内分布。将HeLa细胞匀浆超速离心，并通过免疫印迹分析检查所得上清液和颗粒。图1B显示LC3-I和-II之间的分布存在明显差异。前者在上清液中回收，而后者仅在颗粒部分中回收。颗粒的LC3-II可以用1%Triton X-100溶解，但不能用3 M尿素、2 M NaCl或0.1 M碳酸盐（pH 11.5）溶解（数据未显示），这表明它与膜紧密结合。细胞中表达的Myc-tagged LC3-I和-II也分别是细胞溶质和粒化的（数据未显示）。这些结果表明，LC3-II与膜室相关，而LC3-I位于细胞质中。对于在血清和氨基酸缺失条件下培养1.5小时并诱导自噬的细胞，我们发现LC3-II的数量明显增加（图1B） ●●●●。

LC3-II定位于自噬体膜

为了进一步阐明LC3-II的定位，我们从饥饿大鼠的肝匀浆中制备了各种细胞器组分。对LC3细胞器的免疫印迹分析显示，LC3-II在自噬液泡部分特异性富集（图2，车道4）。致密溶酶体部分也在一定程度上含有LC3-II（图2，车道5）。虽然LC3-I的数量太少，无法在图中看到2长时间接触后，仅在细胞溶质部分检测到（数据未显示）。这些结果表明，LC3-II定位于参与自噬途径的细胞膜。

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图2。LC3-II富含自噬液泡组分。如材料和方法所述，从饥饿的大鼠肝脏中获得亚细胞器组分。使用LC3抗体（顶部面板）和每个细胞器标记抗体（底部六个面板）对每个部分进行免疫印迹分析。PC12，PC12细胞的总裂解物，作为LC3-I和LC3-II位置的对照；饥饿大鼠肝脏的总裂解物；PNS，其核后上清液。线粒体的标记物是CPS（氨甲酰磷酸合成酶1）；内体/溶酶体的lgp 120；质膜Na/K-ATP酶；胞浆醛缩酶；内质网的核黄素；高尔基复合体的58K蛋白。

然后，我们着手通过冰冻切片的免疫金标记来确定LC3的精确亚细胞分布。用融合绿色荧光蛋白（GFP–LC3）的LC3转染HeLa细胞18 h，并在10 mg/ml辣根过氧化物酶（HRP）存在下培养8 h，以填充内吞途径。该程序便于区分自噬体和自溶体，因为后者可以获得内吞HRP，而前者则不能。然后在饥饿条件下培养细胞1小时。我们通过免疫印迹分析确认了转染细胞中GFP–LC3的I型和II型的产生（数据未显示）。使用抗GFP抗体对细胞进行免疫金和银增强方法。显示GFP–LC3存在的银增强金颗粒与自噬体膜特异性相关（图三A–E，箭头）。结合细胞分馏数据，这些结果使我们相信，与膜相关的分子是LC3-II，而细胞质中的分子则是LC3-I。通过HRP染色从自噬体中识别出自溶体（图​（图3，三，箭头），也贴有标签；然而，与自噬体相比，金颗粒较少。金颗粒的密度计算为36.4±20.5/µm的自噬体膜和2.5±2.0的自溶体膜。在未转染细胞的切片中观察到颗粒结合很少（数据未显示）。我们还通过使用HeLa细胞（数据未显示）和小鼠胚胎干细胞（ES）中的抗LC3抗体，观察到内源性LC3在自噬体和细胞质中的定位（图三F和G），在饥饿条件下培养。研究清楚地表明，代表内源性LC3的金颗粒与ES细胞中典型自噬体的膜特异性相关。因此，与LC3-I的细胞质分布相反，LC3-II很可能主要定位在自噬体的膜上，一些定位在自溶体中。

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图3。除了细胞质外，LC3还与自噬体膜相关。(A类——E类)转染GFP–LC3的HeLa细胞在37°C和10 mg/ml HRP存在下培养8 h，并在37°CHanks溶液中培养60 min。细胞固定并用DAB染色以检测内吞HRP。然后，用抗GFP抗体的银增强免疫金电镜检查GFP–LC3在细胞中的定位。（A–E）中的箭头和箭头分别表示自噬体和含有HRP的自溶体。棒材，1µm。(F类和G公司)ES细胞在37°C的Hanks溶液中培养1h并固定。用抗LC3抗体的银增强免疫金电子显微镜检查内源性LC3的定位。开放箭头和闭合箭头分别表示LC3与自噬体的内膜和外膜相关。棒材，1µm。

通过荧光显微镜比较LC3和溶酶体标记物的分布，支持LC3-II靶区不是溶酶体而是自噬体。用巴非霉素A处理转染GFP–LC3的HeLa细胞1在饥饿的条件下。该药物是空泡型质子ATP酶的抑制剂，据报道，该酶在饥饿条件下通过抑制自噬体和溶酶体之间的融合而积累自噬小体(山本等., 1998). 因此，用巴非霉素A治疗1确保自噬体和溶酶体的分离。使用针对溶酶体膜蛋白lamp1的抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。如预期，GFP–LC3显示点状染色（图4A） 除了漫反射模式（图中不清楚4，由于照片对比度高）。点状染色可能代表LC3-II，与lamp1没有共同定位（图4B） ，排除了LC3-II是溶酶体蛋白以及其在自噬空泡中的出现是由于自噬体和溶酶体融合的可能性。

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图4。GFP–LC3不与巴非霉素a中溶酶体蛋白lamp1共定位1-在饥饿条件下处理的细胞。将转染GFP–LC3的HeLa细胞在37°C下在含有0.1µM巴非霉素A的Hanks溶液中培养90分钟1用lamp1抗体和罗丹明结合的第二抗体进行免疫荧光共聚焦显微镜分析。(A类)GFP–LC3标签(B类)lamp1染色和(C类)将显示同一字段的合并图像。棒材，10µm。

为了建立LC3-II定位的拓扑结构，我们进行了蛋白酶保护试验。用蛋白酶E处理饥饿大鼠肝脏制备的自噬空泡部分以消化外周蛋白，并用抗LC3或抗甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）抗体进行免疫印迹，BHMT是一种已知的细胞溶质酶，是自噬体的载体(上野等., 1999). 经蛋白酶处理后，BHMT的所有p44亚单位都完好无损，而半数以上的LC3-II被降解（图5，车道2）。在Triton X-100存在的情况下，两种蛋白质几乎完全降解（图5，车道3）。这强调了LC3-II至少部分存在于自噬体表面；换句话说，蛋白质不仅仅是隔间的隔离成分。与此一致，图中的免疫电子显微照片三F和G显示LC3-II附着于自噬体的外膜和内膜（分别为填充箭头和开放箭头）。

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图5。LC3-II分布于孤立的自噬液泡内外。从饥饿的大鼠肝脏中获得自噬空泡部分，并在0°C下在0.8 mg/ml蛋白酶E不存在（第1道）或存在（第2道和第3道）的情况下培养40分钟。在3号通道中，还增加了0.2%的Triton X-100。用LC3或BHMT抗体对样本进行免疫印迹，以检测LC3-II和BHMT的p44亚单位（自噬性货物标记物）。

LC3-II是通过包括C端解理在内的多步骤加工形成的

确定了LC3的两种形式后，我们解决了它们的形成问题。为此，我们构建了两端标记的LC3：在N端具有Myc表位，在C端具有血凝素（HA）表位（Myc-LC3-HA；图6B） ●●●●。用Myc-LC3-HA转染HeLa细胞后，用脉冲标记[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸持续4分钟，然后按指示时间追赶。用针对Myc表位或HA表位的抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE进行分析（图6C） ●●●●。虽然在脉冲标记后立即检测到30和25 kDa的两条谱带（图6C、 车道1），30 kDa波段在6分钟的短追逐期内消失（车道2），25 kDa频带保持不变。在90分钟的追逐中，除了25kDa波段（3号道）之外，又出现了一个新的23kDa频带。由于这些25和23 kDa条带也在免疫印迹中观察到（数据未显示），因此它们被认为分别对应于LC3-I和-II。有趣的是，尽管30 kDa带被针对Myc和HA表位的抗体识别，但25和23 kDa条带仅与针对Myc表位的抗原反应（1–3和13–15道）。因此，30 kDa带可能代表全长分子，而LC3-I和-II缺乏C末端区域。

条带的出现顺序表明，LC3被翻译为全长前体（在本实验中指定为proLC3:30kDa条带），并依次加工成LC3-I和-II。这与LC3-I可以形成的事实一致在体外通过混合HeLa细胞裂解物和在大肠杆菌，与proLC3的大小相同（未显示数据）。为了进一步研究这种可能性并表征LC3的加工过程，我们构建了几个突变体LC3。当比较LC3的C末端序列与在人类和其他生物体中发现的Apg8/Aut7p同源物的C末端顺序时，我们注意到有一个高度保守的区域对应于LC3的Tyr113–Gly120（图6A） ●●●●。此外，保守甘氨酸下游的序列彼此完全不同。因此，我们怀疑LC3-I和LC3-II是由proLC3的Gly120和Thr121之间的裂解产生的。基于这个想法，我们引入了一个突变，导致Gly120转变为Ala（Myc-LC3G120A型-HA）（图6B） ●●●●。突变体LC3的主要形式是proLC3（图6C、 车道4-6和16-18）。分子不太稳定，在90分钟的追逐中（第6车道）下降。尽管检测到少量的LC3-I，但根本没有形成LC3-II。该结果强烈表明，Gly120变为丙氨酸会影响前LC3 C末端区域的切割，这是形成LC3-I和-II所必需的。接下来，我们检查了Myc-LC3ΔC22，缺失Gly120下游序列的缺失突变体（图6C、 车道7–9）。在突变体的脉冲追踪中未检测到proLC3。然而，LC3-I和LC3-II是在正常动力学条件下形成的，这证实了Gly120和Thr121之间发生了解理。LC3的行为ΔC22也同意LC3-II源自LC3-I，而不是直接源自proLC3的观点。此外，如果Myc-LC3中的Gly120变为丙氨酸ΔC22（Myc-LC3）ΔC22、G120A)，形成LC3-I，但未形成LC3-II。因此，我们得出结论，Gly120对于从proLC3形成LC3-I以及随后LC3-I转化为LC3-II非常重要。

LC3-II的数量与自噬体形成的程度相关

如上所述，我们发现在饥饿条件下培养90分钟的HeLa细胞中LC3-II的数量显著增加，从而诱导自噬（图7A、 比较车道2和车道1）。在ES、HEK293和中国仓鼠卵巢细胞中也观察到LC3-II的饥饿依赖性增加（数据未显示）。这种效果可以通过将细胞带回完整的培养基中来逆转（图7A、 车道8和9）。为了探讨这一现象与自噬体形成之间的关系，我们将LC3-II的增加率与饥饿诱导的自噬体形成率进行了比较。两者都具有可比性（图7B） ●●●●。通过间接免疫荧光显微镜观察饥饿对HeLa细胞表达Myc-LC3的影响。饥饿90分钟显著增加点状图案的点，可能代表LC3-II分布，无论是数量还是荧光强度（图7C） ●●●●。

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图7。LC3-II数量的变化对应于自噬体的形成。(A类)HeLa细胞在37°C下，在含有以下试剂的10%FCS/DMEM（通道1）或Hanks溶液（通道2-6）中培养90分钟：1%二甲基亚砜（对照，通道1和2）；0.1µM沃特曼（车道3）；10 mM 3-甲基腺嘌呤（车道4）；0.1µM巴非霉素A1（车道5）；和50µM长春碱（车道6）。在另一个实验中，HeLa细胞在37°C的温度下在10%FCS/DMEM（第7道）或Hanks溶液（第8道）中培养120分钟，然后在10%FCS/DMEM中再培养120分钟（第9道）。孵育后，用LC3抗体对细胞进行裂解和免疫印迹分析。显示了用重复的盘子重复两次的代表性实验。(B类)将HeLa细胞（带实线的开放正方形）和ES细胞（带虚线的开放圆形）在Hanks溶液中孵育指定的时间，并使用针对LC3的抗体对部分细胞进行免疫印迹。通过密度测定法（左纵轴）定量LC3-II的量。剩余的HeLa细胞用2.5%戊二醛固定，用于常规电子显微镜。在电子显微照片上测量自噬体/自溶体切片的面积，并以条形（右纵轴）表示。(C类)瞬时转染Myc-LC3的HeLa细胞在10%FCS/DMEM（a）或Hanks溶液（b）中37°C培养90分钟。使用抗Myc表位抗体和罗丹明结合二级抗体将细胞固定并渗透用于免疫荧光共聚焦显微镜。棒材，20µm。

结果促使我们测试已知影响自噬的药物治疗。用沃特曼或3-甲基腺嘌呤治疗完全阻断了LC3-II的饥饿依赖性增量（图7A、 车道2、3和4）。研究表明，沃特曼通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性来防止自噬体的形成(布洛马特等., 1997). 3-甲基腺嘌呤通常被用作自噬体形成的特异性抑制剂(Seglen和Bohley，1992年)也抑制磷脂酰肌醇3-激酶(布洛马特等., 1997). 与这些试剂相比，巴非霉素A治疗1在饥饿条件下，自噬体积累导致LC3-II（通道5）的额外大幅增加。长春碱是一种微管解聚试剂，可抑制自噬体和溶酶体之间的融合，巴非霉素a也是如此1(霍伊维克等., 1986)，显示出类似的效果（第6车道）。综上所述，可以想象LC3-II的数量与自噬体的形成有密切关系。

讨论

自噬是由膜室的形成和融合组成的动态过程。因此，有必要鉴定自噬膜的蛋白质成分，以揭示这种现象的机制。我们在这里描述了LC3-II，LC3的加工形式，通过亚细胞分馏和免疫金电子显微镜定位于自噬体和自溶体。这与LC3的酵母同源物Apg8/Aut7p的分布一致。我们通过免疫金电子显微镜在自噬体、自噬小体和自噬过程中的中间结构中定位Apg8/Aut7p(基里萨科等., 1999).

基于本研究的结果，我们提出翻译后修饰产生LC3-I和LC3-II。初始步骤必须是C末端区域的解理。Gly120对后一个反应很重要。Gly120下游的氨基酸片段Tyr121–Leu142应该被裂解，尽管这还需要确认。有趣的是，之前有报道称，牛病毒性腹泻病毒的细胞致病性突变体的基因组中含有一个相当于LC3的插入序列ΔC22，缺少Tyr121–Leu142(Meyers等人，1998年). 事实上，在插入LC3的Gly120之后，从病毒中翻译的多聚蛋白立即被裂解ΔC22通过某些细胞蛋白酶与我们的假设非常一致。最近，我们发现Apg8/Aut7p也在Gly116之后立即被裂解，对应于LC3中的Gly120，这种蛋白水解过程是自噬体形成所必需的(Kirisako等人，2000年). 此外，我们确认在另一个Apg8/Aut7p同源物中也发生了类似的切割，即16 kDa的Golgi相关ATP酶增强子（GATE16:DDBJ/EMBL/GenBank登录号AF20262）(Sagiv等人，2000年)/神经节苷脂表达因子-2（GEF2:DDBJ/EMBL/GenBank登录号。AB003515号). 因此，C末端区域的处理在Apg8/Aut7p家族中可能是常见的，因为它们的功能。此外，我们可以生成LC3-I在体外在细胞提取物存在下从重组LC3中提取（数据未显示）。反应对N个-乙基马来酰亚胺，意味着参与胞浆半胱氨酸蛋白酶。我们将酵母Apg4p鉴定为细胞半胱氨酸蛋白酶裂解Apg8/Aut7p(Kirisako等人，2000年). 我们还鉴定了Apg4p的人类同源物，目前正在对其进行鉴定。目前尚不清楚卵裂是否足以形成LC3-I。虽然LC3-II可能直接由proLC3产生，但基于两个突变体LC3的行为，我们支持LC3-I转化为LC3-II的模型ΔC22和LC3ΔC22， G120A型在这两种情况下，尽管Gly120显然很重要，但LC3-II形成过程中所涉及的修饰性质仍不明确。这种修饰应该使LC3-II具有类似膜蛋白的特性。目前尚不清楚LC3-II是在其与膜结合之前还是在LC3-I靶向膜之后形成的。

在无血清和氨基酸培养基中的细胞培养导致LC3-II的数量增加。在这些条件下诱导自噬，我们发现LC3-II增加率与自噬体形成率之间存在相关性。两种自噬体形成抑制剂Wortmann和3-甲基腺嘌呤抑制了饥饿诱导的LC3-II增加，而积聚自噬小体的药物，如长春碱和巴非霉素A1，具有较强的LC3 II增加作用，与饥饿效应具有协同作用。因此，LC3-II的数量可能反映了自噬体的数量。如果是这样，LC3-II可以定义自噬体的数量，也就是说，它可以调节隔室的形成。在自噬的后期，LC3-II可能降解或再循环回细胞溶质LC3-I，因为自溶体的标记少于自噬体，在免疫电子显微镜下，金颗粒代表LC3-II（标记密度分别为2.5±2.0/µm和36.4±20.5/µm膜）。

当我们开始分析LC3时，只有一种哺乳动物蛋白与酵母Apg8/Aut7p同源。然而，另外两个同源物GATE16和γ-氨基丁酸A受体相关蛋白（GABARAP；王等., 1999)后来在哺乳动物中发现。据报道，GATE16是高尔基体内膜转运的调节剂(萨吉夫等., 2000)众所周知，GABARAP与GABA绑定A类受体(王等., 1999). 因此，LC3似乎是唯一在自噬中发挥作用的基因。由于酵母中没有Apg8/Aut7p的同源物，它可能是Apg8/Aut7p家族的祖先，包括LC3、GABARAP和GATE16。动物体内LC3家族的多样化成员可能已经进化到在细胞内的不同位置具有特殊功能。

以前的研究表明，纯化的重组LC3与纯化的微管蛋白组装的微管结合在体外(Mann和Hammarback，1994年). 这一特征启发我们考虑微管可能参与LC3在自噬中的功能。我们还怀疑长春碱诱导的LC3-II增加可归因于微管的破坏。然而，其他微管解聚试剂，如诺卡唑和秋水仙碱，并不影响LC3-II的量（数据未显示），排除了这种可能性。Lang等人（1998）此前提出，Apg8/Aut7p通过另一种蛋白Apg4/Aut2p附着于微管，从而在自噬体的运输中发挥作用。相反，我们提供了诺康唑处理过的酵母中正常自噬的证据(Kirisako等人，1999年). 虽然微管对酵母中的Apg8/Aut7p功能或自噬并不需要，但哺乳动物细胞中的情况可能不同：微管可能有助于哺乳动物细胞中自噬体的有效运输，哺乳动物细胞比酵母细胞大得多。证实LC3-II与微管的关联体内，我们用抗微管蛋白抗体对表达GFP–LC3的细胞进行复染。大多数染色的点并没有与微管网同时定位，尽管有些似乎已经这样做了（我们未发表的观察结果）。LC3-II通过将自噬体与微管连接而发挥作用的假说仍有可能被验证。

LC3-II是自噬体的良好标记物，迄今为止，自噬体能由形态学而非分子组成来定义。LC3的详细特征将为我们提供线索，以解决哺乳动物自噬的许多问题。我们现在正处于对这种神秘的细胞器即自噬体进行分子解剖的起点。

材料和方法

DNA构建

用LC3-s5引物（5′-CCGGAATTCCGTCCGAGAAGACCTT-3′）和LC3rc3引物（5'-TTCGAATTCGCACCATACATAAACGAG-3′）从大鼠脑总cDNA中通过RT-PCR获得编码大鼠LC3的cDNA。然后将其子克隆到生态真核表达载体pCI-neo的RI位点（普罗米加，威斯康星州麦迪逊）。LC3的C末端缺失突变体LC3ΔC22，编码氨基酸1–120，由PCR产生。120位甘氨酸点突变为LC3和LC3的丙氨酸ΔC22（LC3G120A型和LC3ΔC22、G120A也通过基于PCR-的定点突变产生。DNA测序证实了突变。通过分别在第一个蛋氨酸密码子之后和终止密码子之前插入标签，获得3×Myc和3×HA表位标签构建物。为了获得pGFP-LC3，将LC3 cDNA插入Bgl公司II和生态GFP融合蛋白表达载体pEGFP-C1的RI位点（克隆泰克实验室）。为了表达GST融合蛋白，通过将LC3 cDNA亚克隆到巴姆HI和生态pGEX-2T的RI位点（Pharmacia）。

抗体

根据前面描述的方法，通过兔子免疫制备抗LC3 N端14个氨基酸和额外半胱氨酸对应的合成肽（PSDRPFKQRRSFADC）的抗LC3抗体(吉森等., 1990)并在固定化肽-Sepharose柱上纯化亲和力。如前所述，在兔子体内也产生了针对重组LC3的抗体(史密斯和约翰逊，1988)并在固定化GST–LC3–谷胱甘肽–Sepharose柱上纯化。还使用了以下抗体：小鼠单克隆抗人转铁蛋白受体抗体N-2(吉森等., 1988)、兔抗大鼠醛缩酶血清(科米纳米等., 1983)，兔抗鼠氨甲酰磷酸合成酶1血清(Lusty，1978年)，兔抗大鼠核糖蛋白1血清(克里马乌多等., 1987)、兔抗鼠lgp120血清（日本福山福山大学H.Tsuji博士捐赠）、兔多克隆抗鼠Na/K-ATP酶抗体（日本大阪关西医科大学K.Omori博士捐赠），小鼠单克隆抗高尔基58k抗体（Sigma）、兔抗GFP多克隆抗体（加州帕洛阿尔托Clontech实验室），小鼠单克隆抗人lamp-1抗体（由马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学T.August博士捐赠）、兔多克隆抗大鼠BHMT抗体(上野等., 1999)、小鼠单克隆抗Myc表位抗体9E10（BabCo）、小鼠单抗抗HA表位抗体16B12（BabCo）、氟乐灵罗丹明标记山羊抗兔抗体（Amersham Pharmacia Biotech）和HRP-结合山羊抗小鼠和兔IgG抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunor Research Laboratories）。

细胞培养、转染和免疫印迹

细胞培养的培养基和试剂来自纽约大岛生命科技公司。HeLa细胞和神经内分泌PC12细胞在含有10%胎牛血清（FCS）、5 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中生长。ES细胞在含有20%FCS、0.1mM非必需氨基酸溶液、1µM 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、1000U/ml白血病抑制因子（LIF）、5U/ml青霉素和50µg/ml链霉素的DMEM中生长。使用FuGENE 6试剂（Roche Molecular Biochemicals）将指示的cDNA转染处于亚融合状态的HeLa细胞。转染后18小时对细胞进行分析。使用空pCI-neo表达载体进行模拟转染。对于免疫印迹，蛋白质通过SDS-PAGE（12或15%凝胶）分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上。根据前面描述的方法用抗体处理膜(吉森等., 2000).

细胞饥饿和药物治疗

为了获得饥饿条件，用Hanks溶液清洗HeLa细胞三次，并在37°C的相同溶液中培养1–1.5小时。药物治疗是通过将细胞培养在含有50µM沃特曼（Sigma）、10 mM 3-甲基腺嘌呤（Sigma-）、100 nM巴非霉素A的Hanks溶液中实现的1（日本大阪Wako Pure Chemical Industries，Ltd）或50µM长春碱（Sigma）在37°C下保持90分钟。处理后，用在Tris缓冲盐水中的1%Triton X-100在冰上裂解细胞20分钟，并使用抗LC3抗体进行免疫印迹分析。为了检测饥饿效应的可逆性，在饥饿120分钟后，将HeLa细胞在37°C的10%FCS/DMEM中培养120分钟。

亚细胞分离

亚细胞分离以高速进行，以获得细胞溶质上清液和含有总膜的颗粒，如前所述(吉森等人，2000年). 为了进行详细分析，从饥饿的大鼠肝脏中制备了各种亚细胞器组分。按照以下程序制备光滑和粗糙的内质网膜、质膜和富含高尔基体的膜Hortsch和Meyer（1985），Hino等人（1978年）和Hubbard等人（1983年）分别为。如前所述，从注射leupeptin/E64c的大鼠肝脏制备自噬空泡膜(上野等人，1991年). 对于溶酶体，本研究使用了两种不同的制剂。由右旋糖酐注射大鼠肝脏制备的溶酶体上野等人（1991）在本研究中被指定为右旋糖酐溶酶体。另一种制剂来自正常大鼠肝脏：从饥饿大鼠肝脏中分离出的线粒体/溶酶体部分（4 ml）(上野等人，1991年)将其装入50 ml 40%Percoll中的5 mM Tes–NaOH pH 7.5和0.3 M蔗糖中，并在55000下离心克持续45分钟。将分离自离心管下半部其他膜的溶酶体混合，与等量的40%Percoll混合在5 mM Tes–NaOH（pH 7.5）和0.3 M蔗糖中，然后在55000℃下重新离心克持续45分钟。将较致密的溶酶体层混合，用4 vols 5 mM Tes–NaOH pH 7.5和0.3 M蔗糖稀释，并在12000下离心克取出Percoll 20分钟。此步骤重复两到三次。溶酶体微丸悬浮在最小体积为5 mM Tes–NaOH（pH 7.5）和0.3 M蔗糖中。这些组分被指定为致密溶酶体。根据先前的出版物，自噬液泡、右旋糖酐溶酶体和致密溶酶体的膜被分离出来(上野等人，1991年)，但省略了膜的最终碳酸盐处理。

免疫电子和免疫荧光显微镜

GFP–LC3转染的HeLa细胞在含有10 mg/ml HRP的10%FCS/DMEM中培养8 h，然后在Hanks溶液中培养1 h。如前所述，将细胞固定并用DAB染色以检测内吞HRP(吉森等., 2000). 然后对这些细胞进行预包埋银增强免疫金方法，以使用抗GFP抗体进行免疫电子显微镜检查，如前所述(吉森等., 2000). 用NIH图像软件在电子显微镜下测量金颗粒的数量和自噬体和自溶体膜上的长度。用抗LC3抗体对ES细胞进行免疫电子显微镜检查，以检测内源性LC3。

对于免疫荧光显微镜，在盖玻片上生长并用Myc标记的LC3或GFP–LC3转染的HeLa细胞在所指示的条件下培养，固定并用抗Myc表位或抗lamp1的抗体染色，如前所述(吉森等., 2000).

蛋白酶保护试验

如前所述，在含有5 mM Tes pH 7.5、0.3 M蔗糖和0.8 mg/ml蛋白酶E（Sigma）的培养基中，在0°C下培养40分钟，并加入或不加入0.2%Triton X-100(上野等., 1999). 然后用三氯乙酸沉淀样品，并使用LC3或BHMT抗体进行免疫印迹分析。

脉冲追踪实验

在35 mm培养皿中生长的HeLa细胞转染Myc-LC3-HA、Myc-LC3G120A型-HA、Myc-LC3ΔC22或Myc-LC3ΔC22、G120A用无蛋氨酸的DMEM清洗细胞，用0.2 mCi的脉冲标记[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸（NEN Life Science Products）在37°C下保持4分钟，并按照37°C指示的时间进行追踪。用1%Triton X-100在冰上磷酸盐缓冲盐水中溶解细胞，并用之前描述的针对Myc表位或HA表位的抗体进行免疫沉淀(吉森等., 2000). 在12%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上分析免疫沉淀材料，并通过生物图像分析仪BAS2000（日本东京富士胶片公司）进行可视化。

LC3-II和自噬体形成增加率的测量

HeLa细胞和ES细胞在37°C的Hanks溶液中培养指定的时间。为了确定LC3-II的数量，使用LC3抗体对部分细胞进行免疫印迹分析，并使用NIH图像软件测量LC3-II条带的密度。为了测量自噬体的形成，剩余的HeLa细胞用2.5%戊二醛固定，并按照前面描述的常规电子显微镜进行处理(吉森等., 2000). 通过NIH图像软件在电子显微镜上测量自噬体/自溶体切片的面积。

致谢

我们感谢K.Ogura博士提供GEF2 cDNA，感谢H.Tsuji博士、K.Omori博士和T.August博士提供抗体。我们感谢实验室的N.Ishihara博士和NIBB分析仪器中心分别在亚细胞分离和合成肽方面提供的卓越技术援助。我们还感谢I.Miwako博士和M.Ohashi博士的有益讨论。这项工作得到了日本教育、科学、文化和体育部科学研究拨款的支持。

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